저자는 기술 지원 아만다 Tardo, 닥터 모스 타파 Bouljihad, 스테파니 지내요, 필리, 캐롤 Coyne 박사 에린 Ribka 박사 피터 디디와 도로시 Kuebler 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01 - DK076653 및 KS에 3R01 - DK076653 - 02S1과 TNPRC RR000164의 기본 운영 부여에 의해 지원되었다.

1. 피부 생검 샘플 모음 <ol><li> 이전 피부 생검 절차, 2.5 MG / tiletamine 하이드로 클로라이드와 zolazepam 염산염 telazol 혼합물 (포트 닷지 동물 건강, 포트 다지, IA)의 kg과 intramuscularly 동물을 마취. 드러누움까지 마취의 관리에서 동물을 모니터링하고 그들의 인클로저에서 제거합니다. </li><li> 크기 40 블레이드 (Oster 전문 제품, 맥민빌, TN)와 Oster 골든 A5 싱글 속도 수의학 클리퍼를 이용 흥미 피부 영역에서 머리를 제거하고 무균 betadine 스크럽과 알코올을 교대로 준비합니다. 선택한 생검 사이트를 통해 살균 fenestrated의 드레이프를 확보. </li><li> 악기 180도는 약간의 압력으로 시계 방향과 반대 방향으로 회전하면서 생검 펀치는 피하 TI에 피부 레이어를 통해 transects까지 살균 기술을 사용하여 피부에 대해 4.0 mm Miltex 펀치 피부 생검 악기 (Miltex, 요크, PA) 장소ssue. 생검 샘플을 제거하고 집게와 피하 조직에서 무료로 피부의 가로 부분을 파악. </li><li> 십자 모양의 팔분의 삼 원형 절단 바늘 (Ethilon, Ethicon, 존슨 앤 존슨 의료 제한, 버크셔, 영국)에 연결된 3-0 나일론 봉합사로 피부 결함을 닫습니다. 모든 동물에게 게시물 수술 진통제에 대한 intramuscularly 0.01 밀리그램 / kg buprenorphine 하이드로 클로라이드 (Hospira, 레이크 포레스트, IL)를 제공합니다. </li></ol> 2. 샘플 처리 <ol><li> 만성 피부염과 건강한 컨트롤에서 피부 생검 샘플 작업은 붉은 털원숭이 원숭이. 2-3 (직경 4mm)가 각 동물에서 샘플을 생검 구합니다. </li><li> 24 시간 동안 (Z - 수정, Anatech (주), 배틀 크릭, MI) 아연 포르말린의 첫 번째 예제를 수정, ASP300 Leica 조직 프로세서 (Leica 마이크로 시스템즈 주식 회사로, 30 분 물에 세척 70 % 에탄올에 잠시 씻고, 장소 , 조직의 70 %, 80 %, 95 % 100 % 에탄올 48 오름차순 성적 탈수있다 버팔로 그로브, KS)크실렌의 두 가지 변경 사항 (피셔) 다음 각 (피셔 과학, 피츠버그, PA)를 분. </li><li> 상온에서 장기 저장을위한 파라핀 미디어 (피셔)에 삽입할 수 있습니다. 장소 이전 sectioning 20 분에 - 20oC. 로터리 마이크로톰을 (HM325, Microm 국제, 월도프, 독일)를 사용하여 6 μm의 섹션을 준비합니다. 충전 슬라이드 (피셔)와 하룻밤 60oC에서 건조 공기의 장소 섹션. hematoxylin 및 eosin (H &amp; E) 표준 방법 (아래 설명)에 얼룩. </li><li> 상온에서 30 분 2 % paraformaldehyde (USB 사, 클리블랜드, OH)에 두 번째 예제를 수정, 인산의 세 번 씻어 염분은 (PBS, Gibco - Invitrogen, Carlsbad, CA)를 30 % 자당 (피셔)의 장소, 버퍼 4 시간 그리고 OCT 냉동 매체 (사쿠라 Finetek, Torrence, CA)에 포함. 이전 sectioning 20 분 - 80oC에서 보관. 그라 이오 스탯을 (HM560, 열 과학, 칼라 마주, MI)를 사용하여 15 μm의 섹션을 준비합니다. </li></ol> 3. H &amp; E 염색법 <ol><li> 소스를 Deparaffinize백퍼센트 세 변경, 95 %의 두 가지 변경 사항 하나 80 % 변화와 증류수, 2 분 각각 세 xylenes (피셔)의 변화와 등급 ethanols 통해 rehydrate 통해 됐나요 섹션. </li><li> 한 분 hematoxylin (리차드 - 알란 과학, 칼라 마주, MI)와 얼룩과 수돗물을 실행에 간단한 세척으로하십시오. </li><li> 6 분 eosin (시그마)와 Counterstain. </li><li> 이 2 분 각각의 변화와 다음 xylenes 세 변화에 분명 3 분 각각 95 %와 절대 에탄올로 얼룩진 조직을 탈수. </li><li> H &amp; E - 스테인드 조직 섹션을 통해 Cytoseal 장착 매체를 사용하여 마운트 coverglass (리처드 - 앨런 과학). </li></ol> 4. Histopathological 평가 스팟 통계 디지털 카메라 (디지털 인스 트루먼 트의 주식, 미시간, 미국)와 40x 배율과 Leica 현미경 - H &amp; 4를 사용하여 가벼운 현미경 E - 스테인드 생검 피부 섹션을 검사합니다. 5. Immunofluorescent 안녕 -닝 <ol><li> immunofluorescent 얼룩에 대한 월 임베디드 스킨 섹션과 함께 작동합니다. 전에 얼룩에, PBS에서 20 분 트리톤 X - 100 (시그마)는 OCT를 제거하고 조직을 permeabilize하기 위해 0.1 %와 0.2 % 생선 껍질 젤라틴 (FSG, 시그마)이있는을위한 만끽해보세요. </li><li> 슬라이드를 세척 후 humidified 슬라이드 챔버에서 상온에서 1 시간 동안 PBS - FSG에 희석 10% 정상 염소 혈청 (NGS, 시그마)와 부화. </li><li> 이가와 tTG2 항체의 증착을 시각화하기 위해 1 시간 10 % NGS - PBS - FSG의 희석 방지 붉은 털원숭이 이가와 tTG2 차 항체와 슬라이드를 품어. </li><li> 10 분 PBS - FSG 다음 10 분, 위해 PBS - FSG - 트리톤 X - 100 (시그마)로 씻으십시오. </li><li> 1:1,000 희석에 알렉사 형석 fluorochrome 488 (녹색), 568 (빨간색) 또는 633 (파란색) (분자 프로브 - Invitrogen)로 태그가 보조, isotype 특정 항체와 함께 품어. 핵 DNA를 시각화하는 ToPro - 3 염료를 사용합니다. 항체 희석액으로 10 % NGS - PBS - FSG를 사용합니다. </li><li> 스테인드 조직 섹션을 탑재 방지 칭 솔루션 (시그마)를 사용합니다. </li></ol> 6. 공촛점 이미징 488 NM에서 아르곤 - 크립톤 레이저 (녹색), 568 nm의에서 크립톤 레이저 (세 가지 레이저 (해당 여기 6 라인)이 장착된 Leica TCS SP2 진정한 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (Leica, Wetzlar, 독일)와 이미징을 수행 빨간색)과 스펙트럼의 멀리 붉은쪽으로 보이는부터 기간 633 NM (파란색)에서 헬륨 - 네온 레이저. 비 분류 조직 아키텍처 평가에 대한 기록 차등 간섭 대비 (DIC) 이미지. 7. 대표 결과 tTG2와 이가 항체 모두에 의해 eTG의 긍정적인 인식의 예제는 그림에 표시됩니다. 3A. 인간 환자의 상황과 붉은 털원숭이 원숭이에서도 글루텐 감도 CD와 같은보다 DH 같은 피부염의 훨씬 낮은 유행으로 인해과 일치, 피부 생검 샘플의 대부분은 우 것으로 예상된다w tTG2 항체가 아니라 tTG2 + 이가 + 이중 긍정 세포 (그림 4)의 존재없이 긍정적인 반응. 미생물 원산지 피부염 사례를 포함하여 이러한 DH - 무관한 경우, 상피 아래에 흩어져있는 몇 가지 단일 긍정적인 이가 +는 세포를 공개하지만 tTG2과 이가 표시된 마커 (Figs. 3B 4) 사이 없습니다 스펙트럼 중복됩니다. 것입니다 따라서 histopathological 평가 (그림 2)와 다른,보다 일반적인 피부염 유발 대리인이 식별 수 없습니다 경우에만, 공촛점 다음 임상 시험 (그림 1) 시작, 제안된 테스트 절차의 순서를 유지하는 것이 중요합니다 tTG2와 이가에 대한 얼룩진 피부 biopsies의 현미경 시험은 보증됩니다. 혼자 임상 및 / 또는 histopathological 평가이 조건의 긍정적인 진단에 충분하지 않습니다. 이러한 경우에는 때 두 번 긍정적인 (tTG2 + 이가 +) 세포가 피부 용의자의 주변 지역 식별, DH 같은 피부염 진단이 발행하실 수 있습니다. 식이 글루텐 이러한 경우에는 탈퇴그리고 글루텐없는 다이어트의 관리는 피부염의 증상을 완화하기 위해 권장합니다. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 전에 EM96 짧은 꼬리 원숭이의 사타구니 지역 (A)과 후 (B) 5 주 동안식이 글루텐의 취소. 식이 글루텐의 Reintroduction는 피부염의 재현 (C)가 동시에. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 그가 전에 수집 EM96 짧은 꼬리 원숭이 피부 biopsies의 얼룩 (A)과 후 (B) 9 주 동안식이 글루텐의 취소. A :의 상피는 hyperkeratotic 세포의 두꺼운 표면 지각 degenerating의 neutrophils과 침투와 (과 상피 세포의 7-15 층) 두꺼워입니다. Neutrophils는 상피 내부에도 나타납니다 lymphocytes, 플라즈마 세포, 그리고 상부 진피에있는 adnexa 주변 histiocytes의 적당한 번호를 혼합하고 있습니다. B : 어떤 hyperkeratosis가 여전히 존재하는, 상피 두께는 상부 진피에 최소한 lymphoplasmacytic 침투와 함께 (4-7 층) 표준입니다. C : 아니요 lymphoplasmacytic 침투와 FR56 짧은 꼬리 원숭이에서 일반 복부 피부, 비교 포함되어 있습니다. 확대 20x. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 이전에 수집된 EM96 짧은 꼬리 원숭이 피부 biopsies의 공촛점 현미경 이미지 (A)과 후 (B) 9 주 동안식이 글루텐의 취소. A : 이가의 얼룩 (녹색), tTG2 (적색) 및 ToPro - 3 핵 DNA 마커 (파란색). 이가와 tTG2의 공동 지방화는 피부 papilae의 주위 노란색으로 나타납니다. B : 스킨 샘플이 9 주 후에 촬영 글루텐이없는 일부 subepithelial 이가이, (녹색) 여전히 tTG2 (적색) 및 ToPro - 3 핵 DNA 마커 (파란색) 존재하는 동안 다이어트 상피 이내에 이가를 보여줍니다 없습니다. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. </강한&gt; 동물 만성 (DH - 무관) 피부염의 증상을 전시 동안 GI24 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이 피부 biopsies의 공촛점 현미경 이미지가 수집. 이가의 얼룩은 빨간색과 ToPro - 3 핵 DNA 마커은 파란색입니다.에서는 녹색, tTG2에 tTG2 + 세포가 존재하는 상피 안에 몇 이가 + 빨간색과 녹색 마커 사이에 광범위한 스펙트럼 중첩가 본 적이있는 동안 상피 세포 아래에. <table border="1"><tbody><tr><td> 동물 태그 </td><td> 섹스 [M / F] </td><td> 나이 [년] </td><td> 임상 증상 </td><td> 플라즈마 tTG2 항체 </td><td> 다이어트 [1,2] * </td></tr><tr><td> HJ71 </td><td> F </td><td> 1.3 </td><td> 건강한 </td><td> - </td><td> 일 </td></tr><tr><td> HD13 </td><td> M </td><td> 1.4 </td><td> 건강하고, 가끔 설사 </td><td> + </td><td> 일 </td></tr><tr><td> FR56 </td><td> M </td><td> 5.4 </td><td> 만성 특발성의 설사 </td><td> - </td><td> 일 </td></tr><tr><td> EM96 </td><td> F </td><td> 5.0 </td><td> 만성 피부염 </td><td> + / - (경계선) </td><td> 1, 2 </td></tr><tr><td> GI24 </td><td> F </td><td> 4.6 </td><td> 만성 피부염 </td><td> - </td><td> 일 </td></tr></tbody></table> 표 1. TNPRC는 붉은 털원숭이 피부 biopsies를 수집 이용 원숭이 * 다이어트 1 - 일반 원숭이 차우 (글루텐 함유) 다이어트 2 - 글루텐 무료 다이어트

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	<li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+the+adaptive,+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients.">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li><li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celiac+disease:+epidemiology,+pathogenesis,+diagnosis,+and+nutritional+management.">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li><li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+transglutaminase+(TGase+3)+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis.">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li><li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet.">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li><li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques.">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li><li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+&#x03B1;-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques.">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from &#x03B1;-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li><li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celiac+disease:+from+pathogenesis+to+novel+therapies.">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li><li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response.">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li><li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis.">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

글루텐 민감도 우리의 새로 설립이 아닌 인간의 영장류 모델은 최근에식이 글루텐 5,6에 의해 트리거 장의 투자율 변화를 연구하는 데 사용되었다. 플라즈마 tTG2 항체뿐만 아니라 창자 tTG2 + 이가 + 보증금 일부 글루텐에 민감한 짧은 꼬리 원숭이에서 발견되었습니다. 우리가 최근 붉은 털원숭이 식민지에 일반 (신진 대사 / 전염성) 병인가 설립되지 수 원숭이를 특발성 피부염의 희귀한 사?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약이나 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 / 제품 코드 </td><td> 주의 </td></tr><tr><td> 반 (反) 인간 이가 FITC * </td><td> 시그마, 세인트 루이스, 미주리 </td><td> F - 5259 </td><td> 1:100 희석 작업 </td></tr><tr><td> 안티 - 인간 tTG2 </td><td> 써모 과학, 칼라 마주, MI </td><td> MS - 300 - P1ABX </td><td> 1:100 희석 작업 </td></tr><tr><td> 안티 마우스 IgG1 ** </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> A - 21124 </td><td> 1:1,000 희석 작업 </td></tr><tr><td> ToPro - 3 DNA 프로브 *** </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> T - 3605 </td><td> 1:1,000 희석 작업 </td></tr><tr><td> 포르말린 아연 (Z - 수정) </td><td> Anatech (주), 배틀 크릭, MI </td><td> 171 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> OCT 냉동 중 </td><td> 사쿠라 Finetek, Torrence, CA </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 장착 중 </td><td> 리차드 - 알란 과학, 칼라 마주, MI </td><td> 8312-4 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 담금질 용액 </td><td> 시그마, 세인트 루이스, 미주리 </td><td> P 3130 </td><td></td></tr><tr><td> Ethilon (나일론 봉합사) </td><td> Ethicon, 존슨 앤 존슨, 버크셔, 영국 </td><td> 663G </td><td></td></tr><tr><td> Miltex 펀치 피부 생검 악기 </td><td> Miltex, 요크, PA </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> 크기 40 블레이드와 Oster 골든 A5 단일 속도 수의사 클리퍼 </td><td> Oster 제품, 맥민빌, TN </td><td> 78005-050 </td><td></td></tr><tr><td> Leica 조직 프로세서 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 Inc의., 버팔로 그로브, KS </td><td> ASP300 </td><td></td></tr><tr><td> 로터리 마이크로톰 </td><td> Microm 국제 월도프, 독일 </td><td> HM325 </td><td></td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯 </td><td> 써모 과학, 칼라 마주, MI </td><td> HM560 </td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> Leica, Wetzlar, 독일 </td><td> TCS SP2 </td><td></td></tr></tbody></table> * 플루오레신 isothiocyanate tTG2 일차 항체 후 사용 ** 차 (알렉사 형석 568 - 복합) 항체 ** 염료

recognition of epidermal transglutaminase by iga and tissue transglutaminase 2 antibodies in a rare case of rhesus dermatitis

조직 transglutaminase 2 (tTG2)는 이미 부분적으로 소화식이 글루텐 예 : 글리아딘의 펩티드를 deamidates 장내 소화 효소이다. 유전자 predisposed 개인에 tTG2는 tTG2 항체와 작은 창자 벽 1,2에 자신의 직접 증착의 생산에 의해 특징 면역 응답을 트리거합니다. 이러한 항체의 존재는 복강 질환 (CD)의 주요 특징 중 하나를 구성합니다. 표피 transglutaminase (eTG)도 CD 환자의 소수에서 autoantigen로서 기능을 할 수 transglutaminase 가족의 다른 구성원입니다. 이러한 비교적 드문 경우에는, eTG는 임상적으로 피부염의 herpetiformis (DH)로 알려진 면역 반응 (피부 발진) 트리거합니다. CD 및 DH pathogenesis의 정확한 메커니즘이 잘 이해되지 않지만, 그것은 알려진 것이 tTG2와 CD와 DH 환자 3,4 모두에서 혈청 항체에 의해 인식된다 공유할 antigenic의 epitopes을 eTG. (Macaca mulatta) (표 1, 그림. 1, 2)의 피부 병변의 생검 샘플의 공촛점 현미경 시험은 영향을받는 조직을 연구하는 데 사용되었다. 한 동물 (EM96)에서 이가와 tTG2 항체 (그림 3)의 스펙트럼 중첩을 보여주되었습니다. 이중 긍정적인 tTG2의 존재가 + 이가 + 세포는 피부 용의자 주변의 깊은 표피에 집중되었다. 이것은 DH 환자 3에서 설명한 병변과 일치합니다. EM96은 글루텐 - 무료 다이어트, 피부염뿐만 아니라에 배치되었을 때 tTG2 + 이가 + 예치금가 사라진과 (Figs. 1-3) 더 이상 감지되지 않았다. 피부염은 EM96의 식단 글루텐 (표시되지 않음)의 재 도입에 따라, 그러나 등장. 관련이없는 피부염과 동물 등 다른 원숭이에서 tTG2 + 이가 + 예금은 발견되지 않았습니다. tTG2의 존재와 함께 EM96에 피부염의 글루텐 무료 다이어트에 의존 죄사함 + 이가 +의 피부에 세포가 제안자가 면역 질환, DH 같은이 조건의 개발을위한 메커니즘. 이것은 모든 비 인간 영장류에서 DH 같은 피부염의 첫 번째 보고서입니다.

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Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

피부염의 herpetiformis (DH)는 이가와 표피 transglutaminase (eTG) 사이의 면역 반응을 특징으로 만성 염증성 조건입니다. DH는 글루텐에 민감한 및 / 또는 복강 환자의 아주 작은 부분에 개발하고 있습니다. 본 연구의 결과는 DH도 idiopatic 피부염의 증상으로 붉은 털원숭이 원숭이 호스트에서 개발할 수 있음을 나타냅니다.

의 드문 경우에 이가와 조직 Transglutaminase이 항체에 의해 표피 Transglutaminase의 인식 붉은 털원숭이 피부염

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

recognition-epidermal-transglutaminase-iga-tissue-transglutaminase-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

24.4K 조회수.  Tulane National Primate Research Center. 피부염의 herpetiformis (DH)는 이가와 표피 transglutaminase (eTG) 사이의 면역 반응을 특징으로 만성 염증성 조건입니다. DH는 글루텐에 민감한 및 / 또는 복강 환자의 아주 작은 부분에 개발하고 있습니다. 본 연구의 결과는 DH도 idiopatic 피부염의 증상으로 붉은 털원숭이 원숭이 호스트에서 개발할 수 있음을 나타냅니다.

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

연구

면역학 및 감염병학

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

IgY 기술 : 폴리에틸렌 글리콜의 노른자위에서 치킨 항체의 추출 (PEG) 강수량

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

We describe an in vitro method for culturing schistosomula of the flatworm parasite Schistosoma mansoni, via the harvesting and transformation of infective cercariae from the fresh water snail intermediate host Biomphalaria glabrata.

Cercarial 변화와 체외에서</em의> 양성 Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research. 
This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&amp;#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (V&#954;) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.

카파 (Vκ)에 대한 항체 결합 특이성 빛 체인 함유 인간 (IgM의) 항체 : Polysialic 산 (PSA) 사례 연구로 NCAM에 첨부

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석<sup&gt; +</sup&gt; 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

신생아 Capsaicin 치료에 의해 유도 된 아 토 피 성 피부염의 쥐 모델에 포 름 알 데히드의 노출의 효과

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...