이 연구는 국립 BioResource 프로젝트와 협력하여 실시, 교육부, 문화, 스포츠, 과학 기술, 일본.되었습니다

실험의 전체 구조는 그림에 표시됩니다. 1. 1. 시약 준비 <ol><li> 아래의 다음과 같은 차트에 따라 100 ML 유리 병의 기본 매체 (여기에 PB1라고도 함) 확인 : <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> MM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.4 </td><td> 136.98 </td><td> 800.0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.6 </td><td> 2.68 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136.1 </td><td> 1.47 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> 나이 HPO 4 0.12 H 2 O </td><td> 358.14 </td><td> 8.04 </td><td> 288.1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 203.3 </td><td> 0.49 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><tD&gt; 포도당 </td><td> 180.2 </td><td> 5.56 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> 나의 pyruvate </td><td> 110 </td><td> 0.33 </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2 시간 2 O </td><td> 147 </td><td> 0.9 </td><td> 13.2 </td></tr><tr><td> 페니실린 G </td><td></td><td></td><td> 6.0 (약) </td></tr></tbody></table></li><li> Ficoll - 자당 (FS) 솔루션을 확인하십시오 : <ol><li> 50 ML 관에서 PB1 용액 14 ML 다음 화학 물질을 추가합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6.0 g </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 3.424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42.0 MG </td></tr></tbody></table></li><li> Ficoll 70 PB1 솔루션에 자당를 섞어 완전히 해산 때까지 잘 흔들. </li><li> 위의 완전한 해체를 확인 후, 용액의 표면에 BSA를 추가하고 그것을에서 보관BSA까지 4oC 완전히 (&gt; 4 시간 또는 야간) 해산입니다. </li></ol></li><li> 50 ML 튜브의 평균 솔루션 (EFS20)과 vitrification 솔루션 (EFS40)를 확인합니다 : <ul><li> EFS20 :​​ 20 % (V / V) 에틸렌 글리콜, 24 % (W / V) Ficoll, 그리고 BSA와 PB1에 0.4 몰 / L 자당 </li><li> EFS40 : 40 % (V / V) 에틸렌 글리콜 18 % (W / V) Ficoll, 그리고 BSA와 PB1 0.3 몰 / L * 자당 그들은 6 cryodamage에 더 민감한 때문에 * BALB / C 또는 ICR 변형에서 배아의, 0.9 몰 / L 자당으로 자당의 농도를 증가시킵니다. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 솔루션 </td><td> EFS40 솔루션 </td></tr><tr><td> 에틸렌 글리콜 </td><td> 한 ML </td><td> 이 ML </td></tr><tr><td> FS 솔루션 </td><td> 4 ML </td><td> 3 ML </td></tr></tbody></table></li><li> 0.45 μm의의 filte를 사용하여 여과하여 솔루션을 소독R. 4에서 5 ML 폴리스티렌 튜브 및 저장소에 aliquots 만들기 ° C. 그들은 약 6 개월 동안 사용할 수 있습니다. </li><li> 0.75 M의 자당 (TS1)이있는 배아 해동 솔루션의 준비 <ol><li> PB1에서 자당의 7.7 g을 (단계 1.1에서 준비) 용해 30 ML에 전체 볼륨을 가지고. 자당이 완전히 해소되기 전까지 부드럽게 흔들어하여 섞는다. </li><li> 표면 솔루션에 BSA의 90 밀리그램을 추가하고 완전히 용해 때까지 서 두십시오. </li><li> 여과하여 솔루션을 소독. </li><li> 4 ° C.에 나누어지는 및 저장 그들은 약 1 달 동안 사용할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : TS1도 상용 M2에서 준비하실 수 있습니다. <ol start="6"><li> M2에서 자당의 7.7 g을 용해 30 ML에 전체 볼륨을 가지고. </li><li> 자당이 완전히 해소되기 전까지 부드럽게 흔들어하여 섞는다. </li><li> 여과하여 솔루션을 소독. </li><li> 4oC에서 나누어지는하고 저장합니다. 그들은 약 1 달 동안 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> TS2 (해동 솔루션: 0.25 M의 자당)이있는 <ol><li> 적절하게, PB1 또는 M2 20 ML 볼륨 10 ML TS1을 희석. </li><li> 4 ° C.에 나누어지는 및 저장 그들은 약 1 달 동안 사용할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. 2 셀 마우스 태아의 Vitrification <ol><li> 자연 교배 또는 체외 수정의 기법에 의해 기존의 2 셀 마우스 배아를 준비합니다. </li><li> 나누어지는 cryotube에 50 μl EFS40. 향후, 실온에서 vitrification 절차의 나머지 부분을 수행합니다. </li><li> 35mm 또는 60mm 플라스틱 페트리 접시의 바닥에 EFS20의 나누어지는 50 μl. </li><li> 문화 매체에만 최소 금액과 모세관 유리를 사용하여 EFS20 30 배아까지 전송합니다. 2 분 타이머를 시작합니다. 참고 : 드롭의 하단에있는 장소의 배아. 이것은 배아의 효율적인 탈수를합니다. stereomicroscope에 의한 배아의 형태를 확인합니다. 그림과 같이 탈수 배아는 수축된 형태를 보여줍니다. 2A.그들은 충분히 건조되지 않은 경우, 1 개 또는 2 분 기다립니다. </li><li> 1.5 분, 솔루션만을 최소한의 금액으로 EFS20 드롭에서 배아를 선택하십시오. 단계 2.1 준비 cryotube에 EFS40에게 전송합니다. 참고 : 최상의 결과를 얻으려면, 모든 배아가 약 2 분 EFS40로 전송할 수 있도록 배아를 수확의 타이밍을 조정합니다. </li><li> 1 분 기다립니다. </li><li> 액체 질소 (후면 2)에 직접 cryotube 놔. </li></ol> 3. Vitrified 2 셀 마우스 배아를 해동 <ol><li> 해동하기 전에 복구 배아의 배아 배지 10 μl 방울 (3.13 단계 참조)와 요리를 준비합니다. 사용까지 CO 2 배양기에서 석유와 장소 접시를 커버. 참고 : 일상적인 배아의 문화에 대한 미디어가이 실험에 사용될 수 있지만, 우리는 이러한 M16 매체로서 높은 osmolarity와 미디어를 권해드립니다. </li><li> 37 ° C.에 TS1을 따뜻하게 </li><li> 얼굴 마스크와 cryogloves 쓰세요. 에선 2t을 엽니다ank와 배아를 포함하는 cryotube를 검색할 수 있습니다. </li><li> 신속하게 튜브의 상단을 열고 에선 2 폐기. 다음 단계에서 동결에서 TS1을 방지하기 위해 30 초 기다립니다. </li><li> 튜브에 TS1의 850 μl (37 ° C)를 추가하고 솔루션을 고르게 해산 때까지 부드러운 pipettings (25 초 쯤 배)의 솔루션을 혼합하는 1000ul 피펫을 사용합니다. </li><li> 플라스틱 60mm 페트리 접시 (또는 시계 유리) (그림 3A)에 관의 전체 볼륨을 전송합니다. 참고 :이 단계에서 3.14 CO 2 배양기에 배치되기 전까지는 태아가 실내 온도 (22-25 ° C)에서 처리되어야합니다. </li><li> 3 분 타이머를 시작합니다. </li><li> 배아를 포함하는 매체가 접시의 표면 (그림 3B)에 걸쳐 때까지 TS1 2 분 주변에 부드럽게 요리를 흔들. 참고 :이 TS1에게 양도 때 그들이 표면 근처에 떠 있기 때문에 태아가 아래 아래로 내려가서 도움이 될 것입니다. </li><li> 일에 TS2 세 50 μl 방울을 넣고E 요리 (그림 3C). </li><li> TS1 3 분 후 stereomicroscope에 의해 태아의 형태를 확인, 그들은 약간 수축된해야합니다. TS1의 앞부분에서 태아의 형태 (그림 2B)를 참조하고 나중에 (그림 2C). 참고 : 배아가 계속 부어있다면, 3 분 1 이상을 TS1에 보관하십시오. </li><li> 배아를 들고 TS2의 첫 번째 드롭 (그림 3D)에게 전송할 수 있습니다. 3 분 타이머를 시작합니다 </li><li> 3 분 후, 세 번째 드롭 (그림 3E)에 다음 두 번째 드롭에 배아를 전송합니다. </li><li> 3.1 단계에서 준비한 문화 매체에 배아를 전송합니다. 배아는 그림에 표시되는 모양입니다. 2D. </li><li> CO 2 배양기에 넣어 요리. 약 10 분 후, TS2에서 이월되어 자당을 씻어 문화 매체의 다음 드롭 배아를 전송할 수 있습니다. </li><li> 배아 전송까지 CO2 배양기에서 문화를 계속합니다. 참고 : 전송 엠브리해동 당일받는 여성의 oviducts에 OS. 체외에서 오랜 문화는 생쥐의 일부 변종에 태아의 가능성이 저하될 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 해동은 표 1과 2에 표시하고 배아의 생체내 개발 이후 - 체외에서. 이 프로토콜의 장점은 생쥐의 다양한 변종에 해동하고 광범위한 적용 후 태아의 높은 survivability 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 변형 </td><td> 튜브의 총 번호 </td><td> vitrified 배아 개 </td><td> 복구된 (번호 (%)) </td><td> Morphologically 정상 (번호 (%)) </td><td> blastocysts로 개발 (제 (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / CA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> 표 1. 일반적인 마우스 종자에 vitrified - 해동 배아의 체외 개발에 <table border="1"><tbody><tr><td> 배아의 상태 </td><td> 받는 여성의 번호 </td><td> 배아의 번호 전송 </td><td> 주입 사이트 (번호 (%)) </td><td> (번호 (%)) 새끼 라이브 </td></tr><tr><td> 신선한 </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vitrified </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> 표 2. C57BL/6J 마우스에 vitrified - 해동 배아의 생체내 개발에. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" /> 그림 1. 평균, vitrification 및 배아의 융해를 포함하여 실험의 전반적인 체계. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" /> 그림 2. 해동의 각 단계에서 배아의 형태. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" /> 그림 3. 배아의 절차를 해동. 모든 절차는 실온에서 수행됩니다. (A), cryotube에 TS1 (37 ° C)의 850 μl를 추가하고 플라스틱 접시에 cryotube에있는 솔루션의 전체 볼륨을 전송합니다. 이때 태아는 같은 그림에 표시된 부었습니다. 2B. (B), 부드러운 흔들림으로 접시의 표면에 걸쳐 솔루션을 펴. (C), 플라스틱 접시에 TS2 세 50 μl 방울을 넣으십시오. (D), TS2의 첫 번째 드롭에 배아를 전송합니다. 그림과 같이 3 분 후, 배아는 shurunken보세요. 2C. (E), 그들은 직렬 전송나머지 TS2로 니는 문화 매체 후 방울합니다.

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	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196&#176;+and+-269&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196&#176; and -269&#176;C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center.">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li><li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species.">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li><li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution,+without+appreciable+loss+of+viability.">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification.">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li><li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method.">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li><li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages.">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li><li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos.">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li></ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

1985 2 Rall와 Fahy로 마우스 배아 vitrification의 첫 번째 보고서 이후, 몇 가지 기술 향상은 해동 후 태아의 survivability을 증가되었습니다. 가장 성공적인 수정 중 하나 때문에 낮은 독성과 높은 막 - 투자율의 cryoprotectant으로 에틸렌 글리콜의 사용에 의해 달성되었다. 이러한 장점은 우리가 상온 4 냉동 배아를 처리할 수 있도록, 다른 vitrification 방법은 냉각기 온도에서 나눠 배아을 필요로 항상 BALB / C를 포함하여 6 생쥐의 일부 변종에 적용되지 않습니다. 첫 번째 에틸렌 글리콜 기반 vitrification은 카사이 외에 의해 개발되었습니다. 1990 5,7 인치 원래 메소드가 컨테이너와 같은 플라스틱 빨대에 최적 이었기 때문에, 우리는 약간 실험실에서보다 쉽게​​ 접근하고 물리적 피해에 더 강한 cryotubes에 대한 프로토콜을 수정합니다. 따라서, 여기에서 설명한 vitrification 방법은 응용 프로그램 수연구 모델로 마우스를 사용하여 많은 실험실로 licable. 같은 방법도 morula와 blastocyst 단계 8 쥐 배아 9시 마우스 배아 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리는 최근 cryotubes의 품질 냉동 - 해동 후 태아의 생존 속도에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 그러므로, 그것은 vitrifying 배아 (; 특정 시약 및 장비의 테이블에서 참조 예) 전에 매끄러운위한 cryotubes의 내부 표면을 조사하는 것이 필수적입니다. Vitrification 방법은 기존의 느린 냉동 방법을 통해 많은 장점을 가지고 있지만, 그들은 본질적으로 운송 목적에 대하여에 불이익을했습니다. vitrified 배아 아래 -120에서 보관해야합니다로서 ° C가 자신의 생존을 유지하기 위해, 건조 화주는 일반적으로 자신의 안전 수송을 위해 사용됩니다. 드라이 화주는 무겁고 부피가 있으며, 그들의 왕복 특히 국제 운송을위한, 비싼 수 있습니다. 우리는 지금 현재에 의해 새로운 vitrification 방법을 개발하고 있습니다어떤 vitrified 배아는 최소 7 일 10 (-80 ° C 정도) 드라이 아이스 온도에서 저장할 수 있습니다. 이 방법은 다음 세대의 vitrification해야합니다.

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 머크 Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12,657 </td><td></td></tr><tr><td> 에틸렌 글리콜 </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> 나이 HPO 4 명이 12H 2 </sUB&gt; O </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 G </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P - 4687 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 pyruvate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P - 8574 </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 중간 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2 매체 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Cryotube </td><td> 스미토모 Bakelite </td><td> MS - 4501 </td><td> &quot;극저온 약병&quot; </td></tr></table>

cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification

마우스 배아의 Cryopreservation은 생쥐의 많은 변종이 유전자 개조에 의해 생산되어 있고 숫자가 지속적으로 매년 증가하기 때문에, 생명 의학 과학을 지원하는 기술 기반입니다. 그 기술 개발은 다음 후반 1980 년대 2 개발 vitrification 방법 다음, 1970 년대 1 느린 냉동 방법으로 시작했다. 일반적으로 후자의 기술은 민첩, 단순하고, 복구 배아 높은 survivability에 유리합니다. 그러나 포함된 cryoprotectants는 매우 독성이 있으며, 이후 배아 발달에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 기술은 솔루션 4 냉각 경우에도 생쥐의 특정 변종에 적용 아니었 ° C 배아 처리하는 동안 독성 효과를 완화합니다. RIKEN BioResource 센터에서 서로 다른 유전 배경과 phenotypes와 5000 개가 넘는 마우스 변종 3을 유지하고 있으며, 따라서 우리는 vitrification 테를 최적화chnique이있는 우리는 주위 온도가 4 vitrifying 및 (또는 더 정확하게, 액화) 해동 후 높은 배아 생존의 이점과 함께, 마우스의 여러 변종의 배아를 cryopreserve 수 있습니다. 여기, 우리는 성공적으로 우리 센터에서 사용되고 있습니다 마우스 배아의 vitrification 방법을 제시한다. cryopreservation 솔루션은 배아 5 독성을 최소화하기 위해 대신 DMSO의 에틸렌 글리콜이 포함되어 있습니다. 또한 각각 Ficoll과 devitrification 및 삼투 조정 방지 자당이 포함되어 있습니다. 배아는 상온에서 처​​리하고 5 분 이내에 액체 질소로 전송할 수 있습니다. 원래 메소드가 컨테이너와 같은 플라스틱 빨대에 최적 이었기 때문에, 우리는 약간 실험실에서보다 쉽게​​ 접근하고 물리적 피해에 더 강한 cryotubes에 대한 프로토콜을 수정합니다. 그것이 중요한 ste이기 때문에 우리는 또한 자세한 vitrified 배아를 해동의 과정을 설명사는 생쥐의 효율적인 복구를 위해 P. 이 방법은 안전하고 비용 효율적인 방식으로 나중에 사용하기 위해 마우스 종자 보존이 필요 연구자 및 기술자에게 도움이 될 것입니다.

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Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

마우스 배아의 에틸렌 글리콜 기반 vitrification 방법이 설명되어 있습니다. 그것은 단순하고 낮은 배아 독성의 다른 방법에 유리하고, 따라서 근친과 유전자 - 수정된 생쥐를 포함하여 마우스의 여러 변종에 광범위하게 적용하실 수 있습니다.

에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

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30.8K 조회수.  RIKEN BioResource Center. 마우스 배아의 에틸렌 글리콜 기반 vitrification 방법이 설명되어 있습니다. 그것은 단순하고 낮은 배아 독성의 다른 방법에 유리하고, 따라서 근친과 유전자 - 수정된 생쥐를 포함하여 마우스의 여러 변종에 광범위하게 적용하실 수 있습니다.

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Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

6.5 DPC 마우스 태아의 해부

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

연구

생물학

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

E15 마우스 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

수집 및 햄스터 Oocytes 및 마우스 태아의 Cryopreservation

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

dsRNA 주입하여 RNAi 간섭에 Drosophila 태아

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Preimplantation 캐틀의 태아, 양, 그리고 염소 Cryopreservation

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

에 의한 이전 치킨 태아에 유전자 이체<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...