일부 자금은 USDA 다중 상태의 연구 프로젝트에서 W는 - 2171는 &quot;가축의 개선을위한 배아 세포와 엠브료 개발 및 조작은&quot;기꺼이 인정받고 있습니다. 이 문서의 비디오 부분에 대한 기술적인 그림을 준비 라이언 칼라,의 예술적 재능도 기꺼이 인정하고 있습니다.

1. Cryopreservation 1 태아의 적합성을 평가 <ol><li> 개인 기증자 여성의 생식 요로의 수확 표본은 stereomicroscope를 사용하여 평가하기 전에 10 분 isotonic 배아 보관 매체에 배치해야합니다. 배아 전송 자손의 부모임의 신분을 수 있도록 다른와는 별도로 각 기증자 여성의 배아를 유지하기 위해 특정 수 있습니다. </li><li> 낮은 확대 (≤ 10X)를 사용, 개인 기증자 여성의 표본이 unfertilized 난자로 구성된 별도의 그룹으로 차별되어야, 배아, 또는 양도 품질 배아 타락한. 오직 품질 등급 1 또는 개발의 확장 blastocyst 단계를 통해 소형 morula 2 배아는 cryopreservation에 적합하며, 동기받는 여자 품질 3 학년 배아 약 25 후 전송 임신 률에 사용할 수있는 한 모든 사람이 (폐기되어야합니다 -30 %)가 허용 것으로 간주됩니다. </li><li> 배아의 조나 pellucida이 그대로 있다고하고 어떤 자료가 조나 pellucida을 준수하는 (예를 들어, 세포, 점액)가 없다는 것을 보장하기 위해 ≥ 50X 배율에서 품질 학년 1과 확장 blastocyst 단계의 배아를 통해이 소형 morula을 검사합니다. 금이 또는 누락된 조나 pellucida 또는 점착 성의 물질을 가지고 조나 pellucida 가진 배아 다른 배아에서 차별되어야하며 어느 폐기하거나 별도로 처리되었습니다. </li></ol> 2. 워싱 공룡의 태아가 질병 전송 2 확률을 감소하기 위해 <ol><li> 배아 세척 매체의 잘 첫 번째로 isotonic 배아 유지 매체의 최소 볼륨에서 조나 pellucida - 그대로 배아를 이동 (예, 인산염은 항생제와 소 혈청 알부민, 신생아 송아지 혈청 또는 폴리비닐 알코올 호수 확대를 버퍼). 별도의 각 기증자 여성에서 배아를 보관하고, 한 번에 10 개 이상의 배아를 씻어하지 마십시오. 직렬 희석 ≥ 1:100를 달성하고, 각각의 연속 세척 사이에 변경 살균 배아 처리 팁을 사용하여 특정하는 각 연속 세척에 매체의 최소 볼륨에서 배아를 이동합니다. </li><li> 으로 2.1에서 설명한 네 더 세척을 통해 배아를 이동합니다. </li><li> 바이러스성 질병의 전송이 관심있다면, 아니 90 개가 넘는 초 트립신에 총 결합하여 노출 시간을, 0.25 %의 트립신 솔루션 배아 두 번 씻는다. </li><li> 두 트립신의 세척 후, 2.1에서 설명한대로 배아 세척 중간에 5 배 이상 배아를 씻으십시오. </li><li> isotonic 배아로 배아 최종 세척, 장소 배아는 매체를 개최 후. </li></ol> 3. Cryopreservation 3 전에 배아를 Dehydrating <ol><li> 배아는 이러한 에틸렌 글리콜이나 글리세린 같은 cryoprotective 에이전트 (CPA)의 hypertonic 솔루션 (1.4-1.5 몰라 농도)로 isotonic 배아 개최 매체의 최소 볼륨에서 전송해야합니다. </li><li> 그들은 삼투 평형에 도달할 때까지 배아는 냉동 매체 (hypertonic CPA 솔루션)에 앉을 수 있습니다. 에틸렌 글리콜보다 빠르게 글리세롤, 평균 시간은 일반적으로 글리세롤 (10 분)에 비해 에틸렌 글리콜 (5 분)에 배아의 저렴가보다 배아 세포를 permeates 때문입니다. 배아는 빨대 (다음 단계에서 설명)에 로드된 후이 평균 시간의 일부는 도중 달성 수 있습니다. </li></ol> 4. Cryopreservation위한 0.25 ML의 플라스틱 스트로우로 배아를 로딩 <ol><li> 배아 로딩 장치에 0.25 ML 플라스틱 빨대 (11.5 cm 작업 길이)의 면화 플러그 엔드를 첨부하고, 적절하게 표시 빨대로 hypertonic CPA 솔루션의 약 1.3 센티미터 대기음. 라벨링 절차 다양한 빨대 씰링 플러그 중 하나 또는 빨대 어댑터와 연결 다른 빨대에 연결된 인쇄 라벨의 사용을 포함하여, 존재합니다. </li><li> CPA 솔루션에서 짚을 제거하고 지푸라기 내에 작은 기포를 만드는 공기의 약 0.15 센티미터 대기음. </li><li> 짚으로 hypertonic CPA 솔루션의 약 0.8 cm에서 단일 배아를 대기음. </li><li> CPA 솔루션에서 짚을 제거하고 지푸라기 내에서 두 번째 작은 기포 (공기 방울이 실제로 빨대 안에 배아를 분리하는 역할)를 만드는 공기의 약 0.15 센티미터 대기음. </li><li> 빨대 면화 플러그 엔드 내에 존재 분말 polyvinylchloride (PVC)을 축축하게하다하는 CPA 솔루션의 충분한 볼륨에 그려 특정되고, 완전히 짚을을 채우기 위해 CPA 솔루션의 약 9.1 센티미터 대기음. CPA 솔루션 젤로 PVC 분말을 원인과 빨대의 끝을 밀봉. </li><li> PVC 분말, 플라스틱 짚 씰링 플러그 또는 열 실러와 빨대의 다른 쪽 끝을 밀봉합니다. </li></ol> 5. 규제 속도의 배아 냉동 기계로 태아 배치 <ol><li> 메탄올 목욕이나 액체 질소 증기 냉동 기계 중 하나는 preimplantation의 배아의 cryopreservation에 대해 프로그래밍할 수 있습니다. </li><li> 엠브리 들어있는 빨대를로드<html> 온도가 주변 온도에서 -6으로 냉각되어 냉동 기계에 운영 체제 ° C. 로드 빨대 면화 플러그 최종 접속 (플라스틱 스트로우 씰링 플러그 또는 스트로우 어댑터는 사건 커튼 플러그 끝이 아래로 배치되는, 사용중인 제외). </li><li> 배아는 계속하기 전에 최소 2 분 동안이 온도에 앉을 수 있습니다. </li></ol> 6. 시딩 <ol><li> 일단 배아는 -6로 냉각해야 ° C, 집게 (또는 목화 만져 빨대 안에 CPA 솔루션의 얼음 결정 형성을 유도하기 위해 액체 질소 (또는 액체 질소에 포장되어 솜 스쳐 스틱)에 supercooled 집게 한 쌍의를 사용하여 위 또는 아래의 배아 중 솔루션의 컬럼에 대해 통보 받기 스틱). </li><li> CPA 솔루션의 물이 액체 질소에 노출 지역에서 구체화되며, 얼음 결정은 즉시 배아를 둘러싼 CPA 솔루션의 컬럼에 보급됩니다. </li><li> 더욱 냉각하기 전에 10 분 정도 온도를 시딩에서 배아를 잡아. </li></ol> 7. 태아의 계속 탈수 <ol><li> 0.5 ° C / -34의 온도로 분 ° C.의 속도 쿨 배아 이것은 냉각 속도는 배아의 지속적인 탈수를 보장하는 것이 중요합니다. </li><li> -34에서 배아를 개최 ° C를 10 분 동안 액체 질소 (-196 ° C)에 배아를 폭락하기 전에. </li><li> 장소는 적절하게 표시 지팡이에 부착된 적절하게 표시된 잔 (액체 질소로 가득)에 배아를 cryopreserved, 및 단기 또는 장기 저장을위한 액체 질소 듀어의 용기에 지팡이를 놓으십시오. </li></ol> 8. Cryopreserved 배아를 해동 <ol><li> 용기 아래 듀어의 서리 라인 남아 있도록, 액체 질소 듀어의 목에 용기를 당겨. </li><li> 해동하는 배아가 들어있는 지팡이를 찾아 신속하고 조심스럽게 잔의 다른 빨대를 따뜻하게하지 않는 특정되고, 잔에서 빨대를 제거합니다. </li><li> 추가 25-30초에 대해 37 ° C의 물을 욕조에 3~5초 (금이 조나 pellucida 4의 발생을 줄이기 위해)을 공중에 밀짚을 보유하고 잠수함. </li><li> , 물 목욕에서 짚을 제거 짚을 (빨대에 배아 식별을 자국 않도록 조심하고) 닦아 (빨대 아닌 무명 플러그 엔드를 싹둑 위해 짚을 절단 장치를 사용하는 경우 봉인 사용 열 또는 PVC 분말 ) 또는 신중 중 플라스틱 씰링 플러그를 제거하고 : <ol type="a"><li> 동기 배아받는 사람에게 가능한 빨리 배아 전송 장치 및 전송에 짚을로드 (하지만 배아는 CPA로서 에틸렌 글리콜을 사용하여 cryopreserved이었을 경우에만), 또는 </li><li> 자당의 1.0 몰라 농도 (비 permeating 화합물)이있는 접시 위에 짚을의 열린 끝을 보유하고 짚을의 면화 플러그 끝을 잘라 가위를 사용합니다. 지푸라기의 내용은 자유롭게 자당 솔루션 흘러해야하지만, 잔여 매체 빨대 안에 존재하면 빨대로 공기의 작은 컬럼을 추진하는 것이 필요할 수 있습니다. 배아는 10 분 자당 솔루션에 남아 있도록 허용하고, 다음 10 분 동안 중간을 잡고 isotonic 배아로 배아를 전송합니다. 새 짚으로로드하고, 적당한받는 여성을 전송, 배아 후 해동을 평가해보십시오. </li></ol></li></ol> 9. 대표 결과 : 다양한 요인은 임신에 영향을하고 동기받는 여자 5 냉동 해동 preimplantation의 배아의 양도로 인한 출생 율을 살 수 있습니다. 확장 blastocyst보다 작고 morula보다 고급 이상의 고급 개발 단계에서 배아는 종종 cryopreservation 프로세스뿐만 아니라 태아 소형 morula에서 초기 blastocyst, blastocyst, 그리고 배아 개발의 확대 blastocyst 단계를 생존하지 않습니다. 품질 1 학년 및 품질 3 학년 배아는 (어떤 일반적으로 인해 낮은 사후 해동 임신 속도로 cryopreserved되지 않습니다)보다 두 수율 높은 포스트 해동 임신 요금의 배아. 배아는 임신 감소 속도를 전시 가능성이있는 배아 냉동 또는 절차를 해동 배아 동안 처리한. 그의 estrous주기 기증 여성의와 동기화되지 않은받는 여자로 전송 태아는 일반적으로 낮은 임신 률을 생산하고 있습니다. (예 : biopsied 또는 bisected) 체외에서 생산 또는 일부 방식으로 조작 태아는 일반적으로 낮은 임신 률을 얻을 수 있습니다. 최적의 조건에서, 임신 요금은 동결 - 해동 가축 6,7 년 60~70%, 양 8,9,10,11에 65~75% 및 60-70%가 일반적으로 생체내 파생 배아에서 염소의 양도 후 얻은 12,13,14,15. 마찬가지로 임신 요금의 전송 후 얻은 냉동 해동 체외 생산 배아에서 일반적으로 가축 6,16에 40-50%, 양 17 25-35%하고, 염소 18 30~40%입니다. 경 1 &quot;/&gt; 동기받는 여성으로 국내 반추 가축의 종 냉동 해동 배아의 전달에 다음과 같은 표 1. 예상 임신 요금.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

배아는 주로 물로 이루어져 있기 때문에 preimplantation의 배아는 세포 얼음 결정 형성을 피하기 위해 본 설명 충분히 탈수 천천히 프로토콜에 따라 냉각하는 것이 중요합니다. 냉각 프로세스가 시작되면, 그것은 단방향 온도 변화를 유지하고 온도 변동을 방지하는 것이 중요합니다. 특정 CPA 솔루션에 적합한 온도에서 얼음 결정 형성 ( &quot;시딩&quot;)의 취지는 매우 중요합니다. 이 느린 냉각 / preimplantation의 배아 cryopreservation에 대한 신속한 해동 방법에 대한 수정은 한 단계 방식 (지푸라기에 로드된 매체의 마지막 열에 자당 대신 CPA 솔루션입니다 어디에) 19 배아는 에틸렌 글리콜에 얼어 붙 어서 직접 전송 방법을 (포함 먼저 배아)에서 20 에틸렌 글리콜을 제거하지 않고 해동하고받는 여성의 자궁에 직접 전송됩니다. 에틸렌 글리콜의 볼륨을 줄이기 위해하는 것은 직접 송금 (DT)받는 여성의 자궁에 입금, 그것은 6cm가 이전에 설명한대로 계속하기 전에 매체를 가지고있는 0.25 ML 스트로우를 채우는 것이 좋습니다. 이것은 자발적인 표준 DT에 대한 cryopreserved preimplantation의 배아가 노란색 빨대에 냉동과 액화 질소 듀어에 노란색 goblets에 저장되어야한다는 상업 배아 전송 산업의 존재 것을인지해야합니다. 상업 산업도 따라야한다 모든 cryopreserved 배아의 특정 상표 요구하고 있습니다. 이 방법은 한 가지 대안은 vitrification 21보다 고농도 (6-8 M) CPA 솔루션 울트라 빠르게 CPA 솔루션 얼음없는 액체에서 &quot;유리&quot;상태로 변경하는 원인이 냉각 cryopreservation의 비 평형 방법입니다 크리스탈 형성. Vitrification는 증가 온도 민감도로 인해 소형 morula보다 발달 고급 아르 배아의 cryopreservation에 대한 가능성이 더 적합합니다. 연도 2008 년 이전 약 500,000 소 preimplantation의 배아 이상 55%가 cryopreserved 어디이 기술은 국제 상업 배아 전송 산업에 고유한 germplasm 자원 22 보전 신청,뿐만 아니라있다. 23

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> BioLife 동결 매체 </td><td> Agtech 주식 회사 </td><td> C18, C18A </td><td> 1.5 M의 에틸렌 글리콜 </td></tr><tr><td> Emcare 에틸렌 글리콜 동결 솔루션 </td><td> ICPBio 복제 </td><td> IC8, IC10 </td><td> 1.5 M의 에틸렌 글리콜 </td></tr><tr><td> ViGro의 에틸렌 글리콜 동결 플러스 </td><td> Bioniche 동물 보건 </td><td> EVM835 </td><td> 1.5 M의 에틸렌 글리콜 </td></tr><tr><td> Emcare 10 % 글리세롤의 동결 솔루션 </td><td> ICPBio 복제 </td><td> IC12 </td><td> 1.34 M의 글리세롤 </td></tr><tr><td> Emcare 1 M의 자당의 해동 </td><td> ICPBio 복제 </td><td> IC16 </td><td> 1.0 M의 자당 </td></tr><tr><td> ViGro 한 단계 해동 </td><td> Bioniche 동물 보건 </td><td> EVM247, EVM847 </td><td> 1.0 M의 자당 </td></tr><tr><td> ViGro 해동 1-2-3 플러스 </td><td> Bioniche 동물 보건 </td><td> EVM248, EVM848 </td><td> 5 %, 2.5 %, 0.5과 0 % 글리세롤, 0.5, 0.6 %의 자당 </td></tr><tr><td> Emcare CSU는 키트 해동 </td><td> ICPBio 복제 </td><td> IC20 </td><td> 6%, 3 %, 10.3 %의 자당과 함께 0 % 글리세롤 </td></tr><tr><td> BioLife 보관 및 전송 매체 </td><td> Agtech 주식 회사 </td><td> C15, C15A </td><td> 0.4 % BSA (소 혈청 알부민)과 수정 PBS </td></tr><tr><td> Emcare 지주 솔루션 </td><td> ICPBio 복제 </td><td> IC2, IC4, IC6 </td><td> 0.4 % BSA (소 혈청 알부민), 대걸레 버퍼 (불활성 zwitterions) </td></tr><tr><td> ViGro 개최 플러스 </td><td> Bioniche 동물 보건 </td><td> EVM024, EVM824 </td><td></td></tr><tr><td> SYNGRO 홀딩 매체 </td><td> Bioniche 동물 보건 </td><td> ESM024, ESM224, ESM828 </td><td> hyaluronan를 포함하지, 동물의 기원에 대한 제품을 </td></tr><tr><td> BioLife 수정된 D - PBS </td><td> Agtech 주식 회사 </td><td> C06 </td><td> 수정 Dulbecco의 인산염은 염분 버퍼 </td></tr><tr><td> BioLife BSA 분수 V </td><td> Agtech 주식 회사 </td><td> B09 </td><td> 동결 건조된 소 혈청 알부민, 분수 V </td></tr><tr><td> BioLife 항생제 - antimycotic </td><td> Agtech 주식 회사 </td><td> B01 </td><td> amphotericin - B, 페니실린 G, 스트렙토 마이신 황산 </td></tr><tr><td> BioLife 트립신 키트 </td><td> Agtech 주식 회사 </td><td> C22A </td><td> 25g 동결 건조된 트립신, 멸균 물, 살균 D - PBS </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> 장비의 명칭 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> Biol - 쿨 제어 속도 냉동고 </td><td> FTS 시스템 </td><td> BC - IV -40 </td><td> 메탄올의 목욕 냉동고 </td></tr><tr><td> 제어 제어 속도 냉동기를 정지 </td><td> Cryologic </td><td> CL2200 </td><td> 액체 질소 냉동고 </td></tr></tbody></table>

cryopreservation of preimplantation embryos of cattle, sheep, and goats

소, 양, 그리고 염소의 Preimplantation의 배아는 - 단기 또는 장기 저장을위한 cryopreserved 수 있습니다. Preimplantation의 배아 물을 주로 이루어져 및 cryopreservation 과정에서 세포내 얼음 결정 형성의 소지를 없애기는 배아 생존을 유지하기 위해 파라마운트 중요하다. 이러한 에틸렌 글리콜 (EG) 또는 세포 탈수를 용이하게 삼투 그라디언트를 만들 수 글리세롤 (GLYC)로 cryoprotective 에이전트 (CPA)의 - 태아도 hypertonic 솔루션 (1.5 M 1.4)에 배치됩니다. 배아는 CPA 솔루션의 삼투 평형에 도달 후, 그들은 개별적으로 냉동 0.25 ML 플라스틱 빨대로 hypertonic CPA 솔루션에로드됩니다. 태아도 -6 ° C.의 온도에서 제어 속도 냉장고에 넣습니다 얼음 결정 형성은 배아를 둘러싼 CPA 솔루션 유도하고, 결정은 더 탈수를 일으키는 세포, 배아 외부 공인 회계사의 농도 증가를 일으 킵니다. 배아는 액체 질소 (-196 ° C) 속으로 뛰어들었다되기 전에 -34 ° C의 온도로, 더 탈수 있도록, 0.5 ° C / 분 속도로 냉각됩니다. Cryopreserved 배아는 수신자 (대리) 여성 전송하기 전에 해동해야합니다. 배아를 포함 스트로스는 3-5 초위한 상온 공기에서 개최된 액체 질소 듀어,에서 제거하고 25-30 초위한 37 ° C의 물을 욕조에 게재됩니다. 공룡의 태아가받는 사람 (대리인) 여성 전송하기 전에 공인 회계사의 제거를위한 10 분 자당의 1 M 용액에 배치 GLYC에 cryopreserved. 배아는 EG의 cryopreserved 그러나, 직접받는 사람의 자궁으로 전송 수 있습니다.

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Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation의 배아는 세포 탈수를 일으킬 수있는 hypertonic cryoprotective 솔루션으로 배치 후 cryopreserved 수 있습니다. 평균 후, 얼음 결정 형성은 배아를 둘러싼 솔루션에 유도합니다. 배아가 천천히 스토리지를위한 액체 질소로 폭락하기 전에 서브 제로 온도에 냉각로 추가 탈수가 발생합니다.

Preimplantation 캐틀의 태아, 양, 그리고 염소 Cryopreservation

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.5K 조회수.  Iowa State University. Preimplantation의 배아는 세포 탈수를 일으킬 수있는 hypertonic cryoprotective 솔루션으로 배치 후 cryopreserved 수 있습니다. 평균 후, 얼음 결정 형성은 배아를 둘러싼 솔루션에 유도합니다. 배아가 천천히 스토리지를위한 액체 질소로 폭락하기 전에 서브 제로 온도에 냉각로 추가 탈수가 발생합니다.

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Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

6.5 DPC 마우스 태아의 해부

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

연구

생물학

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

플라스틱 삽입 및 Xenopus laevis의 태아의 Sectioning

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

수집 및 햄스터 Oocytes 및 마우스 태아의 Cryopreservation

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

의 입식 이미징 Drosophila 태아

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures 및 Extracellular Vesicles에서 microRNAs의 분리

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

<meta charset="utf8"></head><body>멸종 위기에 처한 산호 종의 산호 정자 냉동 보존 최적화

A Semi-Automated Workflow for the Cryopreservation of Coral Sperm to Support Biobanking and Aquaculture

Coral reefs are facing a crisis as the frequency of bleaching events caused by ocean warming increases, resulting in the death of corals on reefs around the world. The subsequent loss of genetic diversity and biodiversity can diminish the ability of coral to adapt to the changing climate, so efforts to preserve existing diversity are essential to maximize the resources available for reef restoration now and in the future. The most effective approach to secure genetics long-term is cryopreservation and biobanking, which permits the frozen storage of living samples at cryogenic temperatures in liquid nitrogen indefinitely. Cryopreservation of coral sperm has been possible since 2012, but the seasonal nature of coral reproduction means that biobanking activities are restricted to just a few nights per year when spawning occurs. Improving the efficiency of coral sperm processing and cryopreservation workflows is therefore essential to maximizing these limited biobanking opportunities. To this end, we set out to optimize cryopreservation processing pathways for coral sperm by building on existing technologies and creating a semi-automated approach to streamline the assessment, handling, and cryopreservation of coral sperm. The process, which combines computer-assisted sperm analysis, barcoded cryovials, and a series of linked auto-datasheets for simultaneous editing by multiple users, improves the efficiency of both sample processing and metadata management in the field. Through integration with cross-cutting research programs such as the Reef Restoration and Adaptation Program in Australia, cryopreservation can play a crucial role in large-scale reef restoration programs by facilitating the genetic management of aquaculture populations, supporting research to enhance thermal tolerance, and preventing the extinction of coral species. The described procedures will be utilized for coral cryopreservation and biobanking practitioners on reefs worldwide and will provide a model for the transition of cryopreservation technologies from research laboratories to large-scale applications.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 글로벌 리프 복원을 위한 효율적인 냉동 보존 및 바이오뱅킹 기술 개발

This protocol describes a semi-automated pathway to improve the efficiency and capacity of processing and cryopreservation of sperm from threatened coral species, aiming to secure genetic diversity and support reef restoration efforts.

바이오뱅킹 및 양식업을 지원하기 위한 산호 정자의 냉동 보존을 위한 반자동 워크플로우

Coral reefs are facing a crisis as the frequency of bleaching events caused by ocean warming increases, resulting in the death of corals on reefs around ...