<p class="jove_content"&gt; 우리는 통찰력 토론을위한 DD 장 감사하고 넉넉한 시약을 제공합니다. MJ는 NIH 순환기 교육 부여, 애리조나 기술 연구 이니셔티브 기금과 대학 과학자 업적 보상에 의해 지원됩니다. 이 작품은 NIH 원장의 새로운 이노 수상 (1DP2OD007161 - 01), 국립 과학 재단 (0855890), 그리고 제임스 S. 맥도넬 재단에서 지원됩니다.</p

1. patterning에 사용되는 금형 만들기 <ol><li> 패턴 개념 설계. 패턴, 제어 세포 접촉을 셀 네트워크를 형성 세포를 분리, 천연 구조를 모방하거나, 그렇지 않으면 세포 접착 및 배치를 안내하는 역할을 만들어집니다. </li><li> 컴퓨터 지원 패턴과 photomask 창조의 디자인이나 CAD 기반으로 작성. 원하는 패턴 등의 AutoCAD와 같은 CAD 소프트웨어의 설계, 다음 photomask 제작을위한 외부 업체로 전송됩니다. </li><li> 마스터 패턴을 생산 석판술. 유리 슬라이드는 두 저항 얇은 긍정적 또는 생성되는 구조의 크기에 따라 저항 두꺼운 부정과 패턴입니다. 유리 슬라이드는 실리콘 웨이퍼보다 강한 저렴한 비용, 존재와 깨진 경우 많은 먼지를 생산하지 자신의 이익을 위해 사용됩니다. 또는 이러한 회절 통같이 등의 편리한 구조는 마스터 패턴으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 패턴 슬라이드는 패턴되지 않은 슬라이드 스택에 첨부되어 있습니다. 모든 단계가 먼지를 최소화하기 위해 깨끗한 흐름 후드 안에서 수행됩니다. </li><li> 마스터 금형의 창조. 슬라이드의 스택보다 약간 큰 석박의 컨테이너는 다음 초기 금형을 만들 수 photolithographically 패턴 표면에 부어 Polydimethylsiloxane의 30g (PDMS)을 위해 만든 것입니다. PDMS는 degassed 하나는 이틀 동안 치료 허용됩니다. </li><li> 일단 치유 PDMS는 마스터 패턴에서 벗겨 놓고 다음 단계에 대한 금형을 형성하고있다. </li><li> 이 부분 에폭시 (Devcon # 14310 (6g) 6 G는 1 분 혼합 후 degassed, 마스터 금형에 부어 및 치료 수있었습니다. 에폭시는 사이클을 깨고 많은 거품을 사용하여 (&lt;8 분) 신속하게 이루어져야합니다 Degassing입니다 그리고 전에 단지 얇은 레이어를 사용하여 에폭시 세트 및 거품 제거는 거품을 제거하는 것은 불가능하게됩니다. 사용된 6g 빨리 거품 제거를 용이하게 얇은 레이어를 생산하고 있습니다. </li><li> 일시간 후, 2 부분은 에폭시가 부분적으로 치유되며 더 많은 에폭시는 나중 단계에서 처리하는 easer있는 두꺼운 구조를 생성하는 degassing하지 않고 상단에 추가할 수 있습니다. 에폭시는 다음 하나는 이틀 동안 치료 허용됩니다. </li><li> 일단 치료, 에폭시는 PDMS 마스터 몰드에서 제거하고 테이프는 컨테이너를 형성하기 위해 에폭시 금형을 감싸 수 있습니다. 작업 금형은 다음 에폭시 금형에 PDMS를 따르고 PDMS를 degassing, 하나는 이틀 동안 경화에 의해 생성됩니다. </li><li> 일단 치료, 작업 금형은 에폭시에게서 벗겨과 청결을 유지하기 위해 저장됩니다. </li></ol> 2. 휴대지도를위한 금형과 표면의 Patterning <ol><li> 작업 금형의 작은 부분은 잘라 및 폴리스티렌 페트리 접시에 게재됩니다. 이러한 금형 섹션의 위치는 표시됩니다. </li><li> 삼각대는 작은 섹션 및 작업 금형 및 배양 접시의 표면 사이의 등각 접촉을 보장하기 위해 가중치에서 형성됩니다. 좋은 위치는 요리의 하단에 보면 볼 수 있습니다. </li><li> 조립은 플라즈마 챔버에 배치됩니다. 플라즈마 처리는 공기 플라즈마를 사용하여 10 분 동안 29.6 W (최대 전력) 150 파에서 시작하여 계속합니다. </li><li> 플라즈마 처리 후, 금형 및 체중 합의가 제거됩니다. </li><li> 페트리 접시는 biosafety 캐비닛 내부 살균 10 분 동안 자외선 아래에 배치하고 세포와 씨앗을 품고있을 때까지 저장됩니다. </li></ol> 3. 전지 표면을 심는 <ol><li> SH - SY5Y CRL - 2266 인간 Neuroblastoma 또는 다른 세포는 세포 유형에 대한 표준 프로토콜을 사용하여 양식하고 있습니다. </li><li> SH - SY5Y의 합류는 CRL - 2266 인간 Neuroblastoma 세포는 패턴 표면에 시딩 전에 시각적으로 측정됩니다. </li><li> 표준 셀 분할들은 배양 접시의 표면에서 세포를 제거하는 수행됩니다. </li><li> 세포 한 번 무료로 떠있는, 패턴의 표면에 배치되면 원하는 합류를 달성하기위한 희석 후 패턴 배양 접시의 표면에 씨앗을 품고있다. </li><li> 세포가 정착하고 표면에 첨부할 수 있습니다. </li><li> 세포가 플라즈마에 의해 생성된 패턴에 조립하면서 패턴 페트리 접시는 며칠 몇 시간 동안 incubated입니다. </li><li> culturing neuroblastoma 세포, retinoic 산성 (10 μm의)은 신경 세포와 같은 상태로 차별화하는 세포를 유도하기 위해 매일 추가하는 경우. retinoic 산의 추가는 어둠 속에서 이루어집니다. </li><li> Retinoic의 산성은 차별을 관찰할 수있는 후 몇 일 동안 매일 추가됩니다. </li><li> 미디어는 모든 3-4일 대체됩니다. </li></ol> 4. 관측 및 분석 <ol><li> 라이브 세포 또는 동영상의 정기적인 이미지는 시간이 지남에 따라 세포의 행동을 관찰하기 위해 이동하고 있습니다. 라이브 영상은 전지 ° C, 100 % 습도, 그리고 5% CO 2 37 세포를 유지하는 현미경 단계에 최고 인큐베이터에 배치됩니다. 세포는 형광 하에서 관찰에 대한 고정 및 스테인드 수 있습니다 </li><l내가 붙잡힌 세포의&gt; 이미지나 비디오는 이미지 분석 시스템에 수입하고 성능은 성장 속도, 세포 크기, 마이 그 레이션 속도, 차별화, 정렬, 특정 단백질의 위치, 그리고 다른 사람을 포함하여 실시하고 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 플라즈마 리소그래피 기술을 구현 전형적인 결과는 어떤 임의의 또는 자연 구조과 유사한 세포의 패턴 형성됩니다. 이것은 뉴런의 라인 및 네트워크가 생성되었습니다 그림 1A - B에서 볼 수 있습니다. 뿐만 아니라 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)와 그리드를 형성 C2C12 골격근 세포를 보여줍니다 그림 1C - D에서 볼 수와 같은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다. 이러한 폴리 - L - 라이신과 같은 자료는 특정 세포 유형 및 기타 용도로 첨부 파일을 촉진하기 위하여, 그림 1E을 패턴 수 있습니다. 표시된 뉴런의 경우, 어떤 만들어진 것은 그들 사이의 연결을 세포의 네트워크입니다. 이것은 뉴런은 뇌의 작동에 영향을 미친다 이웃 세포 사이에 개별 연결을 가진 두뇌에 자연스럽게 발생하는 어떤 복제합니다. 실험실에서 이러한 구조의 창출과 함께, 숫자, 위치, 주파수 및 연결의 다른 요소가 체계적으로 제어할 수 있습니다. 이 arraignments의 결과는 시각적으로 측정할 수와 같은 화학 물질이나 전기 자극을 같은 추가 입력은 네트워크 동작을 탐사하기 위해 구현할 수 있습니다. 부정적인 결과가 자란 또는 불완전한 패턴이나 오염 샘플 것입니다. 불완전하거나 자란 패턴은 세포의 이상적인 금액으로 패턴을 공급 않았 중 너무 적거나 너무 많은 세포와 기판을 심는로 인한 것입니다. 패턴이 올바르게 설계되지 않은 경우 또한, (예를 들어, 라인도 좁은) 세포가 부착하고 성공적으로 성장 수 없습니다. 플라즈마 patterning 또한 기판 sterilizes 사실로 인해 적절한 세포 배양 프로토콜을 다음과 같은 경우이 드문하지만 오염 샘플의 경우, 적절한 청결이 단계 중 하나에서 유지되지 않았을 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 세포와 단백질의 Patterning.

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	<li>Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Guided+Self-Assembly+of+Colloidal+Quantum+Dots+Using+Plasma+Lithography.">Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography.</a> Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).</li><li>Junkin, M., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cell+migration+in+confined+environments+by+plasma+lithography.">Probing cell migration in confined environments by plasma lithography.</a> Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).</li><li>Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-treated+polystyrene+surfaces:+model+surfaces+for+studying+cell-biomaterial+interactions.">Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions.</a> Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).</li><li>Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Sch&#246;n, P., Figdor, C. G., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+at+which+substrate+nanogroove+dimensions+may+influence+fibroblast+alignment+and+adhesion.">The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion.</a> Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 세포 조사 방법뿐만 아니라 생물 학적 구조를 모방 다세포 네트워크의 복잡한 패턴의 작성은 다음 그룹화 세포의 행동과 환경 요인 단세포 응답 모두 조사를 용이하게 자연에 subcellular 아르 자극을 생산하는 방법을 제공합니다 수 있습니다. 그것이 신속하게 세포 배양과 같은 실험실에서 저렴한 비용으로 장비를 수행할 수 있듯이이 방법의 사용은 심플하면서도 강력한입니다. 그것은 또한 강력하게 세포를 구분하는 결과 행동을 쉽게 관찰이 가능하고 장기 세포 행동의 조사를 허용 오랜 기간에 대한 안정적인 자연입니다. 그것은 또한 그것은 많은 세포 유형과 호환되며 임의의 패턴을 만들 수로 수행하는 실험의 다양한 범위 수 있습니다. 기술의 장기 안정성은 플라즈마에 의해 이수 표면 작용화는 표면의 한 부분이며, 제거하거나 타락한 수있는 코팅이나 다른 레이어가 아닌 것으로 간주하고있다는 사실에서 유래. 액체 아래에 보관하는 경우, 수정이 유형의 몇 달 동안 자사의 휴대지도 능력을 유지할 수 있습니다. 의미있는 결과를 보장하기 위해 필요한 실험의 가장 중요한 부분은 궁극적으로 휴대지도에 사용되는 마스터 패턴을 만드는 것입니다. 이 패턴이 제대로 설계되지 않은 경우, 세포가 적절하게 패턴에 응답하지 않으며 유용한 행동을 생산하지 않을 수 있습니다. 같은 라인 폭, 패턴 간격, 그리고 다른 사람과 같은 매개 변수는 크게 특정 패턴으로 전지 호환성에 영향을 미칠 수 있으며, 일반적으로 이러한 매개 변수의 범위는 가장 적합한 디자인 화면으로 초기 photomask를 만들 수 있습니다. patterning 수행에 관련된 다른 중요한 파라미터는 금형 제작, 먼지없는 환경을 유지, 세포 시딩 및 세포 배양의 일반적인 불임을 포함합니다. 몰드 생성은 PDMS는 에폭시 금형을 주조 반복 수 있도록 수행하는 다양한 전송 단계에 의해 영향을 수 있습니다. 반복 주조에 따라 소형, 높은 비율 구조와 곰팡이에 저항으로이 같은 방식으로 저하되지 않습니다 때문에 에폭시 몰드가 생성됩니다. 전송 성형이 제대로되면 크기와 생산량은 아무런 영향을받지 않습니다하지만 저조한 degassing, 불완전 치료하거나, 지나친 난방으로 같은 잘못 한 경우, 패턴의 거품, 거칠기 및 변형은 최종 결과에 영향을 미치는 어떤 발생할 수 있습니다. 어떤 먼지가 작동 PDMS 몰드와 표면 때문에 적절한 차폐 플라즈마 화학 patterning 사이의 적절한 연락처와 방해할 수로 먼지가없는 환경을 유지하기 위해 관계에서 금형이 가능한 깨끗한로 보관해야합니다. 세포의 시딩 밀도 역시도 너무 적거나 너무 많은 세포 패턴 영역을 서식 있도록 최적화해야하며 불임는 사용되는 세포의 세균 및 기타 오염을 피하기 위해 유지되어야합니다. 기술은 또한 microfluidics, microelectrodes, 그리고 기계 프로브와 같은 다른 요소로 포함될 수 있습니다. 이것은이 조합의 영향을 연구에 중점을두고 더 나은 실험 및 미래의 일을하는 동안 다양한 생리 조건을 복제하기 위해 세포에 추가 자극을 제공합니다

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 플라즈마 클리너, 진공 챔버 </td><td> Harrick 플라즈마 </td><td> PDC - 001 </td><td></td></tr><tr><td> 거꾸로 형광 및 위상 대비 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> TE2000 - U </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 무대 위로 인큐베이터 </td><td> AmScope </td><td> 모델 TCS - 100 </td><td> 적절한 분위기를 공급 인클로저를 포함하는 수정된 </td></tr><tr><td> 폴리스티렌 페트리 접시 </td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td> Polydimethylsiloxane (PDMS) </td><td> 다우 코닝 </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> 에폭시 </td><td> Devcon </td><td> 2t 명확 에폭시 # 14310 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 배양 매체 </td><td> 여러 </td><td></td><td> 미디어 세포 유형에 대한 표준 공법을 다음과 </td></tr><tr><td> Retinoic 산성 </td><td> 시그마 </td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

plasma lithography surface patterning for creation of cell networks

마이크로 및 nanoscale 해상도 휴대 microenvironment의 체계적 처리는 종종 다양한 세포 및 분자 현상을 해독 필요합니다. 이러한 요구 사항을 해결하기 위해, 우리는 100 nm의에서 mm에 이르기까지 기능 크기와 패턴 표면을 생성하여 세포 microenvironment를 조작하기 위해 플라즈마 리소그래피 기술을 개발했습니다. 이 기법의 목적은 통제 방법으로, 유학 수 있도록이며, 개별 세포의 행동뿐만 아니라 세포들의 상호 작용 그룹. 이 플라즈마 리소그래피 방법은 물리적인 곰팡이와 저온 플라즈마의 연락처를 차폐에 의해 기판에 표면 화학의 선택 변경에 따라 달라집니다. 이 선택적 차폐는 세포 부착과 운동을 안내 수있는 화학 패턴을 떠납니다. 이 패턴, 또는 표면 템플릿은 다음 구조 자연 속에서 발견을 모방하고 실험 조사를위한 제어 환경을 생산 할 수 세포의 네트워크를 만드는 데 사용할 수 있습니다. 그것이 biocompatible 방식으로 투명 고분자 기판에 안정된 표면 패턴을 생산 등 기술을 잘 생물 학적 현상을 연구하기 위해 적합합니다. 개월까지 주 동안 마지막으로 표면 패턴 따라서 이러한 차별과 adaption과 같은 장기적인 세포 프로세스의 연구를 용이하게 오랜 시간 동안 세포와 상호 작용을 안내하실 수 있습니다. 표면에 수정 자연 주로 화학되고 따라서 결과의 해석에 대한 지형 또는 물리적 간섭을 소개하지 않습니다. 그것은 또한 patterning을 달성하기 위해 어떠한 가혹하거나 독성 물질을 포함하고 조직 문화의 호환되지 않습니다. 또한, 그것은 이상적입니다 널리 생물 학적 응용에 사용되는 그들의 속성을 조정할 수있는 능력으로 인해 고분자 기판의 다양한 유형을 수정하기 위해 적용할 수 있습니다. 이러한 마이 그 레이션, 접착, 또는 구속력과 같은 특정 프로세스 격리가 multicell 수준으로 단일에서 이산, 명확한 관측을 허용으로 달성 해상도도 유용합니다. 이 방법은 마이 그 레이션, 신호, 조직 형성, 그리고 행동과 뉴런의 상호 작용은 네트워크에서 기소 인부 절차를 밟게 관련된 조사에 대해 다른 세포 유형의 다양한 네트워크를 형성하기 위해 채용되었습니다.

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

다목적 플라즈마 리소그래피 기술은 휴대폰 첨부 파일을 안내에 대한 안정된 표면 패턴을 생성하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 천연 조직을 모방하고 몇 가지, 서로 다른 세포 유형을 공부에 사용되었음을 포함 셀 네트워크를 만들어 적용할 수 있습니다.

세포 네트워크의 창조를위한 플라즈마 리소그래피 표면 Patterning

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K 조회수.  University of Arizona. 다목적 플라즈마 리소그래피 기술은 휴대폰 첨부 파일을 안내에 대한 안정된 표면 패턴을 생성하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 천연 조직을 모방하고 몇 가지, 서로 다른 세포 유형을 공부에 사용되었음을 포함 셀 네트워크를 만들어 적용할 수 있습니다.

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Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

연구

생체공학

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3D 종이 미세 유체 장치를 구축하기 위해 접착제 패터닝을 사용하여

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

미세 유동 프로브와 라이브 셀 레이어의 빠른 빼기 패터닝

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

단일 세포 수준에서 캐비테이션 버블 (들) -cell 상호 작용 및 결과 Bioeffects을 조사하기위한 표면 패터닝와 마이크로 유체 시스템

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...