전통적으로, 대식세포는 세포가 느리게 움직이기 때문에 실시간 화학 요법 에서 공부하기 어려웠습니다. 이 프로토콜은 최대 6시간 이상 화학 적 그라데이션으로 마이그레이션되는 대식세포이미지를 제공합니다. 이송 래시와 같은 임플란트 소법에 비해, 이 기술은 대식세포 형태가 관찰될 수 있는 장점이 있으며, 세포 속도 및 화학적 효율과 같은 파라미터를 측정할 수 있다.
대식세포는 많은 염증성 질환에 관여하며,이 기술은 화학 요법을 억제하도록 설계된 약물을 연구하는 데 유용 할 수 있습니다. 그것은 또한 인간 단핵구와 같은 그밖 세포 모형에 적용될 수 있습니다. 처음으로이 기술을 시도 할 때, 세포와 함께 작업하기 전에 화학 요법 챔버를 채우는 연습을하는 것이 가장 좋습니다.
이 기술의 가장 중요한 측면 중 하나는 기포를 피하는 것입니다. 먼저 원고 방향에 따라 제조된 수정된 RPMI 1640 HEPES 매체로 하나 또는 두 개의 화학 요법 슬라이드의 연결 채널을 미리 채우는 것으로 시작합니다. 슬라이드를 세포 배양 접시에 넣고 접시를 섭씨 37도까지 가열하는 알루미늄 블록에 놓습니다.
그런 다음 포트 1개와 4개에 플러그를 삽입합니다. 200 마이크로리터 베벨링 파이펫 팁을 사용하여 수정된 RPMI 1640 HEPES 배지의 15 마이크로리터를 충진 포트 3에 증착합니다. 다음으로, 파이펫 팁을 포트 2에 삽입하고, 15 마이크로리터를 적당히 빠른 속도로 흡인하여 연결 채널과 두 개의 측면 공급 채널을 미리 채웁니다.
충전 포트 2와 3개를 캡으로 덮고 건조하고 이산화탄소가 없는 인큐베이터 내에 밀폐된 습도 챔버에 방과 위에 화학요법 슬라이드를 놓습니다. 대식세포를 분리하려면 24게이지 플라스틱 카테터를 희생된 3~4개월 된 마우스의 복막 구멍에 삽입하고, 5밀리리터 플라스틱 주사기를 사용하여 칼슘이나 마그네슘없이 얼음 냉간 행크의 완충염 용액으로 캐비티를 흘린다. 튜브에서 용암 매체를 수집한 후 원심분리기는 6.5분 동안 300배 G로 분리합니다.
상체를 폐기하고, 변형된 RPMI 1640 배지의 200 마이크로리터에서 세포를 다시 중단한다. 세포 현탁액의 알리쿼트1에서 20까지 희석한다. 그런 다음 셀을 계산하기 위해 계수 장치를 사용합니다.
셀을 밀리리터당 6개의 세포에 10배 10배의 최종 농도로 희석하고 가열된 알루미늄 블록에서 섭씨 37도에서 유지합니다. 세포 현탁액을 5배 이상 배워 응집을 줄이고 10마이크로리터를 항만 3개에 부드럽게 증착합니다. 파이펫 팁을 포트 2에 넣고 셀 서스펜션을 연결 채널에 천천히 그립니다.
셀 서스펜션이 도입되자마자 포트 1개와 4개 포트의 플러그를 제거하여 흐름을 체포하고 4개의 충전 포트에 캡을 배치합니다. 그런 다음 화학 요법 슬라이드를 섭씨 37도 습도 챔버에 2 ~ 3 시간 동안 놓습니다. 반전된 현미경으로 관찰 영역을 검사합니다.
그런 다음 플러그를 충전 포트 1개와 2개에 배치하고, 충전 포트 3개가 중간으로 상단에 채워지고 기포가 없는지 확인합니다. 필요한 경우 멸균 27 게이지 주사기 바늘을 사용하여 기포를 제거하십시오. 다음으로, 100 마이크로리터 기계 파이프로 60 마이크로리터의 마이크로리터를 흡인하고 팁을 3개의 충진 포트에 배치합니다.
부피 설정 링을 사용하여 1~2분 후에 충전 포트 4의 상단에 도달할 때까지 매체를 천천히 꾸준히 저장소에 주입합니다. 두 번째 저장소를 채우기 위해 포트 1에서 플러그를 이동하고 천천히 포트 3에 삽입합니다. 배지 50 마이크로리터를 흡면하고, 파이펫 팁을 포트 4에 넣고, 배지를 두 번째 저수지에 천천히 주입하여 1~2분 후에 충전 포트의 맨 위에 도달합니다.
495 마이크로리터의 미디엄을 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 추가하고 5마이크로리터의 특허 블루 5개를 추가합니다. 혼합물을 잠시 소용돌이, 다음 혼합 다시 조합 마우스 보완 C5a와 소용돌이의 5.4 마이크로 리터를 추가합니다. 포트 맨 위에 있는 얕은 우울증이 중간 무료인지 확인하고, 중간 물질을 함유하는 파란색 보완 C5a의 15 마이크로리터를 증정한다.
그런 다음 200 마이크로리터 파이펫 팁을 채우는 포트 4에 삽입하고 볼륨 설정 링을 천천히 회전하여 배지를 반대 저수지로 그립니다. 유체 공기 인터페이스가 열의 중간에 될 때까지 충진 포트 의 짧은 수직 열에 공기를 그립니다. 그런 다음 포트 를 조심스럽게 포트 4에서 들어 올리기 전에 포트 를 연결하여 슬라이드가 제자리에 남아 있는지 확인하고 포트 4를 천천히 연결합니다.
시간 경과 이미징을 수행하기 위해, 단계 인큐베이터가 장착 된 반전 된 현미경의 단계에 화학 요법 슬라이드를 배치하고 대식세포 라멜리포디아에 초점을 맞춘 10X 위상 대비 객관적인 렌즈로 관찰 영역을 이미지화합니다. 마우스 복막 대식세포의 시간 경과 비디오 현미경 검사법에 사용되는 화학 요법 슬라이드에는 3 개의 화학 요법 챔버가 있으며 각각 4 개의 충전 포트가 있습니다. 세포는 각 챔버의 관찰 영역에서 시드되었다.
그리고 2~3시간 의 배양 후, 챔버는 천천히 매체로 채워졌다. 관측 영역의 세포가 검사되었을 때 세포의 3 분의 2까지 씻겨 나왔습니다. 일반적으로, 약한 부착 B-1 세포는 씻어 내고, 나머지 세포는 주로 대식세포였다.
대식세포를 B 세포와 구별하기 위해 새로 분리된 세포는 특정 항체로 표지되었다. 대식세포는 녹색 형광, 적색을 가진 B 세포 및 청색으로 세포 핵으로 표지되었습니다. 대식세포 이동은 화학 요법자인 보완 C5a를 두 저수지 중 하나에 도입하여 조사되었습니다.
보완 C5 그라데이션에서 마이그레이션하는 대식대식파지의 마이그레이션 트랙이 기록되었습니다. 각 마이그레이션 트랙의 시작점은 X로 정규화되어 0과 같고 Y는 0과 같아 마이그레이션 플롯을 만듭니다. 이어서, 개별 대식세포의 세포 속도 및 화학적 효율이 계산되었다.
이 기술은 G 단백질 서브유닛, 로 GTPases, 및 화학 요법의 대식세포 운동성의 역할을 연구하는 데 유용했습니다.
