AAV 바이러스 벡터의 생산을위한이 프로토콜은 비용 효율적이며 전임상, 대형 동물 모델에서 사용하기 위한 고순도, 하이 티터, 연구 급 AAV를 산출합니다. 이 기술은 세포 배양 챔버에서 부착 HEK293 세포를 사용, 이는 시간 효율적이고 덜 실습, 세포에 적은 중단을 허용. 이 프로토콜은 유전자 치료의 분야에 대한 바이러스 벡터 생산에 크게 도움이 될 수 있으며, 또한 헤파란 황산염을 결합하는 다른 AAV 혈청형의 생산에 사용될 수 있다.
시작하려면 80%에 도달하면 배양에서 HEK293 세포를 수집합니다. PBS의 3 밀리리터로 세포 배양 판을 부드럽게 세척하기 전에 미디어를 흡인하십시오. 그런 다음 PBS를 흡인하고 트립신의 세 밀리리터를 추가합니다.
섭씨 37도에서 플레이트를 2분간 배양합니다. 인큐베이션 후, 트립신을 중화하고, 접시에 완전한 DMEM의 7 밀리리터를 추가하여, 50 밀리리터 원추형 튜브에서 상퍼를 수집합니다. 튜브를 부드럽게 반전하여 세포가 균질한지 확인합니다.
세포 밀도를 결정하려면 세포 샘플의 마이크로리터 10개와 트라이팬 블루 10마이크로리터를 혼합합니다. 그리고 셀 카운트 슬라이드에 혼합물을 추가하여 셀 카운터에서 분석한다. 세포 현탁액을 미리 따뜻하게 한 완전 DMEM과 혼합하여 배양 챔버를 볼 수 있습니다.
챔버를 부드럽게 회전하여 셀을 균등하게 분배합니다. 챔버를 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%로 배양합니다. 세포 배양챔버 이외에, 10~제4세포에서 제4세포에서 15센티미터 플레이트에서 제곱된 배양세포가 결합을 위한 기준으로 한다.
65시간의 인큐베이션 후, 세포가 80~90%의 컨실수일 때, 세포 배양 챔버 포트에 폴리에틸렌-DNA 및 DMEM 혼합물을 천천히 첨가한다. 액체를 모든 행에 균등하게 분배한 후 섭씨 37도, 이산화탄소 는 72시간 동안 5%로 배양됩니다. 인큐베이션 후, 세포 배양실을 격렬하게 흔들어 세포가 흐리게 될 때까지 세포를 빼내고 4~500밀리리터 원심분리관에 붓습니다.
18, 000회 G에서 4°C에서 30분간 원심분리로 세포를 펠렛합니다. 1리터 PETG 병에 정제된 상체를 붓고 500밀리리터 원심분리기 튜브에서 50밀리리터의 허가된 완충제에서 셀 펠릿을 재보페수합니다. 37도에서 60분 동안 튜브를 배양합니다.
인큐베이션 후, 튜브를 18, 000배 G에서 30분 동안 원심분리하고, 상체를 동일한 1리터 PETG 병으로 옮긴다. 영하 80도에 보관하십시오. 하룻밤 사이에 4도에서 원유 를 해동하십시오.
해동되면 0.22 미크론 필터를 사용하여 필터링하십시오. 정화 단계 바로 전에 사용 중인 각 헤파린-세파로즈 컬럼에 대해 4밀리리터의 필터 전처리 버퍼를 추가하여 원심 농축기를 전달합니다. 튜브를 연동 펌프에 놓습니다.
솔루션과 미디어를 순차적으로 실행합니다. 튜브에 5 밀리리터 헤파린-세파로즈 컬럼을 부착하고, 기둥을 통해 25밀리리터의 바젤 DMEM을 실행하여 크로마토그래피를 준비합니다. 그런 다음 여과된 원유 의 0.2 마이크로몰라를 초당 1~2방울의 유량으로 컬럼에 로드합니다.
마그네슘과 칼슘을 함유한 염화 나트륨 HBSS 300밀리어로 5밀리리터를 순차적으로 세척하고 5개의 elutions를 E1에서 E5로 라벨을 부착합니다. 준비가 되면 전처리 버퍼를 포함하는 원심 농축기를 900회 G에서 2분 동안 회전시합니다. 흐름을 삭제합니다. 원심 농축기 필터를 마그네슘과 칼슘으로 4밀리리터로 2분간 1000회 G로 회전시 세척합니다.
그런 다음 원심 농축기에 용출 E2를 추가하고 5 분 동안 1000 회 G에서 회전합니다. 흐름을 삭제합니다. 마찬가지로 농축 된 바이러스가 약 1 밀리리터가 될 때까지 원심 농축기로 용출 E3를 회전시.
P200 여과 팁을 사용하여 원심 농축기에서 농축 된 바이러스를 제거하고 멸균 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브로 수집합니다. 바이러스의 수집 후, 마그네슘과 칼슘과 HBSS의 200 마이크로 리터원 원심 농축기를 헹구세요. 파이펫은 30초 동안 힘차게 위아래로 하여 막에 부착된 바이러스를 빼내고, 동일한 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 농축 바이러스를 수집한다.
튜브를 잘 섞습니다. 4섭씨로 보관하기 전에 기둥을 씻고 20%에탄올로 채점합니다. 펌프 튜빙을 수산화 나트륨 1개에 보관합니다.
AAV6.2FF 캡시드의 트랜스듀션 효율은 근내 투여 시 28일 동안 쥐, 햄스터 및 양에서 비교되었다. 마우스는 AAV6.2FF 인간 IgG의 킬로그램당 12번째 벡터 게놈에 5회 투여, 혈청에서 인간 IgG의 밀리리터 당 171 에서 237 마이크로그램 사이에 발현하였다. 햄스터는 AAV6.2FF 인간 IgG의 킬로그램 당 13 벡터 게놈에 2회 10에서 투여되며, 마우스보다 훨씬 높은 수준의 인간 IgG를 발현한다.
대형 동물 모델은 플라즈마에서 인간 IgG 수준의 밀리리터 당 평균 35 마이크로그램을 표현할 수 있었습니다. 대형 동물 모델은 생체 내에서 AAV 트랜스진의 발현을 결정하고, 전간유전자가 관심 있는 장애 또는 질병에 대한 치료 효과가 있는지 를 결정할 수 있다. 이 연구는 AAV6.2FF의 뛰어난 트랜스듀션 능력, 골격 근육의 새로운 AAV 6 세로형 벡터, 생체내 AAV 바이러스 벡터의 낮은 면역원성을 선보였다.
