우리는 특히 마커스 뮐러, 실비아 Münstermann, 바바라 Liebetrau와 맨디 Roscher에서 DKFZ 바이러스 생산과 개발 단위의 팀을 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 교육과 연구 (BMBF)와 Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle 뒤 그랜드 - 예상 응용 Tumour 바이러스학의 공동 프로그램의 프레임 워크의 Helmholtz 협회의 연방 교육부에서 교부금에 의해 지원되었습니다.

biosafety 레벨 2 연구실은 재조합 parvoviruses (recPV)의 생산을 위해 필요합니다. 프로토콜은 두 가지 부분으로 세분화됩니다. 첫 번째 부분은 (transfection 통해 recPV 생산) 프로토콜의 두 번째 부분 (감염을 통해 recPVs 생산)에 inoculum 역할 recPVs의 최소한의 금액을 생산하는 데 필요합니다. 일단 recPVs의 작은 금액은 프로토콜의 첫 번째 부분을 생략할 수 있고, 생산하고 있으며, 재조합 파르 보 바이러스는 아데노 바이러스 헬퍼를 통해 파르 보 바이러스 capsid 단백질 (아래)에 대한 유전자 인코딩을 제공 감염을 통해 증폭하실 수 있습니다. 1. Transfection 통해 recPVs 생산 1.1 바이러스성 DNA의 transfection 그것도 양이온 lipids 또는 인산 칼슘을 기반 프로토콜의이 섹션에있는 기존의 DNA transfection 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 Fugene H를 사용차원 Transfection 시약. transfection 효율을 제어하려면, 우리는 플라스미드 표현 향상된 녹색 형광 단백질 (예 : pEGFP-N1, Clontech)를 추가로 플레이트 transfecting을 권장합니다. 세포 인구의 50 % 이상은 EGFP 양성 24시간 transfection 후 결과 때 Transfection은 효율 및 바이러스 생산을위한 최적 간주됩니다. <ol><li> transfection 당일 50 % 세포 confluency 구하는 10cm 접시에서 transfection, 씨앗 2,000,000 HEK293T 전지 전 일일. 10% 태아 소 혈청, 2 개의 MM L-글루타민, ML 페니실린 당 100 U 및 100 μg / ML의 스트렙토 마이신의 추가와 함께 Dulbecco의 수정일 독수리 중간 (DMEM)의 10 ML에서 세포를 성장. </li><li> 1.5 ML 관에서 바이러스 제작 혼합물을 (1시 2분 1초 어금니 비율) 준비 : <ol class="lalpha"><li> recPV 벡터 3 μg 관심의 transgene (전자 통합 phH-1-GFP 6) 숨겨주. </li><li> 벡터 pCMV / 부사장 5 6 μg는 파르 보 바이러스의 capsid 유전자 단위를 숨겨주 </li><li> 8 μg OF 아데노 바이러스 파생 헬퍼 플라스미드 pXX6 7. </li></ol></li><li> 850 μl (20 μl / NG의 최종 농도)에 혈청이없는 배지 최대로 plasmids 믹스를 희석. </li><li> 42.5 μl Fugene HD을 (μg의 DNA 2.5:1 비율 μl의 Fugene) 추가합니다. 매체에 Fugene을 추가할 때 튜브의 측면을 만지지 마십시오. </li><li> 5-10초 대한 부드럽게 소용돌이. </li><li> 30 분간 실온에서 혼합되어 알을 품다. </li><li> transfection의 혼합물 셀에 드롭 지혜를 추가합니다. 균등에 걸쳐 혼합 배포 부드럽게 접시를 흔들어. </li></ol> 1.2 바이러스 생산 <ol><li> 수확 전에 72 시간 92% 습도 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 품어. 이 기간 동안 자손의 파르 보 바이러스 입자는 파르 보 바이러스의 plasmids에서 형성된다. </li></ol> 1.3 바이러스 수확 <ol><li> 조직 문화 후드에서 15로 접시에서 정학을, 그들의 매체 내의 세포를 밀고 대기음 및 전송ML 플라스틱 튜브. </li><li> 상온에서 5 분 250 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 뜨는의 95 %를 제거합니다. </li><li> 와동 튜브 부드럽게 남은 뜨는 (0.5에 대한 ML)에 펠렛을 resuspend합니다. </li><li> -80에서 튜브를 고정 ° C. 그것은이 단계에서 생산을 중단하거나 프로토콜을 계속하는 것이 가능합니다. </li><li> 현탁액을 서리를 없애다하고 실온에서 가져옵니다. </li><li> 37 따뜻한 물에 액체 질소 욕조, 해동에 서스펜션을 고정 ° C. 와동 노골적인 협상을 15 초 및 냉동 해동 사이클 추가로 두 번 반복 튜브. </li><li> 4에서 15 분에 해당하는 16,000 XG에 튜브를 원심 ° C. </li><li> 새로운 튜브로 뜨는 수집합니다. 이 단계에서 튜브 원유 바이러스 추출물 준비가 포함되어 있습니다. </li><li> 바이러스 적정 (아래)을 진행합니다. GFP 유전자를 나르는 recPV 들어, 일반적인 생산은 약 1 ~ 대응 1-3 X 10 7 바이러스성 전염성 단위를 제공한다 -3 * 10 10 바이러스성 게놈은 입자를 포함하는. </li></ol> 1.4 바이러스 저장 <ol><li> 장기 보관의 경우 -80에서 원유 바이러스 추출물이 들어있는 튜브를 고정 ° C. 이 프로토콜의 두 번째 부분에 inoculum 등 원유 바이러스 추출물을 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2. 감염을 통해 recPVs 생산 감염을 통해 recPV 생산부터 시작하기 전에, 생산 및 아데노 표준 프로토콜 여덟에 따라 파르 보 바이러스 부사장 유전자 (AD-부사장 헬퍼, 5에서 설명)을 들고 5 정화. 또한 관심의 transgene을 (예를 들어, 위에서 설명한대로 transfection을 통해 생산) 휴대 recPVs의 최소한도 필요합니다. 아래, 우리는 175cm 두 플라스크 (T175) 형식으로 recPV 생산을 설명합니다. 이렇게 생산되는 바이러스 주식 더 증폭은 10 다층 CellSTACK 문화 챔버 (코닝)에 실시됩니다프로토콜의 사소한 조정 제안과 함께. 2.1 감염 <ol><li> 감염의 날에 60~80% 세포 confluency 구하는 T175 플라스크에 감염, 플레이트 10,000,000 NB324K 전지 전 일일. 컨트롤과 같은 세포의 같은 수의 (비 감염된 세포를) 포함하는 두 번째 플라스크를 준비합니다. 각 T175은 5 % 태아 소 혈청, 2 개의 MM L-글루타민, ML Penicilin 당 100U과 100 μg / ML 스트렙토 마이신과 보완 최종 볼륨으로 최소 필수 중간 (MEM)의 20 ML이 있어야합니다. </li><li> 다음날 아침 구성된 2 ML 플라스틱 튜브에 바이러스 혼합물을 준비 : <ol class="lalpha"><li> 감염의 다수 (입니다만, 전염성 단위 / 셀)에서 AD-VP-헬퍼 5 = 10 (1 X 10 8 전염성 단위에 해당); </li><li> 입니다만에서 recPVs = 0.5 (5 × 10 6 전염성 단위에 해당). MEM으로 1.5 ML을 완료합니다. </li></ol></li><li> T175 플라스크 중 하나에서 전체 바이러스 혼합물을 적용합니다. </li><li> 을 품어37 2 시간 용 플라스크는 ° C, 92 %의 습도가 5 % CO 2 부드럽게 매 15 분 흔들어. </li><li> 37 이상 20-24 시간 동안 품어 ° C, 92 %의 습도 5 % CO 2. </li><li> 신선한 매체와 문화 매체를 교체합니다. </li></ol> 2.2 바이러스 생산 48 시간 동안 92% 습도와 5 % CO 2와 37 ° C에서 flasks을 품어. 효율적인 바이러스 생산은 표시대로, 세포 독성의 명확한 징후는 36~48시간 후 감염을 시작, 바이러스 감염된 세포가 들어있는 플라스크에서 관찰되어야한다. 2.3 바이러스 수확 <ol><li> 조직 문화 후드에서 기음과 50 ML의 원심 관에 플라스크에서 배지 표면에 뜨는을 전송. </li><li> 1.5 ML PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 0.25 % Trysin-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 1.5 ML과 세포 Trypsinize. 제거 매체에 세포 현탁액을 추가합니다. </li><li> 객실 기질에서 5 분 5,000 XG의 세포 표면에 뜨는을 원심 분리기ature. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 세포 펠렛과 부드럽게 소용돌이 세포 resuspend하는 튜브에 TE 버퍼 1 ML (1 MM 트리스-HCL, 0.1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.7) 추가합니다. </li><li> 37 따뜻한 물에 액체 질소 욕조, 해동에 세포 현탁액을 고정 ° C. 15 초 용 튜브 적극적으로 소용돌이와 동결 - 해동주기를 세 번 반복합니다. </li><li> 세포 게놈 및 비 포장 바이러스 DNAs을 소화하기 위해 37 30 분 50 U / ML Benzonase Nuclease ° C와 세포 현탁액을 취급합니다. </li><li> 4에서 20 분 동안 5,000 XG에 튜브를 원심 ° C. </li><li> 새로운 튜브로 뜨는 수집합니다. 이 단계에서 뜨는가 조강 바이러스 추출물 준비가 포함되어 있습니다. recPV-GFP의 일반적인 수율이 프로토콜 1-10 X 10 8 바이러스성 전염성 단위의 범위에 있어야 다음을 생산했다. </li></ol> 2.4 바이러스 저장 <ol><li> 4 ° C.의 단기 저장을위한 (최대 2 개월), 상점 바이러스 </li><li> 경도의 경우-80에서 g 기간 스토리지 (이상 2 개월), 상점 바이러스 ° C. </li></ol> 3. RecPV 정화 <ol><li> 원유 lysates에서 recPVs의 정화에 대해서는 Zolotukhin 외 따라 Iodixanol discontinous 기울기를 실행하는 것이 좋습니다. 9. 우리는 효율적인 바이러스 정화를위한 원유 바이러스성 추출물 (5 T175 flasks 생산에서 얻은) 5 ML 최소를 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. 재조합 파르 보 바이러스 적정 <ol><li> 엘 - Andaloussi 외에 설명된대로 recPV 적정 수행 5. </li></ol> 5. 품질 제어 <ol><li> NB324K 표시기 세포에서 파르 보 바이러스 플라크 분석 수행 원치 않는 복제를 관할 바이러스 (RCV)의 존재를 확인하기 위해 엘 - Andaloussi 외 5.에 설명된 프로토콜을 사용합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 recPVs productio의 예N 아데노 바이러스 게놈 요소의 유무에 transfection을 통해 그림 3에 표시됩니다. 세포 phH-1-GFP (recPV가 GFP 유전자를 숨겨주) 또는 phH-1-루시페라제 (recPV는 반딧불의 루시페라제 유전자를 숨겨주)와 함께 pCMV / 부사장 (VP의 파르 보 바이러스 capsid 단백질에 대한 유전자 인코딩을 나르는 플라스미드)로 transfected되었다 와 (+ pXX6) 또는없는 (-pXX6) pXX6 플라스미드 (아데노 바이러스를 운반 E2A, E4 (orf6) 및 VA RNA의 유전자). 원유 세포 추출물의 평등 볼륨은 엘 - Andaloussi 외에 보도된대로 셀 및 GFP를 형질 도입이나 루시페라제 assays이 수행되었다. 5 NB324K 적용되었습니다. recPVs 생산 명확 증가는 우리의 방법 (그림 3A, B)에 따라 얻은 약 5 튜브 / 감방으로 기존의 프로토콜에 따라 생산 0.3 GFP transductional 단위 (TU) / 세포에서 증가로 pXX6의 면전에서 얻은 얻은 것입니다. recPV producti의 상당한 증가 (24 배 정도)에서 또한 phH-1-루시페라제 (그림 3C)의 경우에서 관찰되었다. 이러한 결과는 pXX6에 포함된 유전 물질이 파르 보 바이러스 생산을 증대 수 있음을 나타냅니다. 감염을 통해 recPVs 생산의 대표적인 예제는 그림 4에 표시됩니다. NB324K 전지는 다양한 recPVs (같은 그림에 표시된)와 AD-VP-헬퍼 (PV 부사장 capsid 단백질에 대한 유전자 인코딩을 품고)와 함께 공동 감염되었다. 최대 AD-부사장 도우미 더욱 향상된 recPV 생산에&gt; 바람직하지 복제 능력이 바이러스성 입자 (그림 4B)의 발생을 증가하지 않고 씨앗을 품고 세포 당 70 TU (그림 4A). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" /> 1 그림. 벡터는 자율 parvoviruses에 기초. () 홈 : transgene은 부사장 코딩하는 유전자의 일부를 대체하고 바이러스 발기인 P38의 통제하에있다. NS1 / 2 유전자가 다시있다tained과 그 표현은 바이러스성 발기인 P4에 의해 제어됩니다. 벡터 게놈은 복제와 재조합 게놈의 패키징에 필요한 CIS-연기 요소를 포함 parvoviral ITRs, 어귀 있습니다. 하단 : 플라스미드 (예 CMV.) 중 heterologous 또는 autologous (예 : P38.) 발기인 (PX)에서 VP-유전자를 나르는 구조 유전자의 장애 보상하기 위해 재조합 파르 보 바이러스 제작 중에 트랜스에 공급됩니다 재조합 게놈 인치 ITR, 거꾸로 터미널 반복. 그림 4에서 적응. recPVs의 생산에 사용되는 고전적인 프로토콜의 (B) 도식보기. HEK293T 세포 transiently 바이러스성 DNA (벡터 및 헬퍼 plasmids)와 함께 3 일 후에 transfected하고 세포를 모으고 바이러스가 수확됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" /> 그림 2. 함께 recPVs 생산광고 - 부사장의 도움이됩니다. recPV 및 광고 - 부사장 genomes의 () 도식지도. recPV은 부사장 지방의 일부를 대체 heterologous transgene이 포함되어 있습니다. AD-부사장은 파르 보 바이러스 부사장 유전자을 비호.이 원고에 기술된 프로토콜의 (B) 도식보기. NB324K 전지는 recPV 및 광고 - 부사장 바이러스와 공동 감염됩니다. 삼일 전지는 수확 및 recPV 입자는 세포 lysate로부터 복구 후. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" /> 그림 3. 아데노 바이러스 기반 plasmids pXX6 의한 recPV 생산의 자극. 10cm 접시에 놓는 HEK293T 세포는, recPVs을 생산 phH-1-GFP (A와 B) 또는 phH-1-루시페라제 (C)와 함께 pCMV / 부사장으로 transfected되었다. 동시에 세포가 아데노 파생 헬퍼 plasmids pXX6 말거나 같은 지적과 함께 공동 transfected되었다. 사흘 후 transfection, 세포의 세 동결과 해동 사이클에 의해 수확 및 lysed되었습니다. crud의 균등 권전자 바이러스 추출물이 표시등 세포를 NBK 적용되었으며, 형질 도입의 assays가 실시되었다. () 합류 NB324K의 monolayers 내에서 GFP 양성 세포를 보여주는 대표 micrographs 있습니다. (B) GFP를 형질 도입의 assays의 부량는 씨앗을 품고 세포 당 형질 도입 단위 (TU)로 표시 . (C) 루시페라제 활동의 부량 상대 루시페라제 단위 (RLU)로 표현. 엘 - Andaloussi 외에 설명된대로 루시페라제 분석이 수행되었다. 5. 열 세의 평균 값은 표준 편차 바와 복제 나타냅니다. + pXX6 칼럼의 맨 위에 숫자에서는 (B 및 C)없이 적어 넣은 pXX6의 면전에서 얻은 recPV 바이러스 titers의 배 증가를 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" /> 4 그림. 재조합 AD-부사장 도우미 바이러스에 의한 recPV 생산의 자극. () NB324K 세포가 infec 있었다다음 입니다만 10시 정화 AD-부사장 도우미 바이러스 (광고-X 단위 / 셀, Adeno-X 신속한 Titer Kit에 titrated)와 테드, 다음과 같은 재조합 파르 보 바이러스 치 HH-1-EGFP 11 (0.1 자중 superinfected TU는 / 휴대폰) 또는 H-1-GFP (0.5 TU / 셀) 5. 어느 날 이후의 감염, 매체가 변경되었고 이틀 후, 세포가 수집되었다 세 냉동 및 해동 사이클을 통해 lysed. 원유 세포 추출물은 엘 - Andaloussi 외에 따른 도입 분석하여 바이러스 titers를 결정하는 데 사용되었다. 5. TU, 형질 도입 단위. (B) AD-부사장 부재의 면전에서 생산되는 바이러스성 배치는 NB324K 표시등 세포에 플라크 분석하여 복제 능력이 바이러스성 입자 (RCV) 자신의 콘텐츠를 분석했다.

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우리는 공개 할게 없다.

우리는 recPV 생산은 adenoviral 게놈 요소의 존재에 의해 향상될 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 transfection 통해 아데노 바이러스 게놈 요소를 제공함으로써 관련 recPV와 함께 광고 - 부사장 - 도우미와 100 개 이상의 접이식 공동 감염 세포에 의해 10 개 이상의 배 (0.3-5 TU / 셀)에 의해 recPV 수율을 증가 기존의 프로토콜에 비해. 프로토콜은 더욱 아데노 바이러스 게놈 요소의 전달 및 감염에 사용하?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 시그마 </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> 시그마 </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Foetal 소 혈청 </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> 로슈 </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> 시그마 </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X 신속한 Titer 키트 </td><td> Clontech </td><td> 632,250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

같은 쥐 H-1PV 및 MVM 등 설치류의 parvoviruses은 (PV), 작은 icosahedral, 단일 좌초된, DNA 바이러스입니다. 그들의 게놈은 각각 한 비 구조 (NS1과 NS2)과 capsid 단백질 (VP1과 VP2)의 표현을 조절이 발기인 P4와 P38을 포함합니다. 그들은 oncolytic 및 oncosuppressive 능력에 대한 anticancer 대리인의 인간 2 비 병원성하면서로서 높은 관심을 끌. NS1 바이러스는 세포 독성의 3 대 이펙터입니다. 추가로 천연 antineoplastic 활동을 강화하기 위해서는 이러한 벡터로부터 파생은 치료 transgene (예 : 세포 독성 폴리펩티드, 시토킨, 케모카인, 종양 억제 유전자 등) 4 capsid 단백질에 대한 유전자 인코딩 교체에 의해 생성되었습니다. 재조합 parvoviruses (recPVs)는 벡터가 NS1 / 2 코딩 시퀀스 및 바이러스성 DNA의 증폭 및 패키징에 필요한 PV의 게놈 telomeres을 유지합니다. 생산recPVs 단지별로 생산 세포 (일반적으로 HEK293T)에서 발생하는 공동 transfecting 부사장 단백질에 대한 유전자 인코딩 (그림 1) 4을 표현 두 번째 벡터 (pCMV-VP)으로 세포를. 이렇게 생성된 recPV 벡터는 복제에 결함이 있습니다. recPVs 그들이 생성되어있는 부모의 바이러스에 대하여 강화된 oncotoxic 활동을 소유 입증했지만, 그들의 생산을 주요 과제 남아 강력하게 안티 - 암 임상 응용에 이러한 에이전트의 사용을 hampers. 우리가 사용하는 다른 프로토콜에 비해 이상 10 배 이상으로 recPVs의 생산을 향상 HEK293T로 E2a, E4 (orf6) 및 VA RNA의 유전자 (예 : pXX6 플라스미드)를 포함하는 광고-5 파생된 벡터의 도입을 발견. 이 연구 결과를 바탕으로, 우리는 recPVs 생산을 강화하는 데 필요한 게놈 adenoviral 요소뿐만 아니라 parvovir 포함되어 AD-VP-헬퍼 소설을 만들었저희 부사장 유전자 단위 5. AD-VP-헬퍼의 사용은, 레크 리에 - 베트남 후 증후군의 생산 ((예 NB324K) 가능 transfect하기 어려운 세포 라인의 활용, 바이러스성 감염 단계 (같은 플라스미드 transfection 반대)에 전적으로 의존 프로토콜을 사용하여 수 그림. 2). 우리는 크게 최종 제품 5 품질에 영향을 미치지 않고, 생산 시간 및 비용을 모두 절감, 생산 재조합 바이러스의 양을 향상 방법을 제시한다. 또한, recPV의 대규모 생산은 (현탁액 세포와 bioreactors에서) 지금 생각할 수있다.

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Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

여기에는 오직 사용중인 다른 프로토콜에 비해 100 개 이상의 배 이상에 의한 재조합 파르 보 바이러스 생산의 효율성을 향상시켜 세포 감염에 기반 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 파르 보 바이러스의 부사장의 전송 단위 (광고-VP)를 포함하는 5-기반 도우미 소설 아데노 바이러스의 사용에 의존하고 있습니다.

아데노 바이러스 파생 시스템의 도움으로 효율적인 재조합 파르 보 바이러스 생산

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

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Immunology and Infection

10.9K 조회수.  German Cancer Research Center (DKFZ). 여기에는 오직 사용중인 다른 프로토콜에 비해 100 개 이상의 배 이상에 의한 재조합 파르 보 바이러스 생산의 효율성을 향상시켜 세포 감염에 기반 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 파르 보 바이러스의 부사장의 전송 단위 (광고-VP)를 포함하는 5-기반 도우미 소설 아데노 바이러스의 사용에 의존하고 있습니다.

비디오: Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

아쿼틱 시스템에서 바이러스 생산 요금 예측

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

연구

면역학 및 감염병학

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

B 세포의 재조합 생산 및 Retroviral 감염

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

실험자가 면역 뇌척수염 연구 간단하고 효율적인 생산 및 마우스 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질의 정제

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.