우리는 특히 마커스 뮐러, 실비아 Münstermann, 바바라 Liebetrau와 맨디 Roscher에서 DKFZ 바이러스 생산과 개발 단위의 팀을 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 교육과 연구 (BMBF)와 Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle 뒤 그랜드 - 예상 응용 Tumour 바이러스학의 공동 프로그램의 프레임 워크의 Helmholtz 협회의 연방 교육부에서 교부금에 의해 지원되었습니다.

biosafety 레벨 2 연구실은 재조합 parvoviruses (recPV)의 생산을 위해 필요합니다. 프로토콜은 두 가지 부분으로 세분화됩니다. 첫 번째 부분은 (transfection 통해 recPV 생산) 프로토콜의 두 번째 부분 (감염을 통해 recPVs 생산)에 inoculum 역할 recPVs의 최소한의 금액을 생산하는 데 필요합니다. 일단 recPVs의 작은 금액은 프로토콜의 첫 번째 부분을 생략할 수 있고, 생산하고 있으며, 재조합 파르 보 바이러스는 아데노 바이러스 헬퍼를 통해 파르 보 바이러스 capsid 단백질 (아래)에 대한 유전자 인코딩을 제공 감염을 통해 증폭하실 수 있습니다. 1. Transfection 통해 recPVs 생산 1.1 바이러스성 DNA의 transfection 그것도 양이온 lipids 또는 인산 칼슘을 기반 프로토콜의이 섹션에있는 기존의 DNA transfection 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 Fugene H를 사용차원 Transfection 시약. transfection 효율을 제어하려면, 우리는 플라스미드 표현 향상된 녹색 형광 단백질 (예 : pEGFP-N1, Clontech)를 추가로 플레이트 transfecting을 권장합니다. 세포 인구의 50 % 이상은 EGFP 양성 24시간 transfection 후 결과 때 Transfection은 효율 및 바이러스 생산을위한 최적 간주됩니다. <ol><li> transfection 당일 50 % 세포 confluency 구하는 10cm 접시에서 transfection, 씨앗 2,000,000 HEK293T 전지 전 일일. 10% 태아 소 혈청, 2 개의 MM L-글루타민, ML 페니실린 당 100 U 및 100 μg / ML의 스트렙토 마이신의 추가와 함께 Dulbecco의 수정일 독수리 중간 (DMEM)의 10 ML에서 세포를 성장. </li><li> 1.5 ML 관에서 바이러스 제작 혼합물을 (1시 2분 1초 어금니 비율) 준비 : <ol class="lalpha"><li> recPV 벡터 3 μg 관심의 transgene (전자 통합 phH-1-GFP 6) 숨겨주. </li><li> 벡터 pCMV / 부사장 5 6 μg는 파르 보 바이러스의 capsid 유전자 단위를 숨겨주 </li><li> 8 μg OF 아데노 바이러스 파생 헬퍼 플라스미드 pXX6 7. </li></ol></li><li> 850 μl (20 μl / NG의 최종 농도)에 혈청이없는 배지 최대로 plasmids 믹스를 희석. </li><li> 42.5 μl Fugene HD을 (μg의 DNA 2.5:1 비율 μl의 Fugene) 추가합니다. 매체에 Fugene을 추가할 때 튜브의 측면을 만지지 마십시오. </li><li> 5-10초 대한 부드럽게 소용돌이. </li><li> 30 분간 실온에서 혼합되어 알을 품다. </li><li> transfection의 혼합물 셀에 드롭 지혜를 추가합니다. 균등에 걸쳐 혼합 배포 부드럽게 접시를 흔들어. </li></ol> 1.2 바이러스 생산 <ol><li> 수확 전에 72 시간 92% 습도 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 품어. 이 기간 동안 자손의 파르 보 바이러스 입자는 파르 보 바이러스의 plasmids에서 형성된다. </li></ol> 1.3 바이러스 수확 <ol><li> 조직 문화 후드에서 15로 접시에서 정학을, 그들의 매체 내의 세포를 밀고 대기음 및 전송ML 플라스틱 튜브. </li><li> 상온에서 5 분 250 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 뜨는의 95 %를 제거합니다. </li><li> 와동 튜브 부드럽게 남은 뜨는 (0.5에 대한 ML)에 펠렛을 resuspend합니다. </li><li> -80에서 튜브를 고정 ° C. 그것은이 단계에서 생산을 중단하거나 프로토콜을 계속하는 것이 가능합니다. </li><li> 현탁액을 서리를 없애다하고 실온에서 가져옵니다. </li><li> 37 따뜻한 물에 액체 질소 욕조, 해동에 서스펜션을 고정 ° C. 와동 노골적인 협상을 15 초 및 냉동 해동 사이클 추가로 두 번 반복 튜브. </li><li> 4에서 15 분에 해당하는 16,000 XG에 튜브를 원심 ° C. </li><li> 새로운 튜브로 뜨는 수집합니다. 이 단계에서 튜브 원유 바이러스 추출물 준비가 포함되어 있습니다. </li><li> 바이러스 적정 (아래)을 진행합니다. GFP 유전자를 나르는 recPV 들어, 일반적인 생산은 약 1 ~ 대응 1-3 X 10 7 바이러스성 전염성 단위를 제공한다 -3 * 10 10 바이러스성 게놈은 입자를 포함하는. </li></ol> 1.4 바이러스 저장 <ol><li> 장기 보관의 경우 -80에서 원유 바이러스 추출물이 들어있는 튜브를 고정 ° C. 이 프로토콜의 두 번째 부분에 inoculum 등 원유 바이러스 추출물을 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2. 감염을 통해 recPVs 생산 감염을 통해 recPV 생산부터 시작하기 전에, 생산 및 아데노 표준 프로토콜 여덟에 따라 파르 보 바이러스 부사장 유전자 (AD-부사장 헬퍼, 5에서 설명)을 들고 5 정화. 또한 관심의 transgene을 (예를 들어, 위에서 설명한대로 transfection을 통해 생산) 휴대 recPVs의 최소한도 필요합니다. 아래, 우리는 175cm 두 플라스크 (T175) 형식으로 recPV 생산을 설명합니다. 이렇게 생산되는 바이러스 주식 더 증폭은 10 다층 CellSTACK 문화 챔버 (코닝)에 실시됩니다프로토콜의 사소한 조정 제안과 함께. 2.1 감염 <ol><li> 감염의 날에 60~80% 세포 confluency 구하는 T175 플라스크에 감염, 플레이트 10,000,000 NB324K 전지 전 일일. 컨트롤과 같은 세포의 같은 수의 (비 감염된 세포를) 포함하는 두 번째 플라스크를 준비합니다. 각 T175은 5 % 태아 소 혈청, 2 개의 MM L-글루타민, ML Penicilin 당 100U과 100 μg / ML 스트렙토 마이신과 보완 최종 볼륨으로 최소 필수 중간 (MEM)의 20 ML이 있어야합니다. </li><li> 다음날 아침 구성된 2 ML 플라스틱 튜브에 바이러스 혼합물을 준비 : <ol class="lalpha"><li> 감염의 다수 (입니다만, 전염성 단위 / 셀)에서 AD-VP-헬퍼 5 = 10 (1 X 10 8 전염성 단위에 해당); </li><li> 입니다만에서 recPVs = 0.5 (5 × 10 6 전염성 단위에 해당). MEM으로 1.5 ML을 완료합니다. </li></ol></li><li> T175 플라스크 중 하나에서 전체 바이러스 혼합물을 적용합니다. </li><li> 을 품어37 2 시간 용 플라스크는 ° C, 92 %의 습도가 5 % CO 2 부드럽게 매 15 분 흔들어. </li><li> 37 이상 20-24 시간 동안 품어 ° C, 92 %의 습도 5 % CO 2. </li><li> 신선한 매체와 문화 매체를 교체합니다. </li></ol> 2.2 바이러스 생산 48 시간 동안 92% 습도와 5 % CO 2와 37 ° C에서 flasks을 품어. 효율적인 바이러스 생산은 표시대로, 세포 독성의 명확한 징후는 36~48시간 후 감염을 시작, 바이러스 감염된 세포가 들어있는 플라스크에서 관찰되어야한다. 2.3 바이러스 수확 <ol><li> 조직 문화 후드에서 기음과 50 ML의 원심 관에 플라스크에서 배지 표면에 뜨는을 전송. </li><li> 1.5 ML PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 0.25 % Trysin-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 1.5 ML과 세포 Trypsinize. 제거 매체에 세포 현탁액을 추가합니다. </li><li> 객실 기질에서 5 분 5,000 XG의 세포 표면에 뜨는을 원심 분리기ature. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 세포 펠렛과 부드럽게 소용돌이 세포 resuspend하는 튜브에 TE 버퍼 1 ML (1 MM 트리스-HCL, 0.1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.7) 추가합니다. </li><li> 37 따뜻한 물에 액체 질소 욕조, 해동에 세포 현탁액을 고정 ° C. 15 초 용 튜브 적극적으로 소용돌이와 동결 - 해동주기를 세 번 반복합니다. </li><li> 세포 게놈 및 비 포장 바이러스 DNAs을 소화하기 위해 37 30 분 50 U / ML Benzonase Nuclease ° C와 세포 현탁액을 취급합니다. </li><li> 4에서 20 분 동안 5,000 XG에 튜브를 원심 ° C. </li><li> 새로운 튜브로 뜨는 수집합니다. 이 단계에서 뜨는가 조강 바이러스 추출물 준비가 포함되어 있습니다. recPV-GFP의 일반적인 수율이 프로토콜 1-10 X 10 8 바이러스성 전염성 단위의 범위에 있어야 다음을 생산했다. </li></ol> 2.4 바이러스 저장 <ol><li> 4 ° C.의 단기 저장을위한 (최대 2 개월), 상점 바이러스 </li><li> 경도의 경우-80에서 g 기간 스토리지 (이상 2 개월), 상점 바이러스 ° C. </li></ol> 3. RecPV 정화 <ol><li> 원유 lysates에서 recPVs의 정화에 대해서는 Zolotukhin 외 따라 Iodixanol discontinous 기울기를 실행하는 것이 좋습니다. 9. 우리는 효율적인 바이러스 정화를위한 원유 바이러스성 추출물 (5 T175 flasks 생산에서 얻은) 5 ML 최소를 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. 재조합 파르 보 바이러스 적정 <ol><li> 엘 - Andaloussi 외에 설명된대로 recPV 적정 수행 5. </li></ol> 5. 품질 제어 <ol><li> NB324K 표시기 세포에서 파르 보 바이러스 플라크 분석 수행 원치 않는 복제를 관할 바이러스 (RCV)의 존재를 확인하기 위해 엘 - Andaloussi 외 5.에 설명된 프로토콜을 사용합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 recPVs productio의 예N 아데노 바이러스 게놈 요소의 유무에 transfection을 통해 그림 3에 표시됩니다. 세포 phH-1-GFP (recPV가 GFP 유전자를 숨겨주) 또는 phH-1-루시페라제 (recPV는 반딧불의 루시페라제 유전자를 숨겨주)와 함께 pCMV / 부사장 (VP의 파르 보 바이러스 capsid 단백질에 대한 유전자 인코딩을 나르는 플라스미드)로 transfected되었다 와 (+ pXX6) 또는없는 (-pXX6) pXX6 플라스미드 (아데노 바이러스를 운반 E2A, E4 (orf6) 및 VA RNA의 유전자). 원유 세포 추출물의 평등 볼륨은 엘 - Andaloussi 외에 보도된대로 셀 및 GFP를 형질 도입이나 루시페라제 assays이 수행되었다. 5 NB324K 적용되었습니다. recPVs 생산 명확 증가는 우리의 방법 (그림 3A, B)에 따라 얻은 약 5 튜브 / 감방으로 기존의 프로토콜에 따라 생산 0.3 GFP transductional 단위 (TU) / 세포에서 증가로 pXX6의 면전에서 얻은 얻은 것입니다. recPV producti의 상당한 증가 (24 배 정도)에서 또한 phH-1-루시페라제 (그림 3C)의 경우에서 관찰되었다. 이러한 결과는 pXX6에 포함된 유전 물질이 파르 보 바이러스 생산을 증대 수 있음을 나타냅니다. 감염을 통해 recPVs 생산의 대표적인 예제는 그림 4에 표시됩니다. NB324K 전지는 다양한 recPVs (같은 그림에 표시된)와 AD-VP-헬퍼 (PV 부사장 capsid 단백질에 대한 유전자 인코딩을 품고)와 함께 공동 감염되었다. 최대 AD-부사장 도우미 더욱 향상된 recPV 생산에&gt; 바람직하지 복제 능력이 바이러스성 입자 (그림 4B)의 발생을 증가하지 않고 씨앗을 품고 세포 당 70 TU (그림 4A). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" /> 1 그림. 벡터는 자율 parvoviruses에 기초. () 홈 : transgene은 부사장 코딩하는 유전자의 일부를 대체하고 바이러스 발기인 P38의 통제하에있다. NS1 / 2 유전자가 다시있다tained과 그 표현은 바이러스성 발기인 P4에 의해 제어됩니다. 벡터 게놈은 복제와 재조합 게놈의 패키징에 필요한 CIS-연기 요소를 포함 parvoviral ITRs, 어귀 있습니다. 하단 : 플라스미드 (예 CMV.) 중 heterologous 또는 autologous (예 : P38.) 발기인 (PX)에서 VP-유전자를 나르는 구조 유전자의 장애 보상하기 위해 재조합 파르 보 바이러스 제작 중에 트랜스에 공급됩니다 재조합 게놈 인치 ITR, 거꾸로 터미널 반복. 그림 4에서 적응. recPVs의 생산에 사용되는 고전적인 프로토콜의 (B) 도식보기. HEK293T 세포 transiently 바이러스성 DNA (벡터 및 헬퍼 plasmids)와 함께 3 일 후에 transfected하고 세포를 모으고 바이러스가 수확됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" /> 그림 2. 함께 recPVs 생산광고 - 부사장의 도움이됩니다. recPV 및 광고 - 부사장 genomes의 () 도식지도. recPV은 부사장 지방의 일부를 대체 heterologous transgene이 포함되어 있습니다. AD-부사장은 파르 보 바이러스 부사장 유전자을 비호.이 원고에 기술된 프로토콜의 (B) 도식보기. NB324K 전지는 recPV 및 광고 - 부사장 바이러스와 공동 감염됩니다. 삼일 전지는 수확 및 recPV 입자는 세포 lysate로부터 복구 후. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" /> 그림 3. 아데노 바이러스 기반 plasmids pXX6 의한 recPV 생산의 자극. 10cm 접시에 놓는 HEK293T 세포는, recPVs을 생산 phH-1-GFP (A와 B) 또는 phH-1-루시페라제 (C)와 함께 pCMV / 부사장으로 transfected되었다. 동시에 세포가 아데노 파생 헬퍼 plasmids pXX6 말거나 같은 지적과 함께 공동 transfected되었다. 사흘 후 transfection, 세포의 세 동결과 해동 사이클에 의해 수확 및 lysed되었습니다. crud의 균등 권전자 바이러스 추출물이 표시등 세포를 NBK 적용되었으며, 형질 도입의 assays가 실시되었다. () 합류 NB324K의 monolayers 내에서 GFP 양성 세포를 보여주는 대표 micrographs 있습니다. (B) GFP를 형질 도입의 assays의 부량는 씨앗을 품고 세포 당 형질 도입 단위 (TU)로 표시 . (C) 루시페라제 활동의 부량 상대 루시페라제 단위 (RLU)로 표현. 엘 - Andaloussi 외에 설명된대로 루시페라제 분석이 수행되었다. 5. 열 세의 평균 값은 표준 편차 바와 복제 나타냅니다. + pXX6 칼럼의 맨 위에 숫자에서는 (B 및 C)없이 적어 넣은 pXX6의 면전에서 얻은 recPV 바이러스 titers의 배 증가를 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" /> 4 그림. 재조합 AD-부사장 도우미 바이러스에 의한 recPV 생산의 자극. () NB324K 세포가 infec 있었다다음 입니다만 10시 정화 AD-부사장 도우미 바이러스 (광고-X 단위 / 셀, Adeno-X 신속한 Titer Kit에 titrated)와 테드, 다음과 같은 재조합 파르 보 바이러스 치 HH-1-EGFP 11 (0.1 자중 superinfected TU는 / 휴대폰) 또는 H-1-GFP (0.5 TU / 셀) 5. 어느 날 이후의 감염, 매체가 변경되었고 이틀 후, 세포가 수집되었다 세 냉동 및 해동 사이클을 통해 lysed. 원유 세포 추출물은 엘 - Andaloussi 외에 따른 도입 분석하여 바이러스 titers를 결정하는 데 사용되었다. 5. TU, 형질 도입 단위. (B) AD-부사장 부재의 면전에서 생산되는 바이러스성 배치는 NB324K 표시등 세포에 플라크 분석하여 복제 능력이 바이러스성 입자 (RCV) 자신의 콘텐츠를 분석했다.

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우리는 공개 할게 없다.

우리는 recPV 생산은 adenoviral 게놈 요소의 존재에 의해 향상될 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 transfection 통해 아데노 바이러스 게놈 요소를 제공함으로써 관련 recPV와 함께 광고 - 부사장 - 도우미와 100 개 이상의 접이식 공동 감염 세포에 의해 10 개 이상의 배 (0.3-5 TU / 셀)에 의해 recPV 수율을 증가 기존의 프로토콜에 비해. 프로토콜은 더욱 아데노 바이러스 게놈 요소의 전달 및 감염에 사용하?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 시그마 </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> 시그마 </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Foetal 소 혈청 </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> 로슈 </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> 시그마 </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X 신속한 Titer 키트 </td><td> Clontech </td><td> 632,250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

같은 쥐 H-1PV 및 MVM 등 설치류의 parvoviruses은 (PV), 작은 icosahedral, 단일 좌초된, DNA 바이러스입니다. 그들의 게놈은 각각 한 비 구조 (NS1과 NS2)과 capsid 단백질 (VP1과 VP2)의 표현을 조절이 발기인 P4와 P38을 포함합니다. 그들은 oncolytic 및 oncosuppressive 능력에 대한 anticancer 대리인의 인간 2 비 병원성하면서로서 높은 관심을 끌. NS1 바이러스는 세포 독성의 3 대 이펙터입니다. 추가로 천연 antineoplastic 활동을 강화하기 위해서는 이러한 벡터로부터 파생은 치료 transgene (예 : 세포 독성 폴리펩티드, 시토킨, 케모카인, 종양 억제 유전자 등) 4 capsid 단백질에 대한 유전자 인코딩 교체에 의해 생성되었습니다. 재조합 parvoviruses (recPVs)는 벡터가 NS1 / 2 코딩 시퀀스 및 바이러스성 DNA의 증폭 및 패키징에 필요한 PV의 게놈 telomeres을 유지합니다. 생산recPVs 단지별로 생산 세포 (일반적으로 HEK293T)에서 발생하는 공동 transfecting 부사장 단백질에 대한 유전자 인코딩 (그림 1) 4을 표현 두 번째 벡터 (pCMV-VP)으로 세포를. 이렇게 생성된 recPV 벡터는 복제에 결함이 있습니다. recPVs 그들이 생성되어있는 부모의 바이러스에 대하여 강화된 oncotoxic 활동을 소유 입증했지만, 그들의 생산을 주요 과제 남아 강력하게 안티 - 암 임상 응용에 이러한 에이전트의 사용을 hampers. 우리가 사용하는 다른 프로토콜에 비해 이상 10 배 이상으로 recPVs의 생산을 향상 HEK293T로 E2a, E4 (orf6) 및 VA RNA의 유전자 (예 : pXX6 플라스미드)를 포함하는 광고-5 파생된 벡터의 도입을 발견. 이 연구 결과를 바탕으로, 우리는 recPVs 생산을 강화하는 데 필요한 게놈 adenoviral 요소뿐만 아니라 parvovir 포함되어 AD-VP-헬퍼 소설을 만들었저희 부사장 유전자 단위 5. AD-VP-헬퍼의 사용은, 레크 리에 - 베트남 후 증후군의 생산 ((예 NB324K) 가능 transfect하기 어려운 세포 라인의 활용, 바이러스성 감염 단계 (같은 플라스미드 transfection 반대)에 전적으로 의존 프로토콜을 사용하여 수 그림. 2). 우리는 크게 최종 제품 5 품질에 영향을 미치지 않고, 생산 시간 및 비용을 모두 절감, 생산 재조합 바이러스의 양을 향상 방법을 제시한다. 또한, recPV의 대규모 생산은 (현탁액 세포와 bioreactors에서) 지금 생각할 수있다.

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Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

여기에는 오직 사용중인 다른 프로토콜에 비해 100 개 이상의 배 이상에 의한 재조합 파르 보 바이러스 생산의 효율성을 향상시켜 세포 감염에 기반 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 파르 보 바이러스의 부사장의 전송 단위 (광고-VP)를 포함하는 5-기반 도우미 소설 아데노 바이러스의 사용에 의존하고 있습니다.

아데노 바이러스 파생 시스템의 도움으로 효율적인 재조합 파르 보 바이러스 생산

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

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Immunology and Infection

10.9K 조회수.  German Cancer Research Center (DKFZ). 여기에는 오직 사용중인 다른 프로토콜에 비해 100 개 이상의 배 이상에 의한 재조합 파르 보 바이러스 생산의 효율성을 향상시켜 세포 감염에 기반 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 파르 보 바이러스의 부사장의 전송 단위 (광고-VP)를 포함하는 5-기반 도우미 소설 아데노 바이러스의 사용에 의존하고 있습니다.

비디오: Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

생체공학

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both as an oncolytic virus and a viral-vectored vaccine. NDV is an attractive therapeutic and prophylactic agent due to its well-established reverse genetics system, potent immunostimulatory properties, and excellent safety profile. When administered as an oncolytic virus or a viral-vectored vaccine, NDV elicits a robust antitumor or antigen-specific immune response, activating both the innate and adaptive arms of the immune system. 
Given these desirable characteristics, NDV has been evaluated in numerous clinical trials and is one of the most well-studied oncolytic viruses. Currently, there are two registered clinical trials involving NDV: one evaluating a recombinant NDV-vectored vaccine for SARS-CoV-2 (NCT04871737), and a second evaluating a recombinant NDV encoding Interleukin-12 in combination with Durvalumab, an antiPD-L1 antibody (NCT04613492). To facilitate further advancement of this highly promising viral vector, simplified methods for generating high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV) are needed. 
This paper describes a detailed procedure for amplifying rNDV in specified pathogen-free (SPF) embryonated chicken eggs and purifying rNDV from allantoic fluid, with improvements to reduce loss during purification. Also included are descriptions of the recommended quality control assays, which should be performed to confirm lack of contaminants and virus integrity. Overall, this detailed procedure enables the synthesis, purification, and storage of high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogenic, and mesogenic NDV for use in preclinical studies.

Here we provide a detailed procedure for production, purification, and quantification of high-titer recombinant Newcastle disease virus. This protocol consistently yields &#62; 6 &#215; 109 plaque-forming units/mL, providing virus quantities appropriate for in vivo animal studies. Additional quality control assays to ensure safety in vivo are described.

Allantoic Fluid로부터의 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

암 연구학

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

아데노 바이러스 혈청 형 5 된 벡터 백신 접근 방법의 개발을위한 항원 캡시드-설립 전략을 활용

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types and organs. However, recombinant adenoviral technology is laborious, time-consuming, and expensive. Here, we present an improved protocol using the pAdEasy system to obtain purified adenoviral particles that can induce a strong green fluorescent protein (GFP) expression in transduced cells. The advantages of this improved method are faster preparation and decreased production cost compared to the original method developed by Bert Vogelstein. The main steps of the adenoviral technology are: (1) the recombination of pAdTrack-GFP with the pAdEasy-1 plasmid in BJ5183 bacteria; (2) the packaging of the adenoviral particles; (3) the amplification of the adenovirus in AD293 cells; (4) the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium; and (5) the viral titration and functional testing of the adenovirus. The improvements to the original method consist of (i) the recombination in BJ5183-containing pAdEasy-1 by chemical transformation of bacteria; (ii) the selection of recombinant clones by &#8220;negative&#8221; and &#8220;positive&#8221; PCR; (iii) the transfection of AD293 cells using the K2 transfection system for adenoviral packaging; (iv) the precipitation with ammonium sulfate of the viral particles released by AD293 cells in cell culture medium; and (v) the purification of the virus by one-step cesium chloride discontinuous gradient ultracentrifugation. A strong expression of the gene of interest (in this case, GFP) was obtained in different types of transduced cells (such as hepatocytes, endothelial cells) from various sources (human, bovine, murine). Adenoviral-mediated gene transfer represents one of the main tools for developing modern gene therapies.

Here, we present a protocol for adenovirus production using the pAdEasy system. The technology includes the recombination of the pAdTrack and pAdEasy-1 plasmids, the adenovirus packaging and amplification, the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium, the viral titration, and the functional testing of the adenovirus.

아데노바이러스 생산을 위한 효율적인 방법

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian and avian host species, including humans. With the recent advent of rotavirus reverse genetics systems, it has become possible to use directed mutagenesis to explore rotavirus biology, modify and optimize existing rotavirus vaccines, and develop rotavirus multitarget vaccine vectors. In this report, we describe a simplified reverse genetics system that allows the efficient and reliable recovery of recombinant rotaviruses. The system is based on co-transfection of T7 transcription vectors expressing full-length rotavirus (+)RNAs and a CMV vector encoding an RNA capping enzyme into BHK cells constitutively producing T7 RNA polymerase (BHK-T7). Recombinant rotaviruses are amplified by overseeding the transfected BHK-T7 cells with MA104 cells, a monkey kidney cell line that is highly permissive for virus growth. In this report, we also describe an approach for generating recombinant rotaviruses that express a separate fluorescent reporter protein through the introduction of a 2A translational stop-restart element into genome segment 7 (NSP3). This approach avoids deleting or modifying any of the viral open reading frames, thus allowing the production of recombinant rotaviruses that retain fully functional viral proteins while expressing a fluorescent protein.

Generation of recombinant rotaviruses from plasmid DNA provides an essential tool for the study of rotavirus replication and pathogenesis, and the development of rotavirus expression vectors and vaccines. Herein, we describe a simplified reverse genetics approach for generating recombinant rotaviruses, including strains expressing fluorescent reporter proteins.

리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 회수하는 역유전학 방법 간소화

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.