루마니아 부쿠레슈티에서 세포 생물학 및 병리학 연구소, 니콜라 시미오네스쿠에 오신 것을 환영합니다. 여기에 바이러스 성 트랜스 유도 실험실에서, 우리는 교수 Vogelstein에 의해 개발 된 AdEasy 시스템을 기반으로 최적화 된 방법론을 사용하여 아데노 바이러스 입자 생산의 일부를 보여줍니다. 이 아데노바이러스를 제조하기 위한 기술의 주요 단계는, 하나, BJ5183 박테리아에서 pAdEasy-1 플라스미드와 GFP를 포함하는 pAdTrack의 재조합이다.
둘째, 아데노바이러스 입자를 포장합니다. 3, AD293 세포에서 아데노 바이러스의 증폭. 4, 세포 용해 및 배양 배지로부터 아데노바이러스 입자의 정제.
아데노바이러스의 5가지, 바이러스 성적 및 기능성 테스트. 여기서 우리는 방법론의 중요한 단계를 제시할 것입니다. 세포 용해 및 배양 배지로부터 아데노바이러스 입자의 정제.
아데노바이러스의 정제는 바이러스 생성 세포와 배지를 수확하는 것으로 시작됩니다. AD293 세포는 재조합 플라스미드로 전감염되었고 아데노바이러스가 포장됨에 따라. 그런 다음 아데노 바이러스는 연속적인 더 큰 문화에 의해 증폭되었다.
여기서, 우리는 25 T175 플레이트를 획득하고, 세포 용해 및 배양 배지로부터 아데노바이러스의 정화를 시작했다. 먼저, 우리는 변환된 세포에 의해 발현된 GFP의 녹색 형광을 검사했습니다. 세포가 여전히 부착되어 있는 경우, 우리는 배양 접시를 두드리거나 긴 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리합니다.
세포와 배지는 수집된다. 플라스크는 팔콘 튜브에서 수집되는 PBS로 세척됩니다. 세포는 원심분리에 의해 펠릿화됩니다.
아데노 바이러스의 추가 정화를 위한 매체뿐만 아니라 세포 펠릿을 보관하십시오. 이 단계에서, 동료의 도움은 수확 과정을 가속화하기 위해 잘 평가된다. 세포 펠릿은 GFP 발현으로 인해 녹색입니다.
펠릿은 세포의 중단을 용이하게 할 초토닉 Tris 버퍼에서 다시 중단됩니다. 세포 용해의 경우 액체 질소와 최대 37도까지 예열된 건조 가스를 사용합니다. 바이러스가 손상될 것이기 때문에 3 주기 이상을 수행하지 마십시오.
세포 중단의 효율을 높이기 위해 23 게이지 주사기 바늘을 통해 세포를 균질화하여 조심스럽게 전달한다. 원심 분리는 12 분 동안 9, 600 x g에서 셀 용액을 분리합니다. 새로운 튜브에 상체를 전달하고 펠릿을 폐기합니다.
초원심분리기로 추가 처리를 위해 얼음 위에 상체를 보관하십시오. 지금, 우리는 세포에서 풀어 놓인 아데노바이러스를 격리하기 위하여 배양 배지를 처리합니다. 이를 위해, 먼저, 필요한 양의 황산암모늄에 무게를 두고 배양 배지가 수집된 병에 첨가합니다.
병은 결정이 완전히 녹을 때까지 격렬하게 흔들립니다. 혼합물은 2 시간 반 동안 실온에서 배양됩니다. 그런 다음 침전물의 현탁액은 팔콘 튜브로 나뉩니다.
원심 분리기는 1, 600 x g에서 15 분 동안. 원심분리 후, 상체는 폐기되고 펠릿은 10 밀리머 트리 버퍼로 재장매된다. 극심분리 단계로 아데노바이러스의 정화를 계속할 수 없는 경우, 침전은 4도에서 며칠 동안 보관될 수 있지만 투석 후에야 황산암모늄을 제거한다.
여기, 우리는 투석 단계를 제시했다. 우리는 이전에 젖은 카세트에 서스펜션을 소개하기 위해 주사기를 사용합니다. 샘플은 4도에서 하룻밤 사이에 10 밀리머 트리스 버퍼에 대해 투석됩니다.
정화의 마지막 단계는 염화물 불연속 그라데이션에 대한 초원심분리 단계에 의해 표현된다. 그라데이션을 형성하기 위해 먼저, 염화물 세슘의 고밀도 용액의 3 밀리리터를 피펫합니다. 이 층 위에, 부드럽게 저밀도 세슘 염화제의 세 밀리리터를 부어.
세포 리세이트 또는 배양 배지에서 아데노바이러스 입자 현탁액은 그라데이션 위에 오버레이됩니다. 튜브는 미네랄 오일로 채워져 있으며 SW41 버킷에 도입됩니다. 평형 후, 튜브는 초원심분리기에서 도입되는 로터에 대칭적으로 적재됩니다.
원심분리기는 35도, 000RPM, 4도를 18시간 동안 쉬지 않고 실행합니다. 초원심분리 후, 튜브는 밴드를 수확하기 위해 뒤에 검은 종이가있는 스탠드에 배치됩니다. 투명한 상층과 세포 파편은 표백용폐기물 용기에 버려져 있습니다.
완전한 아데노바이러스를 포함하는 가장 낮은 밴드는 파이펫 끝으로 수확되어 멸균 된 Eppendorf 튜브에서 수집됩니다. 투석 후, 자당은 바이러스 현탁액에 4%의 최종 농도로 첨가되고 바이러스 성 알리쿼트는 영하 80도에서 동결유지됩니다. 결과 섹션에서, 우리는 얻어진 아데노바이러스로 변환된 세포에서 GFP 발현을 보여주었다.
48 시간 전도 후, GFP는 형광 현미경 검사법에 의해 도시된 바와 같이 전이 된 세포에 의해 발현된다. GFP 발현 세포의 백분율은 유동 세포측정에 의해 결정됩니다. 세포당 25개의 트랜스듀션 단위로 변환된 인간 및 소 내피 세포의 약 50%는 GFP 양성이다.
동일한 트랜스듀션 수율은 소명 간세포에 대해 수득하였고, 셀당 5개의 트랜스듀션 유닛만 사용되었지만, 이는 세포 민감성으로 인한 사망률이 높은 것과 관련이 있다. GFP 발현으로 감소된 것은 특정 수용체의 낮은 발현으로 인한 중간엽 기질 세포의 전이에 의해 얻어졌다. 결론적인 발언.
우리는 아데노바이러스 입자를 얻는 데 필요한 시간, 비용 및 노력을 줄이기 위해 이러한 힘든 기술을 최적화합니다. 준비된 아데노바이러스는 다양한 세포 유형을 감염시키고 관심 있는 유전자의 발현을 유도할 수 있다.
