이 프로토콜은 재조합 로타바이러스를 만들기위한 신뢰할 수있는 효율적인 역 유전학 시스템을 설명합니다. 또한 형광 마커 단백질을 표현하는 재조합 로타바이러스를 만드는 방법에 대해서도 설명합니다. 이 방법은 플라스미드의 최소한의 수를 요구하는 간단하고 별도의 불소 단백질뿐만 아니라 바이러스 성 단백질을 표현하는 재조합 로타바이러스를 생성 할 수 있습니다.
먼저 BHKT7 세포를 12웰 플레이트에 시드합니다. PBS를 가진 세포의 갓 컨할 수 있는 단층을 헹구는 다. 그런 다음 트립신-EDTA 용액으로 단층층을 방해하고 GMEM 완성 배지의 5밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.
트라이판 블루와 자동 셀 카운터를 사용하여 실행 가능한 BHKT7 세포의 농도를 결정합니다. 그런 다음 12웰 세포 배양 판의 각 웰에 GMEM의 1 밀리리터에서 다섯 번째 세포에 두 번 10을 종자. 하룻밤 사이에 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
다음 날, 원고 의 지시에 따라 트랜스포밍을 위해 플라스미드 혼합물을 준비한다. 그런 다음 미리 따뜻워진 감혈제 110마이크로리터를 각 플라스미드 혼합물에 넣고 부드럽게 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 혼합물에 32 마이크로리터의 트랜스페션 시약을 추가합니다.
소용돌이 다음 간단한 원심 분리를 하고 실온에서 20분 동안 배양하십시오. 한편, GMEM 불완전 배지의 2밀리리터로 BHKT7 세포를 헹구는다. 각 웰에 SMEM 불완전 한 매체의 밀리 리터 1 밀리리터를 추가하고 인큐베이터에 접시를 반환합니다.
20 분 인큐베이션 후, 200 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 각 우물에 드롭하여 경피 혼합물을 추가합니다. 부드럽게 접시를 흔들어 인큐베이터로 돌아갑니다. 2 일 후 형질 전환, PBS와 MA104 세포의 갓 confluent 단층 헹구기.
트립신-EDTA 용액으로 단층층을 방해하고 DMEM 의 5밀리리터 의 5밀리리터에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 세포를 계산하고 DMEM 불완전 배지의 밀리리터 당 다섯 번째 세포에 8배 10으로 농도를 조절한다. MA104 세포의 0.25 밀리리터를 트랜스감염된 BHKT7 세포로 우물에 떨어뜨립니다.
각 웰에 밀리리터 트립신 스톡 솔루션당 1밀리그램에 0.8 마이크로리터를 추가하여 트립신 농도를 밀리리터당 0.5 마이크로그램으로 조정합니다. 남은 MA104 세포를 DMEM에서 밀리리터당 5번째 세포에 1.5배 10배 의 농도로 희석하고 6웰 플레이트의 각 웰에 2밀리리터를 배치한다. 형질 전환 후 6 일, 전감염된 세포에서 재조합 바이러스를 복구.
BHKT7 MA104 세포를 멸균 조건하에서 동결/해동3사이클로 조절하여 음의 섭씨 20도및 실온 사이에서 플레이트를 이동시합니다. 리스를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기. 원심 분리는 500 배 g와 4섭씨에서 10 분 동안 튜브를 분리하여 세포 파편을 펠렛합니다.
상체를 수집하고 섭씨 4도에 보관하십시오. 트립신을 100 마이크로리터의 정제 된 세포 용액에 밀리리터 당 10 마이크로 그램의 최종 농도에 추가하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 혼합물을 배양하십시오. 그런 다음 DMEM 불완전 한 매체에서 음수 7에 10에서 음수 10에 이르기까지 10 배 직렬 희석 계열을 준비합니다.
MA104 단층층을 PBS 2밀리리터로 두 번 헹구고 DMEM 불완전 한 배지로 한 번 헹구는 다. 400 마이크로리터의 용해 희석제를 접시에 복제하여 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양하여 10~15분마다 흔들어 단층층 전체에 희석제를 재분배합니다. 1.5%의 녹아 냉각된 아가로즈와 예열된 2X EMEM의 동일한 볼륨을 결합하여 아가로즈 MEM 오버레이 솔루션을 준비합니다.
이 용액을 수조에서 섭씨 42도에서 유지하고 세포에 배치하기 직전에 트립신 농도를 밀리리터당 0.5 마이크로그램으로 조정합니다. 6웰 플레이트에서 희석을 흡입합니다. 그런 다음 불완전한 배지의 두 밀리리터로 한 번 세포를 헹구는 다.
아가로즈 MEM 오버레이 용액3밀리리터를 각 웰의 셀 모노레이어에 부드럽게 추가합니다. 실온에서 아가로즈가 굳어지게 하십시오. 그런 다음 플레이트를 인큐베이터에 반환합니다.
3 일 후, 이전에 설명 한 바와 같이 아가로즈 MEM 오버레이 솔루션을 준비하고 사용하기 직전에 밀리리터 당 50 마이크로 그램의 최종 농도에 중립 적색을 추가합니다. 6웰 플레이트에 기존 아가로즈 위에 오버레이 용액 2밀리리터를 추가합니다. 아가로즈가 접시를 경화하고 인큐베이터로 돌려보내중립 빨간색으로 판을 빛으로부터 보호하도록 합니다.
다음 6 시간 동안, 라이트 박스의 도움으로 로타 바이러스 플라크를 식별합니다. 일회용 이송 파이펫을 사용하여 명확하게 정의된 플라크를 선택하여 세포 층으로 완전히 확장되는 아가로즈 플러그를 복구합니다. DMEM 불완전 배지의 0.5 밀리리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 플러그를 배출하고 30 초 동안 샘플을 소용돌이.
MA104 단층 또는 AT25 플라스크에 대한 전파에 의해 배지로 용출된 플라크 격리 바이러스를 증폭시키고 DMEM 불완전 배지및 트립신의 밀리리터당 0.5 마이크로그램을 제공합니다. 1.5 밀리리터 마이크로센트심분리기 튜브에 600마이크로리터의 감미로운 감염된 세포 리스와 400마이크로리터의 구안디늄 티오티야네이트를 첨가한다. 30초 동안 소용돌이를 가하고 실온에서 5분간 배양합니다.
그런 다음 클로로폼 200 마이크로리터를 추가합니다. 30초 동안 용액을 소용돌이시키고 3분간 배양합니다. 13, 000배, 섭씨 4도에서 5분간 미세원심분리를 한 후, 상부 수성 상면의 550마이크로리터를 신선한 튜브로 옮긴다.
차가운 이소 프로필 알코올의 두 볼륨을 추가하고 튜브를 4 ~ 6 번 반전. 샘플을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 원심 분리는 13, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 10 분 동안 분리합니다.
RNA 펠릿을 떠나는 상체를 버리십시오. RNA를 튜브에 75%에탄올 1밀리리터를 첨가하여 한 번 반전시키고 7, 500배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리하여 RNA를 세척합니다. 에탄올을 조심스럽게 제거한 후 RNA가 5~10분 동안 건조되도록 하십시오.
그런 다음 펠릿을 15마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터에 녹입니다. 용존 RNA 샘플의 10 마이크로 리터에 6X DNA 로딩 버퍼의 2 개의 마이크로 리터를 추가합니다. 프리 캐스트 10 % 폴리 아크라이알라미드 미니 젤에 로드합니다.
일정한 16 밀리암페어 전류하에서 2시간 동안 트리스 글리신 실행 버퍼에서 전기전도에 의한 RNA를 해결한다. 젤 이 가동이 완료되면 밀리리터 에티듐 브로마이드 당 1마이크로그램을 함유한 물에 5~10분 동안 젤을 담그고 UV 트랜틸루미나이터로 로타바이러스 게놈 세그먼트를 감지합니다. 이 역유전학 프로토콜은 MA104 세포에 플라크 분석으로 쉽게 식별할 수 있는 재조합 SA11 바이러스를 생성하여 플라크 격리를 허용하는 데 사용되었습니다.
플라크 정제 rSA11 야생형 및 SA11-UnaG 바이러스의 dsRNA 게놈은 페놀과 구아니디늄 티오시아네이트를 함유한 용액으로 추출되었으며, 10%의 폴리아크라이글라미드 젤에서 전기전도에 의해 해결되고 에티듐 브로마이드로 염색하여 검출하였다. 예상대로, rSA11-UnaG의 세그먼트 7 또는 NSP3 dsRNA는 2A-3xFLUnaG 서열의 존재로 인해 rSA11 야생 유형보다 훨씬 느리게 마이그레이션되었다. UnaG 형광 단백질의 발현을 확인하기 위해 MA104 세포는 야생 형 및 재조합 바이러스에 감염되어 살아있는 세포 이미저로 검사했습니다.
분석 결과 rSA11-UnaG는 녹색 형광을 발생시켰으며 rSA11 야생 형에 감염된 세포에서 형광이 발견되지 않은 것으로 나타났습니다. 면역블롯 분석은 rSA11-NSP3-2A-xflUnaG의 2A 소자가 두 개의 분리된 단백질의 발현을 촉진했는지 여부를 조사하기 위해 수행되었다. 분석 결과 NSP3-2A 및 3xFL-UnaG는 실제로 기능성 2A 요소를 나타내는 별도의 단백질로 표현되었다는 것을 보여주었다.
재조합 로타바이러스의 성공적인 회복을 위해, 과잉 시식을 위한 고품질, 잘 관리된 BHKT7 세포 및 MA104 세포는 고순수 플라스미드의 정확한 양을 사용하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 로타바이러스 NSP3 유전자를 수정하기 위하여 역 유전학 시스템을 사용하는 방법을 설명하더라도, 동일 접근은 SP1과 같은 그밖 유전자를 수정하기 위하여 이용될 수 있습니다.
