이 작품은 건강 연구를위한 캐나다 연구소 (CIHR) (걸레-97774)과 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC 480,619, 그랜트 NR)에 의해 재정 지원되었다. KS는 KRESCENT 새로운 탐정 수상 (캐나다, 캐나다 신장학 사회와 건강 연구소의 캐나다 연구소의 신장 재단의 공동 수상)와 연구 및 혁신의 온타리오 교육부에서 조기 연구원 상을받는 사람입니다. FW는 리튬 카의 아성 장학금으로 지원됩니다.

1. E.의 변환 pGEX-RhoA (G17A) 구조와 대장균 <ol><li> 100 ML DH이 드에 2.5 g의 LB와 1.5 g 한천을 용해하여 LB-한천을 준비한다 압력솥과 엄지손가락의 규칙으로, 플라스크가 편안하게 개최될 수있는 경우는 약 50-55 ° C로 좋아. </li><li> DH 2 O를 50 밀리그램 / ML을 해소하여 암피실린 (앰프) 재고를 준비 주사기 필터를하고 미사용 aliquots을 동결. 1.1에서 LB-한천로 앰프 주식 100 μl (최종 농도가 50 μg / ML)를 추가합니다. 믹스 앤 10cm 세균성 요리 (15-20 ML / 접시)에 붓는다하는 소용돌이. 그것이 고체화 (15-30 분). 후 2-3 주 동안 4에 반전 미사용 접시 ° C를 저장하도록 허용합니다. </li><li> E를 변환하려면 대장균, 빨리 얼음 욕조에서 DH5α 유능한 세포의 나누어지는을 녹여. 25-50 NG / μl로 희석 pGEXRhoA (G17A) DNA 1 μl를 추가합니다. 30 분간 얼음에 믹스 앤 부화 관 버려. 45초 2 분 동안 다시 얼음 장소 ° C ~ 42시 열충격. 추가 900 &amp; 무; 리터 SOC 매체와 흔들림과 함께 37 ° C에서 한 시간 만이라도 성장. </li><li> 굽​​은 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 LB-한천 - 앰프 플레이트에 변형 박테리아 50-100 μl 뿌리 더군요. 5 분 37 ° C 배양기에 플레이트 오른쪽을 품어 후 인버트와 하룻밤 성장. </li><li> 하나의 식민지는 GST 태그가 추가된 단백질 (단계 2.1)의 준비를위한 접시에서 포착됩니다. 나중에 사용하기 위해, 랩 및 매장 접시는 약 3 주 동안 4 ° C에서 반전. 또한, 세균성 주식은 떨고있는 37 ° C에서 하룻밤 사이에 두 ML 멸균 LB-앰프에서 재배 개별 식민지들이 더 오랫동안 보관 대한 대비를 할 수 있습니다. -80에 1:1 비율 및 동결의 멸균 80 % 글리세롤로 나누어지는를 섞어 ° C. </li></ol> 2. GST-RhoA (G17A) 비즈의 작성 <ol><li> 1 패 DH 2 0으로 25g의 LB를 추가하고 autoclaving하여 LB를 준비합니다. 때 시원하고, 주식 50 ML의 LB (50 μg / ML 최종 농도) 50 μl 앰프를 추가합니다. 잘 격리 열과 예방변형 박테리아의 ony와 교반과 함께 37 ° C에서 하룻밤 성장. 전체 밀도 (OD 600&gt; 1.0)에서 450 ML LB-앰프로 희석 37시 추가로 30 분간 성장할 때 ° C. </li><li> 10 ML DH 2 O.에서 0.238 g을 용해하여 이소 프로필 BD-thiogalactopyranoside (IPTG)의 100 밀리미터 주식 솔루션을 준비 -20 ° C.에 aliquots에 저장 500 ML 문화 (100 μm의의 최종 농도)에 IPTG 500 μl 100 밀리미터를 추가하여 Rho 단백질을 생산하는 박테리아를 유도. 22-24 온도를​​ 줄이고 ° C와 H ~ 16 시간 동안 성장. </li><li> 4 ° C.에 10 분 동안 3,600그램에서 문화를 던가 필요한 경우, 500 ML 문화는 원심 분리 50 ML 튜브로 나눌 수 있습니다. -80 적어도 1 시간 (또는 선호 야간)에 대한 프리즈 펠릿 (들) ° C. </li><li> 20 MM HEPES (0.95 g) / 산도 7.5를 포함하는 200 ML의 용해 버퍼를 준비; 150 MM NaCl (1.75 g), 5 밀리미터 MgCl 2 (0.203 g); 1% TX-100 (2 ML). 1M DTT (10 ML DH 2 O에 1.542 g의 주식 솔루션을 준비)과 100 밀리미터 PMSF (0.174 g/10 ML EtOH). 용해 완충액 +를 준비하려면, 1mM DTT (재고의 10 μl)와 1 ㎜ PMSF (재고의 100 μl)와 하나의 완전한 미니 프로 테아제 억제제의 타블렛을 갖춘 10 ML을 보완. </li><li> 얼음에서 일하는 10 ML의 용해 버퍼를 추가 + 단계 2.3에서 산탄으로. 부드러운 vortexing하고 pipetting에 의해 철저하게 Resuspend. 거품 마십시오. 50 % 펄스로 4 설정에서 1 분 얼음 Sonicate. 4 ° C에서 15 분 동안 15,000-20,000 g에서 sonicated lysate 던가, 그리고 무균 공을 15 ML 관을 명확히 sonicate (뜨는)를 제거하십시오. </li><li> 부드럽게 15 ML 튜브에 75 % 슬러리 및 전송 335의 μl를 포함하는 원래의 튜브를 혼합하여 글루타티온의 세파 로스를 준비합니다. 구슬을 피펫하는 넓은 구멍 팁을 사용하십시오. 10 ML 차가운 PBS를 추가, 4시 5 분 500g를 돌리다 ° C. , 뜨는을 삭제하시겠습니까 비즈 1 ML의 용해 버퍼 +를 추가하고 이전 세차 용으로 돌리다. 50 % 슬러리를 만들기 위해 뜨는하고 추가를 용해 완충액 +를 폐기하십시오. </li><li> equil 250 μl를 추가하십시오2.5 단계에서 뜨는로 비드 슬러리를 ibrated. 45 분 동안 4 ° C에서 회전합니다. </li><li> 20 MM HEPES (2.38 g)을 포함하는 500 ML HBS / 산도 7.5 및 DH 2 O에의 150 MM NaCl (4.38 g)을 준비 1M MgCl 2 (10 ML DH 2 O에서 0.952 g)과 1M DTT (10 ML DH 2 O에서 1.542 G)의 주식 솔루션을 준비합니다. HBS +를 준비하려면, 100 ML을 보완 불과 5 밀리미터 MgCl 2 (주식 50 μl) 1 밀리미터 DTT (재고에서 100 μl)와 함께 사용하기 전에. </li><li> 4 ° C.에서 5 분 500g에서 2.7 단계에서 비즈를 돌리다 10 ML의 용해 버퍼 +와 배 뜨는 및 세차 구슬을 무시, 10 ML HBS +와 2X. 최종 세척 후, HBS의 구슬 + BD BaculoGold 프로 테아제 억제제 (50x BD BaculoGold / ML 20 μl)로 보충을 resuspending하여 50 % 슬러리를 확인하십시오. </li><li> β-메르 캅 토 에탄올을 포함하는 2X Laemmli 샘플 버퍼로 최종 비즈 준비 10 μl를 희석. 소 혈청 알부민 (BSA) 기준을합니다. 2 MG / ML 주식 (1 BSA의 0.02 g 사용0 ML DH 2 O). DH 2 O 10 μl Laemmli (최종 10 μg) 5 μl있는 주식의 5 μl;와 7.5 μl DH 2 O 10 μl Laemmli와 2.5 μl 주식 10 μl Laemmli (최종 20 μg)에 주식의 10 μl를 혼합 (5 μg 최종). 모든 샘플 (5 분) 삶다. 비드 샘플을 돌려서 10 % SDS-polyacrylamide 겔의 BSA 표준과 분자량 마커로 뜨는 실행합니다. </li><li> 그리고 destain 솔루션 (500 ML DH 2 O, 400 ML의 메탄올 및 100 ML 초산) (10 ML 초산, 40 ML의 메탄올과 50 ML DH 2 O에서 0.1 G) Comassie 블루 얼룩을 준비합니다. 상온에서 보관하십시오. 20-30분위한 젤 청바지, 염료를 제거 (가 여러 번 재사 용할 수)와 두 번 destain 솔루션 린스. 밴드 명확하게 볼 때까지 몇 시간 동안 부드러운 진동으로 destain 계속. </li><li> 참조 (그림 2)로 BSA 표준을 사용하여 구슬에 결합 GST-RhoA (G17A)의 농도를 예상됩니다. Aliquo1.5 ML 마이크로 원심 튜브에 ~ 10-15 μg 단백질이 들어있는 구슬을 떠는 동등한 볼륨. 스토어 구슬은 4시 ° C는 하루 이내에 사용하십시오. -80에서 고정 ° HBS의 C 몇 일 이내에 사용하기 위해 3시 1분 비율로 + / - 글리세롤. </li></ol> 3. 뉴클레오 티드가없는 RhoA (G17A) 비즈와 GEF 풀다운 분석 <ol><li> 합류점까지 10cm 접시에 세포를 성장. 세럼은 적어도 3 시간 동안 박탈과 같은 요구 취급. </li><li> 용해 완충액을 준비 + 단계 2.4에서와 같이. 700 μl / 접시 플러스 오류를 pipetting 수 있도록 몇 가지 여분의 양을 충분히 용해 완충액 준비합니다. 단지 사용하기 전에 테아제 억제제를 추가합니다. </li><li> 얼음에서 일하는, 요리에서 배지를 제거하고 얼음처럼 차가운 HBS로 씻는다. 모든 HBS를 제거하고 각 접시에 700 μl 용해 완충액 +를 추가합니다. 모든 영역을 커버하는 소용돌이 모양의 접시는 데리고 번호가 1.5 ML 튜브에 lysates를 수집합니다. 4에 1 분 ° C.에 대해 15,000그램에 스핀 뜨는는 분석을 위해 사용됩니다. </li><li> 당신의 핸드폰 번호가 모두 동등한 경우요리가 테스트되고, 당신은 단백질 분석을하고 생략하고, 3.5 단계로 이동할 수 있습니다. 그렇지 않으면 바이오 방사선 빠른 단백질 분석을 사용하여 각 뜨는의 단백질 농도를 측정하고 볼륨과 집중을위한 뜨는을 맞춰야. 총 단백질의 양은 (LLC-PK1 세포에 대한 일반적 1-1.5 MG 단백질)에 사용되는 세포 유형에 따라 달라집니다. </li><li> Laemmli 샘플 버퍼, 종기를 줄여 30 μl 2X와 함께 각 뜨는 및 혼합 30 μl를 제거하고 단계 3.7에 대해 별도로 설정합니다. 2.12 단계에서 GST-RhoA (G17A) 구슬 aliquots에 남아 supernatants를 추가합니다. 4 ° C.에 45 분 동안 회전 </li><li> 4 ° C.에 10 초 동안 6,800그램에서 염주를 돌리다 뜨는을 취소하고 세차장 사이에 같은 방식으로 방적, 용해 완충액으로 3 배 구슬을 씻는다. 완전 30 G 바늘 들으며 한 CC의 주사기를 사용하여 최종 세척을 제거하고 Laemmli 샘플 버퍼를 줄이는 20 μl 2X를 추가합니다. 5 분 동안 끓여야. 펠렛 비즈로 돌려서 어느 즉시 뜨는을 실행 (바람직) 또는 보관t -80 ° C ~ 나중에 분석을 위해. </li><li> 당신이 공부를하고 GEF의 크기에 적절한 비율을 SDS-polyacrylamide 겔 20 μl 총 세포 lysates와 시켰던 단백질 샘플을 모두 실행합니다. 서양이 특정 항체를 사용하여 모래 바닥하여 선택의 GEF를 감지. </li></ol> 4. 대표 결과 파트 1과 프로토콜의 2 SDS-PAGE (그림 1 프로토콜의 개요 참조)하여 GSH-세파 로스 비즈와 테스트에 결합되는 GST-RhoA (G17A)의 준비에 대해 설명합니다. 전형 Coomassie의 스테인드 젤은 그림 2에 표시됩니다. eluted 단백질과 샘플은 약 50 kDa (그림 2, 레인 6)에서 단일 밴드를 포함한다. 단백질의 농도는 BSA 레퍼런스 샘플을 사용하여 추정 할 수 있습니다. 그림 2의 예제에서 RhoA (G17A)의 농도가 15 μg/10 μl 것으로 추정된다. 따라서, 10 μl / 튜브 aliquots이 준비되었습니다. 전형적인 수율<html> 우리 손으로에서 10 ML 세균 용해 15-20 μg 단백질입니다. 프로토콜의 3 부에서는 친화 강수량 분석합니다 (그림 1의 개요를 참조) 설명합니다. 교환 계수 GEF-H1의 활성화를 감지 성공 GEF 분석은 그림 3에 표시됩니다. RhoA (G17A) 단백질은 GEF-H1은 기저 활동을 갖고 제안, 컨트롤 (치료) 세포 lysates에서 일부 GEF-H1를 점령. 금액은 그러나 TNF-α는 GEF-H1 5,7 활성화한다는 개념과 일치 염증성 시토킨 종양의 괴사 팩터-α (TNF-α)로 치료 세포의 증가를 시켰던. 중요한 건, 총 세포 lysates은 치료 GEF-H1 수준을 변경하지 않았 제안, 제어 및 처리 예제에서 GEF-H1과 비슷한 금액을 표시하고 분석에 사용되는 입력은 동일합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> 그림 1. 프로토콜의 개요. ove_content &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> 그림 2. 비드 준비 프로토콜의 대표 따른 모든 책임은 사용자에게 있습니다. 성공 GST-RhoA (G17A) 비드 준비 Coomassie의 스테인드 젤이 나타납니다. 비드 샘플과 BSA 단백질 표준은 10 % 아크릴 아미드 젤을 사용하여 SDS-PAGE로 구분되었다. 구슬을 테스트하려면, GST-RhoA (G17A)를 포함하는 최종 비드 슬러리의 10 μl은 5 분 동안 Laemmli 샘플 버퍼와 삶은을 감소로 1:1 희석된다. 구슬은 간단하게 버리고 뜨는가 젤에로드되었습니다. 다음 예제로드되었습니다 레인 1 : 분자량 마커 (MW) (FroggaBio BLUeye은 단백질 사다리 prestained); 레인 2-4 : 5, 10 및 20 μg (BSA) 소 혈청 알부민, 레인 5는 비어 있습니다; 레인 6 : 10 신선한 RhoA (G17A) 구슬 μl. 분리가 완료되면 젤은 Coomassie 파랑을 사용 물들어 있었고, 그 후에 단백질을 누설하는 destained있다. GST-RhoA (G17A) 단백질의 분자량은 대략 50<html> 48 kDa 마커의 수준 주변 kDa 및 실행됩니다. 이 특정 예제에서 GST-Rho 단백질의 농도가 15 μg/10 μl 슬러리 주위 것으로 추정된다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> GEF-H1의 TNF-α 유발 활성화를 보여주는 그림 3. 대표 GEF 활성 분석. 합류 LLC-PK1 세포는 5 분 10 NG / ML TNF-α로 치료되었다. 다음과 같은 치료는 세포가 lysed되었으며 활성 GEFs는 GST-RhoA (G17A) 행 구슬을 사용하여 캡처했다. 시켰던 단백질 (상단 얼룩)와 총 세포 lysate 샘플 (하단 얼룩)에서 GEF-H1의 존재는 서양 방지 GEF-H1 항체 (세포 시그널링)로 모래 바닥을 사용하여 감지되었습니다. 성공적인 결과를 나타내는 상응하는 입력에 대한 상대 비 대우 전지 비해 TNF는-α-대우에서 시켰던 GEF-H1의 증가 금액을 유의하시기 바랍니다. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4. &quot;나쁜 결과&quot;. GEF의 풀다운 분석이 여기에 표시된 비즈 잡혀 일부 GEF-H1 결과이지만, 금액은 컨트롤에서 시켰던와 TNF-α-처리된 세포는 동일합니다. 따라서 TNF-α,이 경우 GEF-H1의 아는 활성이 활성화를 유도하지 않았다. 이 특별한 실험 이후의 문제 해결에 사용되는 TNF-α가 충분히 신선하고 아마 타락한 아니라고 제안했습니다.

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	<li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. h. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+biochemistry+and+biology.">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li><li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF+means+go:+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors.">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li><li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates.">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-{alpha}-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation:+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability.">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li><li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase.">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK/GEF-H1/RhoA+pathway+in+tubular+epithelium.">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li><li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+a+GEF+by+its+tail.">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li><li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals.">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li><li>Guilluy, G., Dubash, A. D., Garc&#237;a-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus.">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li><li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li><li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Lsc/p115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin.">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기에 제시된 방법은 세포의 GEFs의 활성 풀을 따라 GEFs 대한에서만 사용할 수 비 방사성 활성 분석이다. 분석은 다음과 같은 작은 GTPases의 활성화뿐만 아니라 RAC 및 Cdc42에 대한 GEFs 사용 강수량의 assays와 비슷합니다. 이러한 assays 다른 GST 태그가 추가된 단백질을 사용하고 여기에서 설명한 것과 약간 차이가 있지만 기본적인 단계는 동일합니다. 따라서이 프로토콜은 쉽게 다른 작은 GTPase와 GEF 활성화 assays에 대한 적응하실 수 있습니다. 제시 GEF 분석은 최근 핵 분수 9,10를위한 응용 프로그램으로 바뀌었습니다. 추가로 수정, 다른 subcellular 구획의 GEF 활성화의 테스트도 가능합니다 수도 있습니다. 우리는 상피 세포 라인 5,6,7의 GEFs의 활성화를 공부하는 표시 방법을 사용하십시오. 일부 최적화를 통해,이 분석은 모든 세포 라인에서 GEFs를 감지하는 적합해야합니다. 언제 adapti특정 세포 유형에 NG, 테스트해야하는 GEF를위한 최적의 휴대폰 번호, 용해 버퍼 볼륨, 및 검출 방법 (서양은 모래 바닥에 대한 좋은 항체를 중요)을 찾습니다. 분석의 초기 설정의 경우 그것은 관심 GEF을 활성화하는 것으로 알려져 자극을 사용하는 것이 좋습니다. 알 수없는 자극을 사용할 때, 항상 분석의 작동 여부를 확인하는 데 긍정적인 제어를 사용합니다. 이 분석은 서양의 모래 바닥으로 알려져 GEFs의 활성화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 알 수없는 GEFs를 파악하는 것도 충분한 것입니다. 이를 위해 통제와 자극 샘플에서 캡처한 GEFs는 Coomassie 묻은 겔에서 분석되어야한다. 오직 자극 표본에 나타나는 밴드 활성화 GEFs를 포함할 수도 있고 질량 분석법 (예 : 5)에 의해 식별을 위해 보낼 수 있습니다. 마지막으로, 경계의 메모. 검정은 활성 GEFs 렌더링 posttranslational 수정이 세포 용해 후 보존되었다는 가정하에 기반으로합니다. 실제로, 이것은 분명히 CA입니다GEFs의 번호 SE, 그 시설부터,이 분석은 GEF-H1, p115RhoGEF 및 XPLN (예 : 5,11,12,13)를 포함하여 다양한 GEFs의 활성화를 탐지하기 위해 여러 그룹에 의해 사용되었습니다. 활성 상태의 보존 그러나 모든 GEFs의 경우 발생하지 않을 수도, 따라서 그것이 분석은 모든 GEFs 목적에 부합되지 않는다는 것에 생각할 수있다. 그것은 또한 많은 GEFs 하나 이상의 작은 GTPases 향해 활동을 견딜수 것을 언급되어야한다. 따라서, 특정 GEF를 공부하면, 그것은 RhoA, Rac1 및 Cdc42를 검사 기타 소형 GTPases뿐만 아니라, 기능성 연구를위한 GEF의 강수량의 assays로이 분석을 보완하는 것이 좋습니다. 프로토콜의 중요 단계 : 변형 박테리아의 식민지 앰프, 좋은 파생물 및 수확량에 의한 적절한 선택을 위해 신선하고 제대로 준비 접시에서 포착해야합니다. 다른 출처에서 얻은 유능한 세포에 대한 변환 조건이 다를 수와 협의하여야한다. </p&gt; 단백질 준비 프로토콜 (단계 2.3부터) 및 분석 (단계 3.2에서)의 모든 단계 ° C 냉각 솔루션 및 원심 분리기와 4에서 수행해야합니다. 박테리아 용해 (단계 2.5) 균일한 현탁액을 얻기 위해 철저하고 완벽하게해야합니다. 박테리아, 와동을 lysing 4 ° C에서 그것을 유지하면서, 번갈아 lysate를 피펫과 sonication은 단백질 denaturing 방지하기 위해 얼음에서 수행되도록합니다. sonicator의 다른 모델을 사용하면 조건이 조정해야 할 수도 있습니다. 구슬로 sonicate의 인큐베이션 항상 충분한 구속력을 보장하기 위해 회전에서 4 ° C에서 이루어져야하고, 치료는 타이밍이 일관성을 유지하기 위해 이동해야합니다. GST-Rho의 돌연변이 박테리아로 표현하면 다소 불안정하므로 즉시 또는 몇 일 이내에 준비한 구슬을 사용하는 것이 그것이다. 강수량 분석 (파트 3), 시간 및 온도 구분의 활성 GEFs 쉽게 세포 lysate에서 손실될 수 있으므로 단계는 최대한 빨리 수행해야합니다. 다음 절에서는 몇 가지 문제 해결 팁을 포함하고 있습니다. 아니오 또는 최종 비드 준비 돌연변 Rho 단백질의 매우 낮은 금액 : 이것은 비효율적인 유도, 박테리아 부족 용해, 또는 준비 과정이나 보관 중에 단백질의 손실로 인한 ​​수 없습니다. 이러한 가능성의 일부를 해결하기 위해 박테리아의 샘플은 유도 전후 분석할 수 있습니다. 단백질 갓 streaked 판이나 다시 변형 유능한 세포에서 식민지를 사용하는 과정을 반복에 가난한 유도가있다면. 다른 IPTG의 농도 및 유도 시간도 테스트해야합니다. 용해가 용해 버퍼에 소금과 세제 농도를 변화 (즉 단백질 대신 뜨는의 펠렛에 남아) 부족한 경우에는 재판을받을 수 있습니다. 대체 sonication 시간 및설정이 고려되어야하고, sonication 전후 샘플은 용해의 효율성을 결정하기 위해 현미경으로 확인하실 수 있습니다. 아니오 GST-단백질이 구슬에 존재하더라도, GEF를 시켰던 없음 : 이것은 강수량 분석 도중에 기술적인 문제로 인해, 또는 적용 자극을 사용하여 공부 GEF의 활성화 실제 부재가 있습니다. 항상 검정 작동하는지 확인하기 위해 긍정적인 제어로 알려진 자극을 사용합니다. 몇 일 이내에 준비된 비즈를 사용합니다. 강수량 분석은 모든 조건에서 공부 GEF의 탐지 금액을 캡처하는 경우, GEF가 존재하고 분석 (단계 3.3)에 사용하는 원심 분리 후 뜨는에서 잘 감지 있는지 확인합니다. 모든 버퍼와 프로 테아제 억제제가 신선이며, 가능한 빨리 얼음의 모든 단계를 수행하십시오. 입력 단백질 (2 접시 / 샘플에서 lysates를 사용하여 등)의 양을 늘립니다. 강수량 분석은 기저 precipi가 표시되면당신의 GEF의 tation지만 아무런 차이 제어 및 자극 샘플 (그림 4) 사이에 본 적이있다는 적용 자극이 다른 알려진 효과를 (다른 신호 전달 경로의 활성화를 감지하여 예)을 사용하여 일한다고 확인하여 문제 해결을 시작합니다. 치료 조건 및 / 또는 농도를 변경을 고려합니다. 귀하의 자극 가능성이 시간과 농도를 예측하는 Rho 또는 다른 신호를 활성화하는 방법 문헌보고의 데이터에 의존하고 있습니다. GEF 활성화가 잘 감지 Rho 활성화 이전 시점에 가장 잘 감지 수도로서 처리 시간을 최적화하면 모두 짧고 오랫동안 포인트를 사용합니다. 마지막으로, 동일한 자극 통과 번호에 의한 세포 반응의 변화로 인해 활성화의 변수 학위 confluency 세포 등을 초래할 수

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> 곧 사용할 수 있습니다 </td><td> 박사 키이스 Burridge (노스캐롤라이나 대학) (심판 3) 실험실에서 생성된 </td></tr><tr><td> DH5α </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> 스토어 -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC 배지 </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> 무균 유지 </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> -20 ° C에서 스토어 주식 </td></tr><tr><td> 한천 </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (ISO프로필 BD-thiogalacto-pyranoside) </td><td> Calbio - 화학 </td><td> 420,322 </td><td> -20 ° C에서 매장 재고 솔루션 </td></tr><tr><td> 글루타티온 세파 로스 비즈 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 시그마 </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 시그마 </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 시그마 </td><td> M-9272 </td><td> 바로 전에 사용 추가 </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> 바로 전에 사용 추가 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 시그마 </td><td> P-7626 </td><td> 바로 전에 사용 추가 </td></tr><tr><td> 프로 테아제 억제제 50x </td><td> BD Baculo - 골드 </td><td> 51 21426Z </td><td> 바로 전에 사용 추가 </td></tr><tr&gt; <td> 완벽한 미니, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 프리 10X </td><td> 로슈 </td><td> 11 836 170 001 </td><td> 바로 전에 사용 추가 </td></tr><tr><td> Laemmli 샘플 버퍼 2X </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> M7154 </td><td> 바로 전에 사용 추가 </td></tr><tr><td> Coomassie 브릴리언트 블루 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> 초산 </td><td> CALEDON </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> CALEDON </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> 바이오 방사선 단백질 분석 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> BLUeye 사다리 </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 시약이 사용됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td&gt; <td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> RC-5B의 원심 분리기 </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 로터 </td><td> 4에서 사용 ° C </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Sorvall - 써모 과학 </td><td> ST-16R </td><td> 4에서 사용 ° C </td></tr><tr><td> 마이크로 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> 4에서 사용 ° C </td></tr><tr><td> 세균성 흔드는 </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG는 CH-1403 Bottmingen </td><td> 37 ° C에서 또는 22에서 사용 ° C </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> 브랜 </td><td> Sonifier-450 </td><td> RT에서 사용 </td></tr><tr><td> 회전하는 것 </td><td> Glas - 열 </td><td> 099A CR4012 </td><td> 4에서 사용 ° C </td></tr></tbody></table> 사용 표 2. 특정 장비.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

작은 GTPases의 Rho 가족의 단백질은 cytoskeleton의 중앙 규제이며, 세포 마이 그 레이션, 유전자 발현, 세포주기의 진행과 세포 접착 일을 포함하여 세포 공정의 수많은 종류를 제어합니다. Rho 단백질은 GDP 바인딩된 상태에서 GTP 바인딩된 및 운영 중지로 활약하는 분자 스위치입니다. 그들의 정품 인증은 구아닌 - 염기 교환 팩터 (GEF) 단백질의 가족에 의해 매개된다. Rho-GEFs은 specificities에게 2를 중복으로 큰 가족을 구성합니다. 진보 많은이 특정 신호에 의해 활성화 GEFs을 확인하였습니다 있지만, 이러한 단백질의 통로가 특정 규제에 관한 나머지 많은 질문이 아직 없습니다. Rho-GEFs의 수가 70을 초과하고, 각 셀에 두 개 이상 GEF 단백질을 표현한다. 또한, 이러한 단백질의 대부분은 Rho뿐만 아니라 활성화하지만, 가족의 다른 구성원은 규제 네트워크의 복잡도에 더 기여. 중요한 것은, 탐험어떻게 GEFs이 규제되는 것은 다양한 자극에 의​​해 활성화된 세포에서 개별 GEFs의 활성 풀을 수행하는 방법을 필요로합니다. 여기 친화 강수량 분석을 사용하여 사용 가능한 활성 Rho 특정 GEFs을 평가하고 계량하는 데 사용하는 방법에 대한 단계별 절차를 제공합니다. 이 분석은 Burridge 실험실 3,4에서 몇 년 전에 개발된 우리는 신장 관형 셀 라인 5,6,7에 사용 하였다. 검정은 활성 GEFs에 대한 높은 친화력으로, &quot;염기 무료&quot;돌연변이 RhoA 활용합니다. 변이 (G17A)은 GDP 또는 GTP하고이 상태가 GEF에 바인딩되어 중간 상태를 모방한 것이었 묶어 단백질이없는 렌더링. 이 돌연변이 단백질의 GST 태그가 추가된 버전은 표현과 E.에서 정화되어 대장균, 글루타티온 세파 로스 비즈에 바인딩 및 치료와 자극을 세포 lysates에서 적극 GEFs을 침전하는 데 사용됩니다. 대부분의 GEFs은 억제 바인딩의 posttranslational 변경 또는 릴리스, 그들의 적극적인 상태로 활성화되면세포 lysates에 보존되고, 그들이 검정 8 시까지 감지가 가능하다. 캡처한 단백질은 서양의 모래 바닥을 사용하여 특정 항체로 검출하여 알려진 GEFs에 대한 탐지, 또는 특정 자극에 의​​해 활성화 미지 GEFs을 확인하기 위해 질량 분광법에 의해 분석됩니다.

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Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

여기에 제시된 방법은 활성 GEFs에 대한 높은 친화력을 가진 돌연변이 RhoA GST 융합 단백질을 사용함으로써 교양 세포에서 RhoA 특정 GDP / GTP 교환 요인 (GEFs)의 활성화를 따르도록하는 분석에 대해 설명합니다. GEFs는 서양 모래 바닥과 densitometry에 의해 계량에 의해 감지 세포 lysates에서 시켰던됩니다.

상피 세포 Lysates에서 GST-태그가 돌연변 Rho 단백질을 (GST-RhoA (G17A))를 사용하여 활성 Rho-GEFs의 친화력 강수량

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

affinity-precipitation-active-rho-gefs-using-gst-tagged-mutant-rho

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

16.5K 조회수.  St. Michael's Hospital. 여기에 제시된 방법은 활성 GEFs에 대한 높은 친화력을 가진 돌연변이 RhoA GST 융합 단백질을 사용함으로써 교양 세포에서 RhoA 특정 GDP / GTP 교환 요인 (GEFs)의 활성화를 따르도록하는 분석에 대해 설명합니다. GEFs는 서양 모래 바닥과 densitometry에 의해 계량에 의해 감지 세포 lysates에서 시켰던됩니다.

비디오: Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

연구

생물학

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE)

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

높은 활성 효모 변이의 색층 정화

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

형질 전환 쥐 분석 정량화 남성 생식 세포 돌연변이 주파수에 대한

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...