작은 로 GTPase는 다양한 세포 기능을 가진 슈퍼 패밀리의 단백질입니다. 예를 들면, 이 단백질은 세포 운명의 조절에 관여, 스트레스에 세포 반응, 세포 운동성, 및 세포 주기. 작은 Rho GTPase 단백질의 활동은 번역 후 수정에 의해 조절됩니다.
이러한 수정은 활동의 엄격한 규제에 관여합니다. 예를 들어, 단백질 조인및 GTP 결합은 이 단백질의 번역 후 가장 중요한 수정입니다. 내 실험실은 최근에 수정 하 고 이러한 슈퍼 패밀리 단백질의 번역 후 수정을 조사 하는 간단한 방법을 개발 했다.
이를 위해, 우리는 251 교모 세포종을 사용하고, simvastatin로 그(것)들을 표적으로 하고, 이 단백질의 번역 후 수정을 측정했습니다. 이 방법은 이 단백질 슈퍼패밀리에 세포 분수 및 GTP 결합 단백질을 관련시킵니다. 이를 위해, 우리는 RhoA의 국소화를 사용하고, GTP는 이 단백질의 번역 후 변형을 측정하기 위하여 RhoA에 묶여 있습니다.
37도 인큐베이터에서 세포를 제거합니다. 현미경의 밑에 세포를 보고 결합을 확인합니다. 세포는 70~80%의 컨할수 있어야 합니다.
차가운 PBS로 한 번 세포를 씻으시다. EDTA의 5 밀리리터를 추가하고 세포를 37도 인큐베이터에 5분 동안 다시 넣습니다. 인큐베이션 5분 후, 세포로 EDTA를 15밀 튜브로 수집합니다.
튜브를 얼음 상자에 놓고 원심분리기로 이동합니다. 원심분리기를 4도에서 1500g으로 설정하고 5분간 셀을 회전시합니다. 스핀을 따라, 슈퍼네이트를 제거하고 차가운 PBS의 1 밀리리터를 추가합니다.
세포를 잘 삼중시합니다. 세포 혼합물을 1.5 밀리리터 튜브로 이전합니다. 전송 후 원심분리기로 진행합니다.
원심분리기를 4도에서 1500g으로 설정하고 셀을 5분간 회전시합니다. 펠릿 크기를 확인합니다. 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
펠릿을 방해하지 않고, 완전히 슈퍼네이트를 폐기. 버퍼 하나를 추가합니다. 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요.
초음파 처리로 진행합니다. 5사이클, 5초씩 초음파 처리기를 설정하고 세 번 반복합니다. 초음파 처리는 얼음에서 진행되어야하지만, 예시 목적을 위해 비디오에 표시되지 않습니다.
초원심분리기로 진행하십시오. 초원심분리기를 사용하여 세포균질과 멤브레인 분획으로 균질화합니다. 원심분리기를 100, 000g으로 35분간 4도로 설정합니다.
펠릿 크기를 확인합니다. 슈퍼네이트를 분리합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서, 완전히 슈퍼네이트를 수집합니다.
상수는 세포종 분획입니다. 새로 표시된 튜브에 슈퍼네이트를 배치합니다. 펠릿에 버퍼 2를 추가합니다.
이것은 멤브레인 분획입니다. 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요. 단백질 결정 및 서양 얼룩 샘플 준비로 진행합니다.
샘플을 15% 젤을 사용하여 SDS-PAGE에 로드합니다. 분자량 마커를 시각화하거나 Ponceau 얼룩을 사용하여 단백질 전달을 확인합니다. 면역 blotting 분석을 위한 1 차적인 항체를 추가합니다.
우리는 Rac1/2/3, Cdc42 및 로아를 사용합니다. 배양판을 인큐베이터에서 꺼내라. 현미경의 밑에 세포를 보고 결합을 확인합니다.
세포는 70~80%의 컨실수여야 합니다. 문화판을 얼음 위에 놓습니다. 미디어를 흡인하고 얼음 차가운 PBS pH'd로 세포를 7.2로 씻어 내세요.
PBS를 흡인합니다. PBS의 모든 잔해를 제거하기 위해 추가 분 동안 얼음에 접시를 기울입니다. 잔류 PBS는 이 분석에 부정적인 영향을 미칩니다.
프로테아제와 인산염 억제제를 함유하는 적절한 양의 얼음 냉용리 완충제에서 세포를 리세합니다. 셀 스크레이퍼로 셀 리세이트. 이 기술에 대한 배양 판을 경사.
용재를 얼음으로 차가운 냉동 튜브로 옮기고 얼음을 계속 유지합니다. 소용돌이를 사용하여 완전히 섞습니다. 단백질 분석용 용액 10마이크로리터를 보관하십시오.
스냅 액체 질소에 나머지 세포 lysate동결. 스냅 냉동 냉동 냉동튜브를 영하 80냉동고로 옮춥시다. 이러한 샘플을 저장합니다.
참고로 샘플은 14일 이상 저장해서는 안 됩니다. 1~8단계, 하나씩 반복하여 다른 배양 판에서 세포 용양을 준비한다. 신속하게 작업하고 샘플을 얼음 위에 10분 이상 두지 마십시오.
모든 배양판을 동시에 처리하지 마십시오. 단백질 농도를 측정합니다. 리시스 버퍼의 부피를 계산하여 샘플 간의 단백질 농도를 정규화합니다.
참고: 밀리 리터 당 1 밀리 그램은 일반적으로 최고, 그러나, 0.3 밀리 리터 당 2 밀리 그램 감지 할 수 있습니다. 60 마이크로리터의 리시스 버퍼와 60 마이크로리터의 결합 버퍼를 마이크로튜브에 추가하여 빈 제어를 준비합니다. Rho 대조군 단백질 12개, 리시스 완충제 48마이크로리터, 결합 버퍼 60마이크로리터를 추가하여 양성 조절을 준비합니다.
가방에서 로 친화력 판을 꺼내 얼음 위에 놓습니다. 100 마이크로리터의 얼음 차가운 증류수로 우물에 분말을 녹입니다. 접시를 얼음 위에 두십시오.
스냅 냉동 셀은 섭씨 25도로 설정된 수조에서 해빙합니다. 각 샘플에 계산된 얼음 냉용 리시스 버퍼를 추가하여 단백질 농도를 정상화합니다. 정규화된 얼음 냉기 샘플 60마이크로리터를 마이크로튜브에 전송하고 60마이크로리터의 결합 버퍼를 추가합니다.
철저히 섞어서 얼음을 유지합니다. 마이크로 플레이트에서 물을 완전히 제거하고, 실험실 매트에 5 ~7 개의 하드 탭이 있습니다. 정규화된 샘플의 50마이크로리터, 빈 컨트롤 및 양수 컨트롤을 복제된 웰에 추가합니다.
플레이트를 궤도 셰이커에 섭씨 4도에서 30분간 놓습니다. 참고: 셰이커의 속도를 300rpm으로 설정해야 합니다. 접시에서 시료를 가볍게 치우고 실온 세척 버퍼 200 마이크로리터로 두 번 세척합니다.
각 세척 후 우물에서 세척 버퍼를 적극적으로 제거하고, 다음 도청하여, 실온에서 벤치에 접시를 유지합니다. 실온 항원 제시 버퍼 200마이크로리터를 각 우물에 넣고 실온에서 2분간 배양합니다. 우물에서 용액을 쓸어 내고 실온 세척 버퍼 200 마이크로 리터로 세 번 씻으시다.
새로 준비된 마이크로리터 50편에서 250개의 항로아 1차 항체를 각 웰에 첨가합니다. 플레이트를 궤도 셰이커에 45분간 300rpm에 놓고 섭씨 25도로 설정합니다. 우물에서 용액을 쓸어 내고 실온에서 200 마이크로 리터의 세척 버퍼로 세 번 씻습니다.
새로 준비된 마이크로리터 50편에서 250개의 항로아 이차 항체를 각 웰에 첨가합니다. 플레이트를 궤도 셰이커 위에 45분간 300rpm에 놓아 섭씨 25도로 설정합니다. 각 웰에서 동일한 양의 시약 A 및 시약 B.Flick을 혼합하여 HRP 검출 시약을 준비하고 실온 세척 버퍼 200 마이크로리터로 세 번 세척하십시오.
새로 준비된 HRP 검출 시약 50마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 최대 신호를 얻기 위해 3~5분 이내에 발광 신호를 읽습니다. 적절한 소프트웨어 패키지를 사용하여 결과를 분석합니다.
우리의 결과는 simvastatin막 분수에 있는 RhoA의 현지화를 감소시킨 다는 것을 보여줍니다. 증가 된 것은 세포소 분획에 축적됩니다. 흥미롭게도, 심바스타틴증가 GTP는 로아에 바인딩.왜?
우리는 simvastatin이 활동을 줄일 것으로 예상. 그들은 이 단백질의 세포 소세포 국소화를 측정하고, 이 단백질에 대한 GTP 결합을 측정하여 작은 로 GTPases의 활성에 대한 최종 평가를 갖는 것이 매우 중요합니다.
