이 프로토콜은 신경 줄기 세포 유래 자발적 혼합 배양의 연령별 절연을 결합하여 올리고원드로시테 전구체 세포 및 성상세포를 분화하고, 병리학적 조건을 모방한 분석, 고함량의 판독을 결합합니다. 이러한 특성은 생리적 및 병리학 적 조건과 성상 세포의 기여를 고려하는 미세 환경에서 발달 근상화 및 성인 재마일화를 분분적으로 연구 할 수 있게합니다. 배아 일 13.5에서 14.5 태아 전뇌에서 신경 줄기 세포 절연을 위해, 얼음 차가운 PBS와 깨끗한 페트리 접시에 배아의 머리를 배치하고 배율아래 두개골에서 피부를 제거하기 위해 집게를 사용합니다.
뇌가 피부를 보이고 지워지면 집게를 사용하여 두개골에서 뇌를 짜내고 소뇌를 제거하십시오. 집게를 사용하여 수막을 제거하고 분리된 조직을 비 효소 해리 버퍼에 놓습니다. 모든 뇌 조직이 고립되면 1.5 밀리리터 튜브 당 비 효소 해리 버퍼의 150 마이크로 리터에서 2 ~ 3 개의 샘플을 당기고 연속 흔들림으로 37 도에서 15 분 동안 튜브를 배양하십시오.
인큐베이션이 끝나면 각 튜브와 파이펫에 표준 매체 850 마이크로리터를 추가하여 서스펜션이 덩어리가 없는 때까지 혼합합니다. 비 해리 조직이 여전히 보이는 경우, 조직이 튜브의 바닥에 정착 할 수 있도록 샘플을 2 분 동안 휴식을 허용합니다. 해리가 완료되면, T25 또는 T45 플라스크에서 신경권 배지 농도의 10~30밀리리터에서 마이크로리터당 10~50개의 세포의 밀도로 플레이트 세포를, 세포 배양배기에서 플라스크를 수직 위치에 배치하여 세포 부착을 방지한다.
2.5개월 된 성인 생쥐에서 뇌를 4-5마리의 성인 마우스를 얼음 차가운 HBSS 50밀리리터 튜브에 넣고 1개의 뇌, 복부 면을 아래로 내려 놓고, 멸균 알루미늄 호일 덮인 플라스크의 로스트랄-코멀 방향으로 하룻밤 동안 차가운 물을 영하 20도로 채우십시오. 면도날을 사용하여 후각 전구를 제거하고 피질에서 광학 치아마로 2~3개의 1mm 두께의 관상 동맥 조각을 잘라냅니다. 차가운 표면에 슬라이스를 벤트로-등갈 위치에 놓고 코퍼스 캘로섬과 두 개의 측면 심실을 식별합니다.
배율을 사용하여, 측면 심실의 벽을 분리하고, 코퍼스 캘로섬의 조각을 포함하지 않도록 주의하고, 37섭씨37도에서 15분 동안 효소 해리 버퍼의 5~10 밀리리터에 고립된 조직을 배치한다. 인큐베이션이 끝나면 조직을 50회 이상 배관한 후 37도에서 샘플을 추가로 10분 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 표준 배양 배지의 5 밀리리터로 트립신을 중화시키고 70 미크론 필터를 통해 조직 현탁액을 필터링한다.
400배 g에서 5분간 여과된 용액을 원심분리하고, 두 번째 원심분리를 위해 자당용의 펠릿을 다시 중단한다. 원심분리의 끝에서, 또 다른 원심분리를 위해 소 세럼 알부민 세척 용액의 펠릿을 다시 중단한 다음, 수직 T-25 또는 T-45 플라스크에서 세포를 계산하고 플레이트하기 위한 표준 배양 배지에서 펠릿을 다시 중단한다. 1 차적인 신경권 분화를 위해, 신경 줄기 세포 배양에 기본적인 섬유아세포 및 내피 성장 인자를 2일마다 추가하십시오.
신경구가 100-500 미크론 직경에 도달하면 표준 프로토콜에 따라 기계적 해리로 세포를 통과합니다. 올리고스피어 분화의 경우, 혈소판 유래 인자-AA에서 기본 섬유아세포 성장 인자를 2일마다 치료한다. 올리고스피어가 100-150미크론 직경에 도달하면 표준 프로토콜에 따라 기계적 해리에 의해 구체를 해리시키고 세포 현탁액을 평방 센티미터 당 3000 셀 밀도에서 다각DL-ornithine 라미닌 코팅 플레이트에 시드한다.
3 일 후, 올리고드 로시테 분화 매체의 동일한 볼륨으로 각 문화의 상체를 교체. 염증 매개 분화 블록 유도를 수행하기 위해, 신경구 해리 후 및 올리고스피어 생산 중에, 배양 배지에 관심의 사이토카인 혼합을 추가한다. 산소-포도당 박탈 세포 죽음을 유도하기 위하여는, 다중 우물 판으로 파종한 후에 2 일, 다중 우물판의 개별 우물로 각 배양에서 상체원을 전송합니다.
OGD 배지의 절반을 우물에 추가하고, 95%의 질소와 5%의 이산화탄소로 포화된 밀폐 저산소실로 배양을 옮긴다. 세포 배양 인큐베이터에 챔버를 배치합니다. 3시간 후, 챔버내의 배지를 다중 음양판에서 따로 정한 매체로 교체한다.
셀 염색의 품질을 확인한 후, 고함량 스크리닝 소프트웨어의 획득 메뉴에서 고정 노출 시간 및 미니 스캔을 선택하고, 실험 조건당 웰 당 10개의 필드와 2개의 웰을 선택하여 필드의 하위 집합에서 분석 파라미터를 전체 플레이트에 대해 설정할 수 있도록 한다. 워크플로를 단계별로 수행하여 전체 알고리즘을 개발합니다. 각 채널에 대한 프로세스 이미지를 선택하고 배경 제거를 클릭하여 원하는 신호 수준을 선택합니다.
핵 염색에 의해 핵을 식별하고 선택하려면 기본 개체 식별을 클릭하고 임계값을 조정하여 단일 핵을 식별하고 기본 개체 유효성 검사를 클릭하여 개체 영역 및 위치에 따라 임계값을 설정합니다. 특정 계보 마커에 해당하는 각 채널의 반점을 식별하고, 순환 플라즈마 형광을 식별할 수 있도록 링 값 너비를 3대에서 0으로 설정합니다. 워크플로우에서 참조 수준을 선택하여 분석을 구축하고 핵 크기와 핵 염색 강도 및 링에 의해 확인된 세포 플라즈마 형광에 기초한 특정 마커 양성 세포의 응축된 핵을 자동 계수할 수 있도록 한 다음 재생을 클릭합니다.
배양의 첫 번째 단계 동안, 신경 줄기 세포는 그들의 네신 발현을 유지합니다. 세포의 대다수는 또한 NG2 양성이다. 사전 올리고드엔드로시테 단계에 대응하는 CNPase 양성 세포는 T3 중재 분화 유도 후 3~6일 후에 검출할 수 있으며, 성숙한 MBP 양성 올리고드로시트는 시험관내에서 6~12일 후에 상당한 비율로 나타난다.
고함량 스크리닝 분석은 핵 염색 및 형광 강도 분석을 통해 배양 내의 단일 세포를 검출할 수 있게 한다. 분화 단계의 끝에 있는 문화의 조성은 배양이 태아 또는 성인 기원인지, 태아 배양이 T3 매개 분화에 더 반응하고 성숙한 올리고드로키테스의 더 높은 비율에 도달하는 지에 따라 다릅니다. 신경줄기 세포 유래 올리고드엔드로시테 전구체 세포가 고밀도로 종향될 때, 그들은 골재하고, 성상세포를 복제하여 급속하게 컨리치 세포 층을 생성하여 성숙한 올리고드로키테스의 특징적인 거미 순 형상의 관찰을 방지한다.
염증 매개, 분화 차단은 CNPase와 MBP가 태아와 성인 문화 모두에서 염색에 의해 검출된 바와 같이, 전및 성숙한 올리고드로시테의 강한 감소를 유도합니다. 올리고드렌드로시테 전구세포의 수가 증가하면 사이토카인 처리성인 배양에서도 발생한다. 태아와 성인 올리고드로시테 전구체 세포는 염증성 사이토카인 노출과 동일하게 보이지만, 태아 유래 배양만이 산소-포도당 박탈 독성에 민감합니다.
이 방법은 모든 종류의 올리고드엔드로시테 전구체 세포, 분화 및 성숙 간섭 과정으로 구현될 수 있으며, 근생 또는 재명료에 영향을 미치는 질병을 퇴치하기 위한 새로운 전략을 테스트할 수 있습니다.
