저자는 재조합 T7 RNA 중합 효소의와 그림 1을 준비에 도움 노르만 Ebelt의 준비를 위해 Schermuly 지넷 감사드립니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680)과 최대 플랑크 협회에서 기금의 지원을받는되었다.

1. PCR을 통해 긴 사전 c​​rRNA 기판의 생성 <ol><li> CRISPR 클러스터의 공백 지역을 대상으로 디자인 PCR의 프리 머. T7 RNA의 효소를 추가 복제에 대한 기대 입문서 및 제한 사이트 (T7RNAP) 발기인 순서 (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) 모두 프리 머 (pUC19에 대한 예를 BamHI과 뒷다리 III, 그림. 2A)에 벡터로 PCR 제품 . 참고 : T7RNAP는 전사의 적절한 개시를위한 구아니딘 잔여 물이 필요합니다. </li><li> PCR에 의해 게놈 DNA에서 관심의 사전 c​​rRNA 순서를 증폭. </li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동하여 PCR 제품을 분리하고 젤 원하는 대역의 압축을 풉니 다. 끈적 끝 (예를 들면 BamHI 및 HindIII, 그림. 2A)을 만들 제한 효소로 PCR 제품을 소화. - 제품에 의해 절단을 제거하기 위해 PCR 정화 키트를 사용하여 PCR 제품을 정화. </li><li> T4 DNA ligase에 포함되어 있습니다 결합 반응, T4 DNA ligase의 버퍼와 설정흘리고 PCR 제품 및 해당 끈적 끝으로 dephosphorylated 선형 pUC 벡터의 3시 1분 몰 비율입니다. 16 ° C 하룻밤에 혼합물을 품다. 표준 프로토콜에 의해 관할 대장균 DH5α 세포에 결합 혼합물을 변환하고 성공적인 결합을 식별하는 파란색 흰색 검사를 사용합니다. </li><li> 플라스미드 준비 키트를 사용하여 흰색 식민지에서 plasmids를 분리합니다. 플라스미드 시퀀싱에 의해 긍정적 인 클론을 확인합니다. 또한 식민지 PCR은 검사에 활용 될 수 있습니다. </li></ol> 2. DNA의 oligonucleotides의 어닐링을 통해 중간 사전 c​​rRNA 기판의 생성 <ol><li> 앞으로 디자인하고 원하는 CRISPR 반복 / 스페이서 순서로 oligonucleotides를 반대로. oligonucleotides는 T7 RNAP 프로모터뿐만 아니라 터미널 제한 사이트 (pUC19에 대한 예를 BamHI과 뒷다리 III)의 순서가 포함되어 있습니다. (그림을 참조하십시오. 2B 어닐링 후에 끈적 끝 양식을 보장하기 위해 oligonucleotides를 종료 </strong&gt;). </li><li> T4 폴리 뉴클레오타이드의 키나제의 5 μl (PNK), T4 PNK 10 배 버퍼, 2 μl ATP (10 ㎜)의 2 μl를 포함하는 별도의 20μl 반응의 각 oligonucleotide의 5&#39;-phosphorylate 1 nmol. 37에서 1 시간 동안 각각의 샘플을 품다 ° C. </li><li> 두 phosphorylated oligonucleotides를 잡종을 만들다. phosphorylated 앞으로 oligo의 혼합물 (2.2.), phosphorylated 역 oligo의 혼합물 (2.2.), 10 μl 반응의 T4 DNA ligase의 10 배 버퍼 1 μl 1 μl의 1μl 조화를 이루고 있습니다. 95시 5 분에 대한 샘플을 배양 ° 가열 블록 또는 끓는 물에 C, 열원을 끄고 실내 온도 (~ 2-3시간)에 아래 혼합물이 멋진 보자. 참고 :이 중요한 단계에서 속도가 느린 냉각 과정은 각 단일 oligonucleotide 내 구조의 형성에 비해 두 oligonucleotides의 어닐링을 좋아 하시 더군요. </li><li> 소화와 dephosphorylated pUC 벡터의 1μl 하이브리드 믹스 4 μl를, (Ligate 0.1 μg /T4 DNA ligase에, T4 DNA ligase의 10 배 버퍼와 20 μl 결합 혼합 10 MM ATP 포함) μl. 16 ° C 하룻밤에 샘플을 품다. </li><li> 표준 프로토콜에 의해 관할 대장균 DH5α 세포에 출혈도 잡았 plasmids를 변환과 파란색 흰색 검사를 사용합니다. plasmids를 분리하고 소화 (원하는 크기의 삽입물에 대한 화면)과 이후의 플라스미드 시퀀싱에 의해 긍정적 인 클론을 확인합니다. </li></ol> 3. 사용자 정의 RNA의 합성 oligonucleotide를 통해 짧은 카스 RNA 기판의 생성 디자인 짧은 카스 RNA 기판 (예 : 하나의 반복 시퀀스, 그림. 2C) 및 사용자 지정 RNA의 합성 oligonucleotide 시설을 사용합니다. 참고 : RNA의 oligonucleotide의 지정된 위치 (그림 2C)에 deoxyribonucleotide의 포함은 RNA의 절단의 사이트를 정확하게하는 데 사용할 수 있습니다. 4.에서 체외 T7 RNA 중합 효소의 전사 <ol><li> 귀하의 설계 구조 (1.9. 또는 2.7에서.) maxiprep 플라스미드 정제 키트를 사용하여 plasmids를 분리합니다. </li><li> 복제 조각 (예 : HindIII)의 하류를 cleaves 제한 효소로 플라스미드를 Linearize. 완전한 소화를 확인합니다. 참고 : RNA의 성적 증명서를 발산 정의 3 &#39;말단이 원하는 경우, 설계 구조가 HindIII 시퀀스의 상류 &quot;실행 - 오프&quot;스크립트에 대한 추가 특정 제한 사이트를 포함해야합니다. </li><li> 클로로포름 (1:1) 추출 및 에탄올 강수량 : 선형화 된 페놀의 플라스미드를 정화. DEPC 처리 멸균 물에 펠렛을 resuspending하여 핵산을 복구 할 수 있습니다. </li><li> 체외 T7 RNAP의 40 MM Hepes / 코 (산도 8), 22 MM MgCl 2, 5 MM dithiothreitol, 1 밀리미터 spermidine, 각 뉴 클레오 사이드의 삼인산 4 ㎜ (ATP, CTP, GTP, UTP이 포함되어 전사 혼합을 실행 설정 ), 40-100 μg / 소화의 ML플라스미드와 DEPC 처리 물에 0.1 MG / ML T7 RNAP. 37 3 시간 동안 품다 ° C. </li><li> 8 M의 요소를 denaturing 12 % polyacrylamide 젤 (그림 3A)에 얻은 RNA 기록을 분석합니다. RNA의 성적은 모노 Q 음이온 교환 크로마토 그래피 13을 통해 정화되고 DEPC 처리 멸균 물에 RNA의 분수와 펠렛의 resuspension의 에탄올 침전으로 복구 할 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해, -80에서 RNA를 저장 ° C. </li></ol> 5. Cas6 endonuclease 분석 <ol><li> 설정 체외 T7 RNAP 20 μl 2 MM ATP의 감소 금액을 포함하고 구비되는 (4.4 참조) 전사 혼합을 실행하는 2.5 μl α-[32 P]-ATP (10 MCI / ML, 5000 CI / mmol). denaturing 8 M의 우레아 12 % polyacrylamide 젤에서 젤 추출을 통해 반응 제품을 정화. autoradiography에 의해 밴드를 표시합니다. </li><li> 원하는 재조합 카스 단백질을 생산하고 정화. 이 예에서는, C클로스 트리 디움 thermocellum에서 as6는 열 강수량과 니켈 NTA 크로마토 그래피를 통해 정화되었습니다. </li><li> 클로스 트리 디움 thermocellum Cas6에 대한 endonuclease 분석 반응 (예를 설정, 반응 혼합물은 20 MM Hepes (코 pH8), 250 MM KCl, 2 MM MgCl 2, 1 MM DTT 12,000 노출 당 비용 (CPM) RNA 기판 및 1 μM 효소를 포함하고에 incubated되었습니다 37 ° C 30 분 용). </li><li> 8 M의 우레아 12 % polyacrylamide 젤에서 반응 혼합물 (포름 아미드 95 % 포함 + 10 μl RNA로드 버퍼)의 5 μl를로드합니다. autoradiography에 의한 전기 영동 후 절단 제품을 표시합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 카스의 endonuclease 활동의 분석을위한 RNA 기판의 예는도 3a에 표시됩니다. 체외 전사 반응에 분석 100 μl의 5 μl의 나누어지는이로드되었습니다. RNA 생산의 효율성이 다른 구조 사이에 차이가 있습니다. 일부 요인 t모자는 전사 개시에 필요한 +1 G, 전사시 RNA 구조 형성 (II) 가능성과 세대에 대한 제한 사이트 (III)의 선택에 따라 아르 얻은 RNA의 양은 (i) 초기 순서에 영향을 관찰했다 실행 - 오프 절단 위치의. RNA의 endonuclease 활동의 조사는 모두 높은 정화 재조합 카스 단백질 (그림 3B)와 적절한 부정적인 컨트롤을 필요로합니다. 이상적으로,이 부정적인 컨트롤 샘플 조사 카스의 endonuclease 반응에서 가능한 한 조금 다릅니다. 이것은 카스 표현 (및 동일 정화 절차에 따라)없이 반응 버퍼와 세포 lysate와 RNA의 부화에 의해 달성 될 수있다. 이상적인 부정적인 컨트롤은 제안 절단 사이트에서 deoxyribonucleotide 추가 된 것입니다. 그림 3C에서 5 &#39;터미널이라는 반복 시퀀스의 절단은 클로스 트리 디움 thermocellum Cas6에 표시됩니다. 아래의<html> 동일한 조건이 반복 deoxyribonucleotide이 위치 -9에 도입 할 때 더 이상 기판 없습니다. 이 방법은 또한 절단 사이트에 대한 정보를 제공합니다. 마지막으로, 오랜 내부적으로 표시된 사전 c​​rRNA는 Cas6에 의해 흘리고있다 두 개의 절단 조각을 준수하고 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> CRISPR / 카스 활동의 그림 1. 개략도. 개요 CRISPR 클러스터 (적응), Cas6 endonuclease에 의해 작은 crRNAs에 CRISPR 배열의 전사와 가공, 캐스케이드 단지에 crRNAs의 이해와의 간섭에 바이러스 DNA 시퀀스 (protospacer)의 삽입을 다음과 crRNA와 protospacer 사이 complementarity에 따라 바이러스 공격을 반복했다. Protospacer 인접 모티프 (PAM) 마르크 바이러스 protospacer 시퀀스. igure 2 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 카스 단백질에 대한 RNA 기판의 세대. 제도는 (A) 긴 사전 c​​rRNA 기판, (B) 중간 사전 c​​rRNA 기판 및 사전 c​​rRNA 생산을위한 (C) 짧은 카스 RNA 기판 창출을위한 워크 플로우를 보여줍니다. 예를 들어 시퀀스는 클로스 트리 디움 thermocellum의 CRISPR 배열에 제공됩니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> 그림 3. Cas6 endonuclease 분석. A.) Toluidine 푸른 스테인드 polyacrylamide의 맞춤 디자인 RNA의 oligonucleotide (250 pmol)의 젤과 체외 RNA 성적 (일반 100 μl 반응의 5 μl)에 둘. 열 후 클로 스트 리듐 thermocellum에서 Cas6 준비 (80 pmol)의 B.) SDS-PAGE 젤1 시간 니켈 NTA 크로마토 그래피에 대한 ° C 50 강수량. 5 &#39;터미널이라는 반복 시퀀스 및 체외 성적에 사전 crRNA에 대한 endonucleolytic Cas6 활동 C.) 감지. 위치 -9에서 dNTP의 도입은 짧은 카스 RNA 기판 (S, 그림. 2C)에 대한 Cas6 절단 시킨다는. 5 &#39;터미널 8 NT 태그는 오래 전 crRNA 기판 (L, 그림. 2A)에서 crRNA의 성숙을 위해 생성됩니다. 밴드는 denaturing 8 M의 우레아 12 % polyacrylamide 젤에서 분리 autoradiography으로 시각화했다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

제시 방법은 서로 다른 크기의 범위 카스 endonuclease 기판의 생성을 활성화하고 시퀀스 디자인의 자유를 변화와 함께. 합성 RNA의 oligonucleotide 기판의 생성을위한 가장 스트레이트 포워드 접근 방식은 더 이상 RNA의 oligomers을 만드는 증가 비용과 기술적 한계로 인해 짧은 RNA 디자인으로 제한됩니다. 성공적인 RNA 합성은 100 세포핵 길이의 수정되지 않은 RNA의 oligomers에 대해보고 된 반면, 사용자 정의 RNA 합성을위한 실용적이고 경제적 인 최대 아래 40 세포핵에 자리 잡고 있습니다. 그러나, 주어진 시퀀스는 합성 할 수 있으며 수정 세포핵 (예 : deoxyribonucleotides)의 대상으로 소개 자세히 절단 사이트를 분석하기 위해 이용 될 수 있습니다. 긴 사전 cRNAs는 체외 스크립트에 통해 생성해야합니다. T7 RNA 중합 효소의 프로모터를 포함 oligonucleotides의 어닐링은 중간 길이 미리 crRN의 생산을 허용있습니다. 정기적으로 그리고 경제적으로 합성 DNA의 oligonucleotides의 최대 길이는 불과 150 세포핵 위에 있으며,이 방법으로 합성 사전 c​​rRNAs의 최대를 나타냅니다. 서로 끈적 끝을 형성 여러 annealed의 DNA oligonucleotide 쌍의 조립이 최대 길이를 연장하지만 구조의 복제에 증가 도전을 필요로 할 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 원하는 순서로 사전 c​​rRNA 구조 (그리고 그에 카스 endonuclease 기판)를 생성 할 수있는 기능입니다. 이 합성 crRNA 디자인의 테스트를 할 수 있습니다. 마지막으로, 큰 사전 c​​rRNAs는 그 전체 게놈의 CRISPR 요소 또는 분수의 PCR의 amplificates에서 얻을 수 있습니다. 플라스미드 체외 전사 템플릿에 대한 변경은 사전 crRNA 변종의 생성을위한 사이트 이동 mutagenesis를 통해 소개 할 수 있습니다. 이러한 구조는 전체 내에 글로벌 endonucleolytic 절단 패턴을 분석하는 데 사용할 수 있습니다사전 crRNA. 체외 스크립트에서 T7 RNA 중합 효소의를 통해 수정되지 않은 RNA의 생산을위한 선구자 작업은 전송 RNAs 14 brome 모자이크 바이러스 RNA 15 일 기준으로했습니다. 합의 T7 RNA 중합 효소의 프로모터는 인식 도메인 (-5 통해 -17)과 필수 구아노 신 일 16 전사 개시와 개시 도메인 (6를 통해 -4)로 구성되어 있습니다. 하나의 순위 하류는 거의 모든 원하는 RNA 시퀀스의 해독을 허용하는 가변 될 수 있습니다. 체외 실행 - 오프 전사 템플릿에서 생성 제시 방법은 게놈 CRISPR 지역 또는 합성 사전 crRNA 변종과 일치하는 완전한 사전 crRNAs의 체외 합성에 대한 수 있습니다. 전사 반응은 5 &#39;모노 포스페이트 테르 미니 (Termini) 14 얻기 위해 GMP와 중이오하지 않는 한 성적 증명서는 5&#39;-터미널 삼인산 존재와 생성됩니다. 성적표가 표시 될 경우 이러한 테르 미니 (Termini)가 필요합니다T4 폴리 뉴클레오타이드 키나제와 γ-[32 P]-ATP.로 Cas6 및 Cas6 같은 효소의 절단 활동은 5&#39;-수산기와 2 &#39;, 3&#39;-순환 인산염 테르 미니 (Termini)를 포함 crRNA를 생성합니다. 이러한 RNAs는 다음 캐스케이드 복잡한에 의해 인식 분석 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 남극 인산 가수 분해 효소 </td><td> 코 </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> 체외 음성 인식 그레이드 Ultrapure 염기 Triphosphates에 </td><td> Bioscience 예나 </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> 액체 크로마토 그래피, ktapurifier 100 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DNA의 oligonucleotides </td><td> MWG 오페론 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNA의 oligonucleotides </td><td> MWG 오페론 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 겔 추출 키트 </td><td> QIAGEN </td><td> 28,704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR 정화 키트 </td><td> QIAGEN </td><td> 28,104 </td><td></td></tr><tr><td> 스핀 Miniprep 키트 </td><td> QIAGEN </td><td> 27,106 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스미드 맥시 키트 </td><td> QIAGEN </td><td> 12,163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> 코 </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> 코 </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA Ligase의 </td><td> 코 </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> T4 폴리 뉴클레오타이드의 키나아제 </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA 중합 효소의 </td><td> 자신의 준비 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxynucleotide 솔루션 믹스 </td><td> 코 </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> 미니 프로테우스 테트라 전기 영동 시스템 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> 폭풍 840 스캐너 </td><td&gt; GE 헬스 케어 </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> 저장 Phosphorscreen </td><td> 분자 역학 </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> 모노 Q 50분의 5 GL </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion 고 충실도의 DNA 중합 효소 </td><td> 코 </td><td> M0530L </td><td> GC 버퍼를 사용하여 </td></tr><tr><td> Toluidine 블루 </td><td> 시그마 </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> 코 </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32 P]-ATP, α-[32 P]-ATP </td><td> 하트만 분석 </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

바이러스와 prokaryotic 호스트의 상호 작용이 박테리아와 archaeal 삶의 진화를 형성. Prokaryotes이 제한 수정, 불임 감염과 CRISPR / 카스 시스템이 포함되어 바이러스 공격을 피하기 위해 여러 전략을 개발했습니다. C는 내가 S hort P alindromic 연구 epeat (CRISPR) 시퀀스 및 sociated (카스) 유전자와 같은 C RISPR의 수 (그림 1) 1-3을 nterspaced egularly r을 lustered의 많은 박테리아 대부분의 Archaea에서 발견 된 이러한 적응 면역 시스템으로 구성되어 있습니다. 카스 단백질과 반복의 다른 세트 CRISPR / 카스 시스템 (4)의 적어도 세 가지 주요 발산 유형을 정의합니다. 보편적 인 단백질 Cas1 및 Cas2은 바이러스 DNA의 이해에 참여하는 제안됩니다연장 CRISPR 클러스터 (5)의 5 &#39;말단에서 두 반복 사이에 새로운 스페이서 요소를 생성합니다. 전체 클러스터는 모든 공백 및 반복 시퀀스를 포함하는 전구체 - crRNA로 베꼈되어 이후 작은 ​​crRNAs 6-8로 다양한 Cas6 가족의 효소에 의해 처리됩니다. 이 crRNAs은 5 &#39;터미널 (8 세포핵)과 3&#39;반복 순서 9에서 파생 터미널 태그가 옆에있는 스페이서 순서로 구성되어 있습니다. 새로운 crRNA이 바이러스 DNA에 카스 단백질 단지 (캐스케이드) 감독의 기본 complementarity 10을 통해 사용자로 식별 될 것 같은 바이러스의 반복 감염은 이제 차단 될 수 있습니다. 마지막으로, CRISPR / 카스에 1을 입력 한 시스템을위한, nuclease Cas3이 검출 된 침입자 DNA 11,12을 파괴합니다. 이러한 프로세스는 prokaryotes의 적응 면역 시스템으로 CRISPR / 카스를 정의하고 관련자 카스 단백질 연구에 대한 흥미로운 연구 분야를 열었습니다.많은 카스 단백질의 기능은 여전히​​ 어려운이며, CRISPR / 카스 시스템의 명백한 다양성의 원인은 조명 할 수 남아 있습니다. 대부분의 카스 단백질의 잠재적 인 활동은 자세한 계산 분석을 통해 예측했다. 카스 단백질의 단수가 하나 표시하거나 4 endonucleases으로 작동하도록 제안하고 있습니다. 여기, 우리는 카스의 endoribonucleases의 연구 crRNAs 및 전구체-cRNAs를 생성하는 방법을 제시한다. 다른 endonuclease의 assays 직접 RNA의 oligonucleotides 또는 실행 - 오프 스크립트 체외 T7 RNA 중합 효소의의를 통해 생성되는 이상 crRNA 및 사전 crRNA 시퀀스로 합성 할 수 있습니다 중 짧은 반복 시퀀스가 필요합니다. 이 방법론은 내부적으로 표시된 endonuclease 기판 및 합성 또는 돌연변이 crRNAs의 창조의 세대를위한 방사성 세포핵의 결합이 가능합니다. Cas6 endonuclease 활동이 5&#39;-hydr와 crRNAs에 사전 c​​rRNAs를 성숙하기 위해 사용된다oxyl과 2 &#39;, 3&#39;-순환 인산염 테르 미니 (Termini).

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Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

박테리아와 Archaea의 CRISPR / 카스 시스템 중재 적응 면역. 많은 카스 단백질은 길이를 변화의 crRNA의 전구체에 작용 endoribonucleases 역할을 제안하고 있습니다. 여기 카스의 endonuclease 활동의 생화학 분석을위한 사전 c​​rRNA 기판을 생성하는 세 가지 방법을 설명합니다.

CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

substrate-generation-for-endonucleases-of-crisprcas-systems

Research

JoVE Journal

Biology

27.2K 조회수.  Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology. 박테리아와 Archaea의 CRISPR / 카스 시스템 중재 적응 면역. 많은 카스 단백질은 길이를 변화의 crRNA의 전구체에 작용 endoribonucleases 역할을 제안하고 있습니다. 여기 카스의 endonuclease 활동의 생화학 분석을위한 사전 c​​rRNA 기판을 생성하는 세 가지 방법을 설명합니다.

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

진단 도구를 개발하기 위해 마이크로 전자 기계 시스템 (MEMS)를 사용

연구

생물학

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of cells (approximately 25 in C. borealis) which are well characterized. The cells in the STG exhibit a broad range of outputs and are responsible for the motor actions of the stomach. The stomach contains the gastric mill which breaks down food with three internal teeth, and the pylorus which filters the food before it reaches the midgut. The STG produces two rhythmic outputs to control the gastric mill and pylorus known as central pattern generators (CPGs). Each cell in the STG can participate in one or both of these rhythms. These CPGs allow for the study of neuromodulation, homeostasis, cellular and network variability, network development, and network recovery.
The dissection of the stomatogastric nervous system (STNS) from the Jonah crab (Cancer borealis) is done in two parts; the gross and fine dissection. In the gross dissection the entire stomach is dissected from the crab. During the fine dissection the STNS is extracted from the stomach using a dissection microscope and micro-dissection tools (see figure 1). The STNS includes the STG, the oesophageal ganglion (OG), and the commissural ganglia (CoG) as well as the nerves that innervate the stomach muscles. Here, we show how to perform a complete dissection of the STNS in preparation for an electrophysiology experiment where the cells in the STG would be recorded from intracellularly and the peripheral nerves would be used for extracellular recordings. The proper technique for finding the desired nerves is shown as well as our technique of desheathing the ganglion to reveal the somata and neuropil.

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric nervous system (STNS) of the Jonah crab (C. borealis) can be used for electrophysiology, immunohistochemistry, and cell culture studies. The STNS extraction is done in two parts: the gross and fine dissection.

암 보레알리스 Stomatogastric 신경계의 해부

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

랍스터의 뱃속의 총 해부, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

생물 학적 시스템에서 산소 이미징에 대한 인광을 발하는 나노 프로브의 합성 및 교정

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

미생물 시스템 생물학의 Chemostats의 사용

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...