종양 오르가노이드는 종양 생물학을 연구하기 위하여 체외암 모형으로 널리 이용되었습니다. 우리의 프로토콜은 암 생물학에 있는 각종 양상을 공부하는 중요한 공구로 봉사하는 방광 종양 오르가노이드를 격리, 문화 및 유전으로 조작하는 상세한 절차를 제공합니다. 우리의 프로토콜을 사용하여 방광 종양 오르가노이드를 유전적으로 조작하여 관심있는 유전자를 표현하거나 노크 할 수 있습니다.
또한, 직교 이식 방법을 통해 종양 미세환경 종양 장기형 종양을 만들 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실대학원생인 김유빈이 될 것입니다. 뮤린 방광 종양에서 방광 종양 오르간로이드를 확립하여 시작합니다.
DMEM에 1밀리리터를 첨가하여 종양 단편에 넣고 멸균 된 면도칼로 조직을 다진다. 파편을 세포 현탁액으로 해리하려면 HEPES, 콜라게나아제 1형 과 2형, 열분해를 종양 조각에 넣고 궤도 셰이커에서 섭씨 37도에서 1.5~2시간, 이산화탄소 5%를 배양합니다. 인큐베이션 후 셀 서스펜션을 50 밀리리터 튜브로 옮기십시오.
4°C에서 5분간 400배 g의 원심분리기를 하고 상복부를 흡인시합니다. ACK 용액 버퍼의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 적혈구를 lyse 3~ 5 분 동안 실온에서 튜브를 배양. 한편, 얼음 냉기 성장 인자 150 마이크로리터가 있는 24웰 플레이트에 잘 코팅하여 지하 멤브레인 매트릭스를 감소시키고 플레이트를 인큐베이터에 30분 동안 배치합니다.
세포와 튜브에 DMEM의 20 밀리리터를 추가하고 원심 분리를 반복합니다. 슈퍼나탄을 흡습하고 0.25%의 트립신 EDTA 및 10 마이크로몰러 Y-27632 디하이드로클로라이드의 1밀리리터로 펠릿을 재연한다. 37도 의 수조에서 5 분 동안 튜브를 배양하십시오.
그런 다음 10 %의 FBS로 DMEM의 10 밀리리터를 추가하여 트립신을 중화시다. 새로운 50 밀리리터 튜브의 100 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터링하여 소화되지 않은 이물질을 제거합니다. 4°C에서 5분간 400배 g의 원심분리기를 하고 상복부를 흡인시합니다.
그런 다음 DMEM의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고 혈류계로 세포를 계산합니다. 4개의 종양 세포에 3-4번 10번 을 얼음에 1.5 밀리리터 마이크로튜브로 옮기고 원심분리기는 섭씨 4도에서 3분 동안 400배 g로 옮긴다. 주체를 조심스럽게 제거하고 전동 된 오르가노이드 배지의 500 마이크로 리터 및 10 마이크로 몰라 Y-27632에서 세포를 재중단합니다.
세포 현탁액을 이전에 준비된 멤브레인 매트릭스로 옮기고 24웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 배치합니다. 2일마다 배지를 예온 된 오르가노이드 배지500 마이크로리터로 교체하십시오. 종양 오르가노이드를 12시간 전에 분할하여 렌티바이러스 매개 트랜스듀션을 합니다.
다음 날, 37도 의 수조에서 알리쿼트가 함유 된 바이러스를 신속하게 해동하십시오. 해동 바이러스를 10 마이크로몰라 Y-27632와 헥사디메린 브로마이드의 밀리리터당 8마이크로그램으로 유기성 배지의 250마이크로리터에 추가합니다. 24웰 플레이트의 오르간성 배지를 배지를 함유하는 바이러스의 500마이크로리터로 교체하고 37도에서 12~16시간 동안 플레이트를 배양하고 이산화탄소 5%를 배양한다.
치열 교정 이식을 위한 방광 종양 오르가노이드를 준비하기 위해, 24웰 플레이트의 오르가노이드 배지에 콜라게나아제 디스파제 500마이크로리터를 추가한다. 피펫 지하 멤브레인 매트릭스와 중간 위아래로 다음 37섭씨에서 20 분 동안 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션 후 세포를 15 밀리리터 튜브로 수집하고 예동 DMEM의 5 밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 4섭씨에서 3분간 400배 g의 튜브를 원심분리하고 수퍼네티드를 흡인시합니다. DMEM의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고 솔루션을 90mm 페트리 접시로 옮습니다. 현미경의 밑에, P200 파이펫을 가진 10 10 100의 종양 오르가노이드를 픽업하고 얼음에 마이크로 튜브로 그(것)들을 수집합니다.
마이크로튜브를 원심분리하고 상체를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 마우스가 수술을 받을 준비가 될 때까지 얼음 위에 펠릿을 유지합니다. 부막 방광 벽 이식 전에 주사기, 파이펫 팁 및 지하 막 매트릭스를 얼음위에 보관하십시오.
마우스가 마취된 후, 스핀 위치에 놓고 2%의 기화 이소플루란의 마스크 흡입에 의한 마취를 유지한다. 멸균 거즈로 포비도네 요오드를 바르고 70%에탄올로 닦아냅니다. 멸균 수술 가위를 가진 하부 중진 복부의 피부와 근육 벽에 작은 횡반 절개를 합니다.
복강에서 방광을 노출하고 식염수 에 젖은 면봉으로 지원합니다. 50% 고농도 지하 막 매트릭스를 함유한 오가노이드 배지의 80 마이크로리터에서 오르간노이드 펠릿을 재중단하고 인슐린 주사기를 사용하여 방광 돔의 전방 양상에 현탁액을 주입한다. 4-0 나일론 봉합사로 절개를 닫고 포비도네 요오드와 70 %의 에탄올로 수술 부위를 소독하십시오.
마우스가 적외선 조사기 아래에서 10~15분 동안 회복되도록 허용합니다. 그런 다음 마우스가 의식을 되찾을 때까지 마우스를 다시 모니터링합니다. 마우스 방광 종양 오르간노이드는 9 일 동안 확립되고 배양되었다.
종양 세포가 종양 오르가노이드를 형성하지 않는 경우에, 그(것)들은 잠재적으로 해리 단계 도중 살해되고 효소 소화 시간을 조정할 필요가 있을 지도 모릅니다. 방광 종양 오르간노이드는 성공적인 렌즈피바이러스 감염으로 강력한 GFP 신호를 나타냈다. 농도 후, 총 250마이크로리터의 매체를 함유한 바이러스는 지하막 매트릭스에 30, 000개의 단일 종양 세포를 감염시키고 90~100% 감염 효율을 유지하기에 충분하였다.
방광 종양 동종은 직교 이식 후 3 주 후에 수확되었고 종양의 히스토릭은 H&E 염색을 사용하여 분석되었다. 종양 오르가노이드의 정형외과 이식은 2 ~ 3 주 동안 방광 종양으로 성장할 수 있습니다. 이 절차에 따라, 연구원은 결과 종양 오르가노이드의 면역 조직 화학을 수행하거나 관심의 유전자에 대한 정량적 RT-PCR을 수행 할 수 있습니다.
이 실험은 종양 오르가노이드를 더 특성화 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 방광암의 종양 발생에 관여하는 각종 유전자의 특정 기능을 공부하기 위하여 종양의 생체 내 특성에서 유지하면서 마우스 모형에 쉽게 비교된 암세포에 있는 유전자를 조작할 수 있습니다.
