우리는 관심있는 유전자에 플록스 대립 유전자를 운반하는 정상적인 마우스 비뇨 생식기 세포의 생체 외 유전자 편집을 통해 방광암 오가노이드를 생성하는 신속하고 효율적인 프로토콜을 개발했습니다. 이 생체외 방법은 수년간의 마우스 번식 대신 일주일에서 이주일의 워크플로우를 가지며, Cre 매개 유전자 결실에 대한 아데노바이러스 형질도입에 매우 효율적이다. 시작하려면 가위, 집게, DPBS를 포함한 모든 멸균 기기와 시약을 35 밀리리터 배양 접시, 70 % 에탄올, 거즈 및 깨끗한 종이 타월에 준비하십시오.
다음으로, 해부 영역의 모든 표면을 청소하고 해부 영역을 깨끗한 종이 타월로 덮으십시오. 안락사 된 마우스를 해부 부위의 거즈에 놓고 마우스의 복부에 70 % 에탄올을 뿌린 다음 멸균 해부 가위를 사용하여 하부 중간 선 복부 절개를 만들어 방광을 노출시킵니다. 이제 포셉을 사용하여 방광을 잡고 부드럽게 당겨 양측 요관 접합부를 확인하십시오.
가위를 사용하여 방광 안저 2 개 사이의 경계선을 따라 방광 안저부를 제거하고 방광을 DPBS 2 밀리리터가 들어있는 멸균 접시로 옮긴 다음 지방과 결합 조직을 제거하고 방광을 DPBS 2 밀리리터가 들어있는 새 접시에 넣으십시오. 또한 영하 80도 저장소에서 아데노 바이러스를 제거하고 얼음 위에 보관하십시오. 세포 해리를 위해 원고에 설명 된대로 모든 멸균 기기와 시약을 준비한 다음 생물 안전 캐비닛에서 방광을 35 밀리미터 접시로 옮기고 2 밀리리터의 멸균 DPBS로 씻으십시오.
네 마리의 생쥐로부터 방광 조직을 숯을 벗긴 FBS가 없는 완전한 배양 배지 한 밀리리터가 있는 접시에 모으십시오. 다음으로, 외과 용 블레이드를 사용하여 각 방광을 네 개의 동일한 조각으로 다진 다음 포셉을 사용하여 방광을 펼쳐 요로 텔륨 표면을 매체에 노출시킵니다. 방광 조각과 배지를 15 밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다.
숯을 벗긴 FBS없이 2 밀리리터의 완전한 배양 배지로 접시를 두 번 씻고 원심 분리 튜브에 세척을 추가하여 총 부피를 5 밀리리터로 가져옵니다. 다음으로, 콜라게나제와 히알루로니다아제 혼합물을 첨가하고, 튜브를 섭씨 37도 오비탈 진탕기 인큐베이터에 수평으로 놓고 200 RPM에서 30분 동안 인큐베이터에 놓는다. 조직 소화 후, 동일한 부피의 10% 숯을 벗긴 FBS와 DPBS를 튜브에 넣고 200배 g에서 5분 동안 원심분리한다.
상청액을 버린 후, 2 밀리리터의 트립신 대체물을 세포 펠릿에 첨가하고 잘 섞은 다음, 튜브를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 4분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 세포를 표준 P1000 팁으로 10 번 위아래로 피펫하고 10 % 숯을 벗긴 FBS 및 DPBS 5 밀리리터를 첨가하십시오. 해리된 세포를 100-마이크로미터 멸균 세포 스트레이너를 통해 변형시키고, 세포 현탁액을 50-밀리리터 튜브에 수집한다.
세포 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮기고 5분 동안 200배 g에서 원심분리한다. 상청액을 제거한 후, 펠렛을 1 밀리리터의 완전한 배양 배지에 재현탁시킨다. 혈구세포계 및 플레이트를 사용하여 0.5회 10회 내지 6번째 세포를 0.5 밀리리터의 신선한 완전 배양 배지와 함께 24-웰 플레이트의 각 웰에 넣고 세포 수를 계수한다.
다음으로, Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 세포의 매트릭스 추출물을 영하 20도 저장에서 꺼내어 얼음 위에서 해동시킵니다. 또한 섭씨 37도 세포 배양기에서 6-웰 플레이트를 예열하십시오. 아데노바이러스 형질도입을 위해, 24웰 플레이트에 2마이크로리터의 아데노바이러스를 첨가하고, 해리된 비뇨생식기 세포와 잘 섞는다.
형질도입 효능을 향상시키기 위해, 플레이트를 30분 동안 300배 g에서 원심분리하여 스핀오큘레이션을 수행한 다음, 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 5% 이산화탄소로 인큐베이션한다. 세포 및 배지를 웰로부터 15-밀리리터 튜브로 옮기고 5분 동안 200배 g에서 원심분리한다. 상청액을 버린 후, 50 마이크로리터의 완전한 배양 배지를 첨가하고 하단의 세포와 잘 섞는다.
다음으로, 140 마이크로 리터의 매트릭스 추출물을 추가하고 기포를 피하기 위해 부드럽게 잘 섞은 다음 돔 당 50 마이크로 리터의 용액을 미리 데운 6 웰 플레이트에 신속하게 첨가하여 오가노이드 용 돔을 만듭니다. 플레이트를 인큐베이션하고 돔이 5 분 동안 응고되도록하십시오. 5분 후, 6-웰 플레이트를 거꾸로 뒤집고 추가로 25분 동안 응고를 계속한다.
배양 후, 2.5 밀리리터의 완전한 배양 배지를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 오가노이드 배양을 위한 인큐베이터에 놓는다. 녹색 형광 단백질은 거의 100 %의 세포에서 검출되었으며, 이는 아데노 바이러스 형질도입의 높은 효율을 시사한다. 삼중 녹아웃 오가노이드 종양의 헤마톡실린 및 에오신 염색 및 면역조직화학은 CK5 및 p63의 기저 아형 마커의 양성 단백질 발현과 함께 고급 비뇨생식기 암종의 형태를 나타내었다.
재조합되지 않은 플록스 대립유전자는 아데노바이러스로 처리되지 않은 비뇨생식기 세포에서 검출된 반면, 재조합된 대립유전자는 삼중 녹아웃 오가노이드에서 관찰되었다. 일반적으로, 2-센티미터 피하 종양을 형성하기 위해 2 내지 3주가 필요하였다. 생체내 이종이식편인 삼중 녹아웃 오가노이드의 면역조직화학은 CK7, CK5 및 p63 단백질의 양성 발현을 나타냈다.
CK8 및 우로플라킨 단백질에 대해 음성 발현이 검출되었다. 중간엽 마커인 비멘틴은 종양 캡슐 또는 스트로마에서만 검출되었다. 마우스 방광 해리가 30분을 초과해서는 안 됩니다.
더 긴 해리 시간은 내피 세포 및 섬유아세포와 같은 스트로마 세포의 백분율을 증가시킬 수 있으며, 이러한 접근법은 세포 분류 또는 세포형 특이적 아데노바이러스와 조합되어 루멘 대 기저 오가노이드와 같은 특정 오가노이드의 세포 유형을 생성할 수 있다.
