ETM37 및 암 연구 영국의 실험 암 의학 센터에서 지원 : 최고 과학자 사무실, 교부금 번호의 지원을 받고 있습니다 위에 작성자 FCO, DF, JN, DJH와 GDS의 작품은 멘션했습니다. AL의 작품은 에딘버러 (Edinburgh) 로버슨 신뢰, 관리 및 암과 의학 연구위원회의 치료를위한 멜빌 신뢰의 외과의 로얄 대학의 지원을 받고 있습니다. IO는 마리 퀴리 작업과 영국 의학 연구위원회 cofunded 에딘버러 (Edinburgh) 스코틀랜드 정부 활동의 로얄 학회에 의해 지원됩니다. 저자는이 문서에서 설명하는 주제의 일부에서의 유용한 토론을 SCOTRRCC 공동 신청자 및 공동 작업자 감사드립니다.

1. 형태학 및 분자 종양 이질성의 확인 <ol><li> 종양 -80 ° C의 냉동고에서 제거 드라이 아이스에 보관. </li><li> 약 1cm 3 부분으로 종양을 나눈다. 각 종양 서로에 대해 섹션을 고유 한 이름으로 라벨의 원래 위치를 매핑합니다. 스토어 샘플 -80에서 개인 cryovials에서 ° C 사용할 준비가 될 때까지. </li><li> 코트 샘플 10월 및 -22 ° C.에 그라 이오 스탯에 절단 </li><li> 샘플 Hematoxylin과 Eosin의 counterstaining 방법을 사용하여 얼룩이. </li><li> 냉동 섹션의 현미경 분석들이 ccRCC 자연, 가능한 종양 및 등급 (냉동 섹션에 Fuhrman 등급 1을 4 대 차별화 할 도전 낮은 등급 높은 등급 또는 혼합 고 / 저 등급)에 대한의을 보장합니다. 그림 1 A &amp; B (H &amp; E 염색 높은 낮은 혼합 학년). </li><li> 단백질 추출 각 종양 내의 각 morphologically 서로 다른 지역에서 4 샘플까지 선택합니다. </li></ol> 2. 종양 샘플에서 단백질 추출 <ol><li> 10월에서 종양 샘플을 잘라 버릴거야. </li><li> 용해 버퍼 990 μl 수있는 2 ML 튜브에 조직의 장 50-75 MG [50 MM 트리스 - HCL (산도 7.5), 5 MM EGTA (산도 8.5), 150 MM NaCl] aprotinin (시그마 A6279) (10 밀리그램과 보충 / ML), 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 2 (시그마, P5716), 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 3 (시그마, P0044)와 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈, 11836153001). </li><li> 각 튜브에 하나 5mm의 스틸 볼을 추가하고 두 번 각 5 분 기간이 지나면 TissueLyser를 사용하여 균질화의 수준을 확인 5 분을 위해 50Hz에서 균질화. </li><li> 뒤에 강철 공을두고 피펫을 사용하여 새 2 ML 튜브에 균질 샘플을 전송합니다. </li><li> 4 ° C.에서 30 분 동안 13,000 XG에서 centrifuging 전에 각 샘플에 트리톤 X-100의 10 μl를 추가합니다 </li><li> 신선한 microcentrifuge 튜브에 supernatants를 전송합니다. </li><li> BCA 분석을 (그림 2)를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. </li><li>1 MG / ML에서 단백질 농도를 정상화. </li></ol> 3. 항체 확인 <ol><li> 서부 얼룩에 대한 단백질 샘플을 (적절한 셀 라인 또는 조직에서 추출) 준비하고 10 % SDS-PAGE 젤에서 실행됩니다. </li><li> 4에서 하룻밤 니트로 셀룰로스 막에 샘플을 전송 ° C. </li><li> 상온에서 1 시간에 리튬 오호 오디세이 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석)에 멤브레인을 차단합니다. </li><li> 제조업체에서 리튬 오호 오디세이 차단 버퍼의 기본 항체를 (PBS에서 50:50에 희석) 희석 희석 1,000에 일반적으로 1 권장합니다. </li><li> 4 ° C.에서 밤새 차 항체의 멤브레인을 품다 </li><li> 0.1 % PBS-Tween20 (, 1 ML Tween20 / 1L PBS PBS-T)를 구성합니다. </li><li> 5 분 (X3)에 대한 실온에서 PBS-T의 멤브레인을 씻으십시오. </li><li> 오디세이 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석) 0.01 % 1:10,000 희석에서 SDS (1.5 μl/15 ML)에 차 항체를 휘황 라벨이 표시된 희석. </li><li> 차의 멤브레인을 품다부드러운 진동과 45 분 동안 실온에서 항체 - 그것이 마지막 스캔 작업이 완료되었으며, 같은 시간까지 빛으로부터 멤브레인을 보호하는 것이 중요합니다. </li><li> 어둠 속에서 막을 유지 5 분 (X3), 동안 실온에서 PBS-T의 멤브레인을 씻으십시오. </li><li> 다시 어둠 속에서 막을 유지 잔여 Tween20을 제거하는 5 분 (X3), 동안 실온에서 PBS의 멤브레인을 씻으십시오. </li><li> 어둠 속에서 필터 종이에 평면 멤브레인을 누워 건조한 공기 할 수 있도록 - 건조 할 수있는 멤브레인의 신호를 향상시키고 배경을 줄일 수 있지만, 벗겨하고 다시 프로빙하기에 쓸모 렌더링 할 수 있도록합니다. </li><li> LiCor 오디세이 스캐너에 멤브레인을 검사합니다. 이 스캔되어 같은 시간까지 어둠 속에서 막세요. </li><li> 만 정확한 분자량의 하나의 지배적 인 밴드를 생성 항체을 선택합니다. 그림 3은 RPPA와 함께 사용하기위한 허용 및 허용되지 않는 항체의 예를 보여줍니다. </li></ol> 4. RPPA PRInting <ol><li> 단백질 lysates는 MicroGrid II 로봇 반점을 찍는를 사용하여 니트로 셀룰로스 - 코팅 유리 슬라이드 (Fastslides-워트 먼지)에 발견되었다. 사용 슬라이드 샘플이 발견 된에이 패드가 포함되어 있습니다. 각 패드는이 경우 100 샘플에 동일한 샘플 발견되었습니다. 다른 사용 가능한 형식은 1, 8 및 16 패드 슬라이드가 포함되어 있습니다. 패드의 높은 번호를 작은 각에 발견 할 수 있습니다 샘플의 수입니다. </li><li> 오 2 배 dilutions 일련의 각 샘플에서 만든 각 그 다음 (샘플 당 15 곳의 총의 결과) 세중의에 발견되었다. </li></ol> 5. RPPA 단백질 감지 <ol><li> 초과 LiCor 차단 버퍼에 젖은 슬라이드 (PBS에서 50:50에 희석). 흔들 플랫폼에서 1 시간에 RT를 품다. </li><li> 원하는 농도에 LiCor 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석)에 차 항체 800 μl를 준비하고 얼음 계속. </li><li> 중은 (i) 단일 프레임 칩 클립에서 슬라이드를 마운트또는 (ii) &#39;FastFrame의 4 베이 슬라이드 홀더 그래서 시일이 슬라이드 및 배양 챔버 사이에 형성되는. </li><li> 우물에서 잔류 버퍼를 제거하고 각각의 우물에 600 μl 차 항체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 4에 밤새 플랫폼을 흔들에 봉인 된 서부 유럽 표준시 상자 및 배양에 슬라이드와 챔버를 배치 ° C. </li><li> 0.1 % PBS-Tween20 (; 100 μl 십대 초반 1백분의 20 ML PBS PBS-T)를 구성합니다. </li><li> 추운 방에서 슬라이드를 제거하고 신중하게 각 우물에서 차 항체를 제거합니다. </li><li> PBS-T 600 μl를 추가하고 5 분 (X3)에 대한 RT에서 플랫폼을 흔들에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 오디세이 차단 버퍼 (PBS에서 50:50에 희석) 0.01 % 첫 번째 인스턴스에서 1:2,000 희석 (1 μl / 2 ML)에서 SDS에 diluting하여 휘황 - 라벨 차 항체를 준비합니다. </li><li> 우물에서 버퍼를 제거하고 각각의 우물에 600 μl 휘황 - 라벨 차 항체를 추가합니다. 부드러운 진동과 45 분 동안 실온에서 보조 항체를 배양 -가이 마지막 스캔 작업이 완료되었으며, 같은 시간까지 빛으로부터 멤브레인을 보호하는 것이 중요합니다. </li><li> 상온에서 600 μl PBS-T에서 잘하고 간단히 세척 (X3)에서 차 항체를 제거합니다. 통신사에서 슬라이드를 제거 적당한 용기에 전송하고 어둠 속에서 막을 유지, 15 분에 대한 초과 PBS-T에 씻는다. </li><li> 다시 어둠 속에서 막을 유지, 잔여 십대 초반-20을 제거하는 PBS-T 및 15 분 동안 실온에서 PBS에 대한 추가 세탁 막을 제거합니다. </li><li> 10 분 50 ° C의 오븐에 Fastslide 건조 후 리튬 오호 오디세이 스캐너에 스캔합니다. 이 스캔 될 때까지 어둠 속에서 슬라이드세요. </li><li> 보조 항체 / 사용 항체에 따라 680 nm의 및 / 또는 800 nm의에서 슬라이드를 스캔합니다. 2 색 검출을 위해 항상 교차 반응성을 최소화하기 위해 매우 간 adsorbed 차 항체를 사용합니다. 기본 및 보조 항체에주의 선택은 2 색을 감지하기 위해 필요합니다. 주요 중요성의 선택은두 가지 기본 항체에 대해 다른 호스트 종 (예를 들면 토끼 및 마우스). 이 쉽게 구별 방출 스펙트럼과 염색으로 분류됩니다 항 토끼 반 마우스 보조 항체에 의한 차별 할 수 있습니다. </li><li> 이미지 파일은. tiff 파일로 저장됩니다. 그림 4는 (스캔 파일의 이미지). </li></ol> 6. 데이터 분석 <ol><li> MicroVigene 소프트웨어 (VigeneTech, 칼라일, MA, USA)를 실행합니다. </li><li> 엽니 다. RPPA 슬라이드의 검사를 포함하는 TIFF 이미지 파일을. </li><li> RPPA 슬라이드의 이미지에 오버레이 할 수있는 그리드를해야합니다 미리 정의 된 템플릿 파일을 선택합니다. </li><li> 클릭하여 그리드를 표시, 관심 (ROI) 버튼의 영역을 정의합니다. </li><li> RPPA 장소를 통해 그리드를 배치합니다. 그림 6A (이미지 이상의 격자의 이미지). </li><li> 모든 투자 수익 (ROI)을 강조하기 위해 모두 선택 버튼을 클릭합니다. </li><li> 모두 찾기를 클릭합니다. MicroVigene이 autom합니다atically 투자 수익 (ROI)을 찾아, 관광 명소를 찾아 배경을 빼야 모든 먼지를 제거하고 장소를 정할. </li><li> RPPA 슬라이드에있는 모든 샘플에 대한 결과를 가져보기 희석 곡선 버튼을 클릭합니다. </li><li> 희석 데이터 저장을 클릭합니다. </li><li> 각 샘플은 5 희석 포인트에서 인쇄되기 때문에 세중의에서 각 분석 15 점, 오류의 위험을 줄이고 커브 피팅의 품질을 향상 있습니다. MicroVigene는 항원 - 항체 결합 반응 속도론의 sigmoid 곡선을 생산하기위한 모든 부분을 포함 4 매개 변수 물류 - 로그 모델 &quot;Supercurve&quot;알고리즘 (그림 6B)를 생산하고 있습니다. 가정은 동일한 항체 - 항원 바인딩 속도론는 일반적인 응답 곡선에 맞게 배열에있는 모든 장소를 활용하여 따라서도 다른 샘플에 각각의 샘플 지점에 자리를하고있다하면 곡선 피팅 10,11의 신뢰를 높일 수 있다는 것입니다 Y = + ((BA) / (1 + E (C * D-솔직히 (X))) x는 dilutio입니다N 요소와 Y는 신호 강도입니다. 샘플은 비교적 분석에 supercurve로 사람들을 매핑 한 후 x 값의 중간 지점에있는 Y 값에 대응 y0 값을 사용하여 분석 할 수 있습니다. </li><li> 그림 7에서와 같이 Microsoft Excel 및 플롯 y0의 데이터를 내 보냅니다. </li><li> Intratumoral 단백질 차이는 ANOVA 프레임 워크의 치료 및 처리 치료 환자에 대해 개별적으로 계산되었습니다. 모든 분석 단백질의 데이터를 결합 분산 배포판은 맨 - 휘트니 시험 (MWT)로 비교했다. 잘못된 검색 속도 (루즈 벨트)이 수정은 12 적용, 각각의 단백질에 대한 Intratumoral 차이는 정상 상태와 homoscedasticity의 가정이 Lillefours 및 Fligner 테스트를 사용하여 각각 평가 개최 F-테스트에 비교했다. 치료 및 처리 환자 샘플 사이의 차동 단백질 표현식은 학생의 t-테스트를​​ 사용하여 각 단백질에 대한 테스트 된 곳 정상 상태 및 homoscedasticity 가정S는 달리 MWT이 수행되었습니다 충족 된, 루즈 벨트는 결합 t-테스트 및 MWT 값을 12으로 적용되었습니다. 단백질에 대한 단백질 표현과 분산 피어슨 상관의 의의는 표준 접근 방식을 사용하여 추정 된 [R 참조]와 루즈 벨트는 12을 적용했습니다. </li></ol>

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	<li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma.">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li><li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma.">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li><li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets.">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52 (2010).</li><li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors.">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li><li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. 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C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma.">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557 (2012).</li><li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis.">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li><li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. 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J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions.">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53 (2011).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 RPPA 방법은 단백질 분석의 널리 사용하지만 비교적 낮은 처리량 서부 얼룩 기술에 대한 높은 처리량 대안을 나타냅니다. 방법은 샘플 수백 분석 동시에 셀 라인과 조직 샘플의 다양한 선택의 주요 단백질의 직접 비교할 수 비교 반 정량적으로 할 수 있습니다. 다른 항체 종과 멀티플렉싱은 더 여러 항체를 동시에 사용할 수 있도록 기술의 힘을 증가시킵니다. 여기에 제시된 예는 종?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> aprotinin </td><td> 시그마 </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 2 </td><td> 시그마 </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 3 </td><td> 시그마 </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> 프로테아제 억제제 칵테일 </td><td> 로슈 </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 트리톤-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> 리튬 오호 오디세이는 버퍼 차단 </td><td> 리튬 오호 </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85,600 </td></tr><tr><td> MicroGrid II 로봇 감적 </td><td> Biorobotics </td><td></td></tr><tr><td> FastFrame의 4 베이 슬라이드 홀더 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> FAST 슬라이드 - 2 패드 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye 680LT 염소 안티 - 마우스 IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68020 </td></tr><tr><td> IRDye 800CW 염소 안티 - 토끼 IgG </td><td> Licor </td><td> 926-32211 </td></tr></tbody></table>

the use of reverse phase protein arrays (rppa) to explore protein expression variation within individual renal cell cancers

현재 전이성 투명 세포 신장 세포 암에 대한 치료 치료, 질병의 commonest 변형이 없습니다. 이 치료 저항에 핵심 요소가 질병 (1)의 분자 복잡한 것으로 생각됩니다. 같은 티로신 키나제 억제제 (TKI) sunitinib의 타겟 치료가 사용되어 왔지만, 환자의 단지 40 % 1 년 2 안에 원래대로 돌아가는 이들 환자의 절대 다수와 함께 응답합니다. 신장 세포 암 환자에 고유 및 취득 저항 등의 질문은 3 관련성이 있습니다. 효과적인 맞춤 치료를 개발의 궁극적 인 목표로, TKIs에 저항을 연구하기 위해, 대상 치료의 특정 기간 이후 순차 조직은, 만성 골수 양 백혈병 (4)에 성공적으로 입증 한 접근 방식을 필요합니다. 그러나 신장 세포 암종 이러한 전략의 응용 프로그램은 B의 높은 수준에 의해 복잡신장 세포 암종 5,6뿐만 아니라 다른 고체 종양 7의 기능입니다 oth 간 및 intratumoral 이질성. transcriptomic와 유전자의 차이로 인해 Intertumoral 이질성은 잘도 유사한 프리젠 테이션, 무대와 종양의 등급 환자에 설립되어 있습니다. 또한이 더욱 분자 이질성을 대표 할 가능성이 RCC에 큰 형태학 (intratumoral) 이질성이 있다는 것을 분명하다. 통합 형태학의 분석 및 Fuhrman 등급의 RCC 종양에 대한 상세한 매핑 및 분류는 proteomic 분석을위한 대표 지역의 선택을 할 수 있습니다. RCC 8 단백질 기반의 분석으로 인해 병리 실험실에서의 광범위한 상황에 매력적입니다하지만, 그 응용 프로그램은 특정 항체 9의 제한된 가용성으로 인해 문제가 발생할 수 있습니다. 역 위상 단백질 배열의 점 얼룩 자연 (RPPA), 항체 특이성은 반드시 B로 인해전자 사전은 - 확인, 사용 항체의 이러한 엄격한 품질 관리로 최고의 중요성입니다. 이러한 제한에도 불구하고 점 얼룩 형식은 하나의 니트로 셀룰로스 슬라이드로 샘플 수백 인쇄 수 있도록 검정 소형화을 허용하지 않습니다. 인쇄 슬라이드 그런 다음 멀티플렉싱을 허용, 대상 특정 기본 항체와 휘황 분류 이차 항체를 이용하여 서양 분석과 유사한 방식으로 분석 할 수 있습니다. 슬라이드에있는 모든 샘플에서 차동 단백질 표현식은 다음보다 비용 효율적이고 높은 처리량 방식으로 형광의 상대적 수준을 비교하여 동시에 분석 할 수 있습니다.

스캔 RPPA 슬라이드의 예는 680과 800 nm의 표시 채널을 모두 그림 4은 (i)에서 볼 수 있습니다. 파장, 그림 4 (II)에 의해 이미지를 분리하면 분석 할 RPPA 슬라이드와 그림 4 (III)를 결정 개별 단백질의 발현에 각 패드를 할 수 있습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 (iii) 본 샘플에서 개별 단백질의 표현은 Gelsolin이 훨씬 낮은 단백질 표현이 cMYC에...

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The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA이 휘황이라는 항체를 사용하여 동시에 심문을 할 수 니트로 셀룰로스 슬라이드에 인쇄 샘플 수백의 단백질 표현을 할 수 있습니다. 이 기술은 투명 세포 신장 암에서 약물 치료 이질성의 효과를 연구에 적용되었습니다.

개인 신장 세포 암에서 단백질 표현 변화를 탐험하기 위해 역 위상 단백질 배열 (RPPA)의 사용

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

33.5K 조회수.  University of Edinburgh. RPPA이 휘황이라는 항체를 사용하여 동시에 심문을 할 수 니트로 셀룰로스 슬라이드에 인쇄 샘플 수백의 단백질 표현을 할 수 있습니다. 이 기술은 투명 세포 신장 암에서 약물 치료 이질성의 효과를 연구에 적용되었습니다.

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Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

절연 신장 동맥 폐색에 대한 한깅 - 무게 시스템의 사용

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

연구

의학

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

양적 Immunofluorescence를 사용하여 종양의 단백질 표현의 이질 매핑

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

암의 생산 및 반응 산소 종의 감지 (ROS)

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a large extracellular domain and a short cytosolic domain termed the APP intracellular domain (AICD). During maturation through the secretory pathway, APP can be cleaved by proteases termed &alpha;, &beta;, and &gamma;-secretases1. Sequential proteolytic cleavage of APP with &beta; and &gamma;-secretases leads to the production of a small proteolytic peptide, termed A&beta;, which is amyloidogenic and the core constituent of senile plaques. The AICD is also liberated from the membrane after secretase processing, and through interactions with Fe65 and Tip60, can translocate to the nucleus to participate in transcription regulation of multiple target genes2,3. Protein-protein interactions involving the AICD may affect trafficking, processing, and cellular functions of holo-APP and its C-terminal fragments. We have recently shown that AICD can aggregate in vitro, and this process is inhibited by the AD-implicated molecular chaperone ubiquilin-14. Consistent with these findings, the AICD has exposed hydrophobic domains and is intrinsically disordered in vitro5,6, however it obtains stable secondary structure when bound to Fe657. We have proposed that ubiquilin-1 prevents inappropriate inter- and intramolecular interactions of AICD, preventing aggregation in vitro and in intact cells4. While most studies focus on the role of APP in the pathogenesis of AD, the role of AICD in this process is not clear. Expression of AICD has been shown to induce apoptosis8, to modulate signaling pathways9, and to regulate calcium signaling10. Over-expression of AICD and Fe65 in a transgenic mouse model induces Alzheimer's like pathology11, and recently AICD has been detected in brain lysates by western blotting when using appropriate antigen retrieval techniques12. To facilitate structural, biochemical, and biophysical studies of the AICD, we have developed a procedure to produce recombinantly large amounts of highly pure AICD protein. We further describe a method for inducing the in vitro thermal aggregation of AICD and analysis by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical, biophysical, and structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on AICD aggregation.

A method for large-scale purification of the APP intracellular domain (AICD) is described. We also describe methodology to induce in vitro AICD aggregation and visualization by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical/structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on its aggregation.

아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인의 정화 및 집계

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

그대로 Glomeruli 성인 쥐 신장에서 분리 하는 효율적인 체질 하 방법

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary to produce erythema (inflammatory reddening) on the surface of the skin. In this context, the MED is regarded as a key factor in determining starting doses for UV phototherapy for common skin conditions such as psoriasis and eczema. In research settings, MED testing also has potential to be a powerful tool for assessing within- and between-persons variation in inflammatory responses. However, MED testing has not been widely adopted for use in research settings, likely owing to a lack of published guidelines, which is a barrier to obtaining reproducible results from this assay. Also, protocols and equipment for establishing MED vary widely, making it difficult to compare results across laboratories. Here, we describe a precise and reproducible method to induce and measure superficial erythema using newly designed protocols and methods that can easily be adapted to other equipment and laboratory environments. The method described here includes detail on procedures that will allow extrapolation of a standardized dosage schedule to other equipment so that this protocol can be adapted to any UV radiation source.

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is used to establish dosage schedules for ultraviolet radiation phototherapy. It can assess individual variation in inflammatory response but lacks methodology for achieving reproducible results. Here, we present a precision implementation of MED and demonstrate its ability to capture individual variation in inflammatory response.

최소한의 홍반 복용량의 정밀 한 구현 (MED) 인간의 염증 반응에 개별 변화를 평가 하는 테스트

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...

Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research field. Accumulation of drugs in certain organs may give rise to adverse and unwanted effects, depending on the nature of injectate. To minimize spillover and/or accumulation in other tissues, the herein described method directs the formulation into the renal artery bloodstream by inserting a catheter in the infra renal aorta, just below where it branches into the renal artery, resulting in the kidney as first reached organ and distributing of formulation throughout the kidney.
This manuscript provides a detailed description of the method, as well as its challenges and difficulties. It guides the experimenter to become skillful with this type of microsurgery that requires accuracy under sterile conditions. Speed is crucial for minimizing the ischemia and practicing the procedure will increase the chance of successful injections without adverse effects. By modulating the time between injection and reperfusion as well as the injected volume, the risk of spillover to other organs is mitigated. 
Note that this technique is suitable for single dosing strategies.

This manuscript describes a method for targeted delivery to a single kidney via a catheter placed in the infrarenal abdominal aorta in the mouse.

신장 동맥을 통해 신장에 직접 약물 전달

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research ...