이 작품은 Crohn의 및 캐나다의 대장염 재단 (CCFC)과 건강 연구 (CIHR)에 대한 캐나다 연구소에서 BAV에 운영 보조금에 의해 지원되었다. 기가바이트는 CIHR에서 대학원 학생이기로 운영되었습니다. BAV는 장과 간 장애 (아동) 소아 Gastroenterology의 소아 IBD 연구 및 캐나다 연구 의자 재단 위원장과 어린이입니다.

1. Citrobacter rodentium Inoculum와 마우스의 사정 Gavage의 작성 <ol><li> 준비와 Luria Bertani 국물 (LB)를 압력솥. </li><li> 가능한 C.를 얻을 멸균 inoculating 루프 또는 피펫 팁을 사용하여 LB 한천 플레이트로 냉동 글리세롤 주식과 승리의 rodentium. 37 ° C 하룻밤에 품다. inoculating 루프 또는 피펫 팁을 사용하여 LB 플레이트의 식민지로 매 문화 관 멸균 LB의 국물 3 ML의 예방. inoculum의 준비는 무균 기술을 사용하여 수행해야합니다. </li><li> C.를 품다 rodentium 문화 aerobically 37 번 ° C 200 rpm으로 benchtop 부화 흔드는에서 하룻밤. 주사 LB의 국물은 밤새 문화 흐린 후 나타납니다. </li><li> 전구를 사용 밤새 C. 100 μl 각 마우스를 gavage하기 위해 1 ML의 주사기에 부착 된 위 gavage 바늘을 팁 rodentium 문화. 단단히 목 다시 위에 느슨한 피부를 쥐었고하여 부드럽게 안녕하세요, 마우스를,엄지와 손가락. 머리를 고정하고 gavage 바늘의 삽입을 위해 식도를 바르게 색인 손가락으로 동물의 머리를 뒤로 당겨. </li><li> 수직 위치에 마우스를 유지하고 입의 측면을 따라와 혀 위에 gavage 바늘의 전구 팁을 지시. 부드럽게 입의 지붕을 따라 바늘을 통과하고 식도를 내려 향상. 이 절차를 수행하는 동안 느낌이 어떤 저항이있을 경우 gavage 바늘을 제거하고 다시 삽입합니다. </li><li> 천천히 세균 inoculum 100 μl를 삽입하고 부드럽게 gavage 바늘을 제거합니다. 그 케이지에 반환 한 후 마우스의 호흡 속도와 동작을 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 참고 사항 : <ul><li> 2 단계와 3 단계에서 또한 국물 자체의 어떤 세균 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 밤새 배양 할 무균 LB의 국물 3 ML과 무균 기술을 사용하여 매 문화 튜브를 준비합니다. LB의 국물은 밤새 문화 이후에 명확 나타납니다. </li><li&gt;을 부드럽게 박테리아의 동등한 복용량은 4 단계에서 각 마우스에 전달 될 수 있도록 gavage에 주사기를로드하기 전에 매 관 내에서 문화를 선동. </li><li> 이 24 시간 이상 주사 한 경우 숙박 문화는 폐기해야합니다. </li><li> 모든 C. 감염된 동물의 rodentium 감염 및 주택은 바이오 레벨 2 시설에서 수행되어야한다. </li></ul> 2. C.에 Colonic 상피 장벽 투과율 측정 rodentium에 감염된 마우스 <ol><li> 원하는 시점 이후의 감염에 장벽 무결성을 측정합니다. </li><li> 검정의 날, 4 kDa fluorescein의 isothiocyanate (FITC) - dextran 150 μl 각 마우스를 gavage하고 표준 곡선을 준비하는 80 MG ML -1의 농도로 생리 (PBS)를 버퍼 인산에 용해 충분한 준비합니다. </li><li> FITC-dextran의 150 μl와 안녕하세요, 마우스와 gavage. 이 시간에 우리를에서 음식을 철회 할 수 있습니다. </li><li> 후 마우스에게 4 시간을 마취gavaging 및 심장 구멍을 통해 가능한 한 많은 양의 피 (~ 450 μl)로 수집합니다. 응고를 억제하는 microcentrifuge 관 3퍼센트 산 구연산의 덱스 트로 오스의 최종 농도에 혈액을 추가합니다. 쥐를 안락사시켜야하고 박테리아 카운트 (단계 3.1-3.5)에 대한 PBS에서 colonic 조직을 수집하고 조직 고정 용 포르말린, 그리고 궁극적으로 immunofluorescence 얼룩 10 % (단계 4.1-4.8)에 있습니다. </li><li> 4 ° C.에서 원심 분리기에서 12 분 1,000 XG에서 혈액 샘플을 스핀 혈청을 수집하여 PBS의 10분의 1과 1 / 100 희석. 복제에 96 잘 판에이 두 dilutions 각 샘플 100 μl를 추가합니다. </li><li> 표준 곡선을 준비하려면 원래의 80 MG ML -1 FITC-dextran은 다음과 농도에 PBS에서 쥐를 gavage하는 데 사용 희석 : 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 μg / ML . 세중의에 96 잘 판에 각 농도 100 μl를 추가합니다. </li><li> 여기 WAV에서 fluorometer를 사용하여 각 샘플의 형광을 수량화485 나노 미터와 535 nm의 방출 파장의 elength. </li><li> 표준 곡선을 음모하여 원시 데이터를 분석합니다. 입력 각 샘플에 FITC-dextran의 농도를 결정하기 위해 표준 곡선에 의해 생성되는 라인의 방정식에 각 샘플에 대한 원시 데이터입니다. </li></ol> 참고 사항 : <ul><li> 4 단계 이후로, 얼음에 혈액 샘플을 유지하고 빛에 노출을 최소화합니다. </li><li> 심각한 조직 손상이이 시점 이후에 발생로 시점에서, 또는 그 이전에 상피 장벽 무결성을 측정 할 경우 7 일 이후 감염 최적입니다. 심각한 피해가 발생하기 전에 장벽 무결성을 측정하면 C. 동안 투자율의 최대 차이를 확인할 수 있습니다 마우스 변종 사이의 rodentium 감염. </li><li> 감염되지 않은 컨트롤 마우스도 상피 장벽의 무결성에 대한 테스트되어 있는지 확인합니다. </li></ul> 3. C.의 조직에서 세균 하중 측정 rodentium에 감염된 마우스 <ol><li> 한 ML 멸균 PBS를 추가ND은 원형에 구슬 autoclaved 금속은 무균 기술을 사용하여 두 ML의 원심 분리기 튜브를 버린. 각 동물로부터 수집 된 개인 조직은 별도의 PBS 튜브에 배치됩니다. 조직의 추가하기 전에 튜브를 무게. </li><li> 마우스에서이게 맹장과 결장을 제거합니다. 콜론에서이게 맹장을 분리하고 집게를 사용하여 luminal 내용을 밀어. PBS 관에 내용을 추가합니다. 10% 포르말린 고정의 말초 콜론과이게 맹장에서 0.5 cm 섹션을 분리 한 후 길이 방향으로 나머지 콜론과이게 맹장을 잘라 튜브에 조직을 배치하기 전에 멸균 PBS로 씻어. </li><li> 조직과 PBS 튜브를 무게 그리고 30 Hz에서 6 분을 위해 구슬 때리는를 사용하여 샘​​플을 균질화. </li><li> 무균 기술 사용 96 잘 플레이트에 잘 당 180 μl 멸균 PBS를 추가합니다. 각 행의 첫 번째도 각 균질 샘플의 20 μl를 추가합니다. 잘 섞어서 순차적으로 (먼저 10 -1에서 dilutions를 얻기 위해 잘 각 이전에서 20 μl를 추가 희석10 -6까지) 붙인다. 그리드와 사각형 바닥 LB 플레이트에 세중의 각 샘플에서 각 희석의 플레이트 10 μl. 37 박 품다 ° C. </li><li> 그리고 평균 식민지 성형 단위 (CFU), 3 카운트를 계산하고, 각 샘플이 계산 된에 희석를 기록합니다. 원래 1 ML 샘플의 20 μl이 사용 된 것처럼, 50으로 평균 CFU를 곱하며, 샘플 CFU / ML의 결과로 계산 된에 희석 요인에 의해. 마지막으로, CFU / g를 결정하는 조직 무게로 나눕니다. </li></ol> 4. 조직 학적 평가와 감염된 장 조직의 Immunofluorescence 착색 <ol><li> 단계 3.2에서와 같이 조직을 수집합니다. 포르말린 하룻밤에 저장 조직은 다음 70 % 에탄올로 씻는다. 파라핀에 조직을 추가하고 착색 5 μm 섹션을 잘라. 조직 학적 평가에 대한 hematoxylin &amp; eosin으로 청바지와 immunofluorescence 얼룩을위한 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 이전 착색에 조직을 deparaffinize하려면, 장소에 슬라이드65 10 분에 대한 ° C 물 목욕에 coplin의 착색 병 등을 넣어. 다음, 2 분마다 네 개의 세차에 대한 크실렌의 장소 슬라이드. 95 % 에탄올, 75 % 에탄올과 DH 2 0 : 슬라이드가 다음 하나 5 분 다음 각 세척에 이어 100 % 에탄올에 두 개의 5 분 세차와 rehydrated해야합니다. 이러한 세차는 유해한 증기에 노출을 피하기 위해 퓸 배출 후드에서 수행해야합니다. </li><li> 30 분의 증기선에 미리 예열 나트륨 구연산 버퍼 한 후 이곳의 coplin 병의 장소 슬라이드 한 다음 30 분에 앉아 보자. 이 과정은 단백질 잠재적 인 antigenic 사이트를 검색 포르말린 고정에 의해 형성된 간 링크를시킵니다. </li><li> 5 분 세 번 PBS azide로 씻으십시오. 드라이 슬라이드와 조직에 지역화 착색의 시약을 유지, 소수성 장벽을 생성 할 수 PAP 펜과 조직 주변 마크 공간이 마련되어 있습니다. </li><li> immunostaining 수분 챔버에서 차단 버퍼로 실온에서 1 시간 (예 : α-염소 혈청)에 대한 블록 조직. </li><li> 꼼꼼한를 희석워 항체가 원하는 농도에 항체 희석 버퍼를 사용합니다. 버퍼를 차단 해제 넣어와 조직에 주요 항체의 50-100 μl를 추가합니다. 4 2 시간에 ° C 야간이나 실내 온도에서에 품다. </li><li> 5 분 세 번 PBS azide로 씻으십시오. 어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 조직 및 배양에 항체 희석 버퍼에 희석 이차 항체의 50-100 μl를 추가합니다. 5 분 세 번 DH 2 O로 씻으십시오. </li><li> DAPI 골드 장착 중간을 연장하고 coverslip을 적용 추가 슬라이드를 탈수. 형광 현미경 슬라이드를 표시합니다. </li></ol> 참고 사항 : <ul><li> PBS azide는 4 단계 이후의 세척 매체의 박테리아 성장을 방지 할 수있는 대안으로 신선하게 조리 된 PBS로 대체 할 수 있습니다. </li></ul>

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T., Man, C., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88+signalling+plays+a+critical+role+in+host+defence+by+controlling+pathogen+burden+and+promoting+epithelial+cell+homeostasis+during+Citrobacter+rodentium-induced+colitis.">MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis.</a> Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).</li><li>Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signaling+mediated+by+MyD88+is+required+for+a+protective+innate+immune+response+by+neutrophils+to+Citrobacter+rodentium.">TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium.</a> Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).</li><li>Bry, L., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+T+cell+dependent+serum+antibody,+but+not+the+gut-associated+lymphoid+tissue,+for+surviving+acute+mucosal+infection+with+Citrobacter+rodentium,+an+attaching+and+effacing+pathogen.">Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).</li><li>Simmons, C. P., Clare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+for+B+lymphocytes+and+CD4++T+cells+in+immunity+to+infection+by+the+attaching+and+effacing+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection &amp; Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).</li><li>Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Roles+of+Notch+and+Wnt/&#946;-Catenin+Pathways+in+the+Regulation+of+Hyperplasia+and/or+Colitis+in+Response+to+Bacterial+Infection.">Critical Roles of Notch and Wnt/&#946;-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection.</a> Infection &amp; Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).</li></ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

Citrobacter rodentium 감염은 전염성 질병과 쥐 대장염 모두의 연구 귀중한 모델을 제공합니다. 이 독특한 모델은 두 호스트 응답뿐만 아니라 세균의 병원성 속성의 특성을 허용합니다. 단계는이 프로토콜 세부 사항에이 모델의 성공적인 사용을 설명했다. 대장염을 유도하고 응답을 분석 할 때 염두에 두어야 할이 프로토콜의 여러 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 신선한 밤...

장용 세균 병원균에 의해 감염이 위장 (GI) 염증뿐만 아니라, 설사 및 장 상피 장벽 기능 장애 등의 장 병리학 및 pathophysiology을 트리거합니다. 세균성 병원체가 자신의 호스트,뿐만 아니라 감염에 대한 방어를 특정 호스트 응답의 GI 기관을 식민지화하는이 독성 메커니즘이 잘못 이해되어 장용 세균 감염의 모델링에 그러나 최근 발전은 이러한 프로세스에 대한 우리의 이해를 돕기 위해 시작했습니다. 장용 박테리아는 또한 염증성 장 질병 (IBDs)에 연결되었습니다. IBDs Crohn의 질병 (CD)와 UC 만성 장 염증 및 조직 손상을 특징으로 알 수없는 병인의 복잡한 질병입니다. 이러한 dextran 나트륨 황산 (DSS)와 D와 같은 화합물과 화학 도전에, 마우스 - / - 장 염증의 많은 마우스 모델은 IL10와 같은 유전자 변형 종자에 자연스럽게 염증의 존재initrobenzene 설 폰산 (DNBS) 1. 그것은 IBD 환자에 존재 maladaptive 만성 염증성 반응이 장의 박테리아에 장 점막 면역 시스템의 이상 노출 2, 그러므로 전염성 대장염의 모델의 연구는 잠재적으로 병원성 호스트를 정의하는 중요한 가능성을 제공에 유전자 민감한 개인에 개발하는 가설되었습니다 . 장용 박테리아에 대한 답변 Citrobacter rodentium 유도 대장염은 장의 박테리아와 IBD의 pathogenesis의 잠재적 인 메커니즘의 추가 이해에 대한 호스트 응답의 분석을 위해 수 있도록 잘 1,3를 특징으로 한 감염성 대장염의 희귀 모델 중 하나이며, 필수 단계 소설 예방 및 치료 치료를 개발 인치 C. rodentium는 밀접하게 중요한 인간과 관련되어 (A / E) g 부착 부정적인 및 나온다, 손쥐 특정 세균 병원균입니다병원체 enteropathogenic E. 대장균 (EPEC) 및 enterohaemorrhagic E. 대장균 (EHEC) 3-8. A / E의 병원균의 가족은 깊은 숙주 세포에 비 침습적 받침대와 같은 구조를 형성 cecal과 colonic 상피의 꼭대기 숙주 세포 막에 첨부합니다. C.이있는 구두 도전 10 8 -10 9 생물의 rodentium은 crypts, mononuclear 면역 세포 침투와 고 블렛 셀 고갈 3,4의 colonic 증식이나 신장을 특징으로 전염성 대장염의 강력한 모델을 생산하고 있습니다. 식민지의 초기 사이트는 몇 시간 도전 한 후, cecal 패치에 2-3일 감염 3 후 말초 콜론으로 진행을합니다. 면역 적격 마우스 변종에서 병원균의 등급이 3-4주 감염 1,3,4 후에 이루어집니다. 그러나 많은 유전자 변형 종자는 즉, 유전자 결함 또는 녹아웃 (- / -) 생쥐는 increa를 표시 할 수 발견되었습니다과장 손상 및 / 또는 만성 감염과 염증 9-14의 결과로 감염에 느끼기 쉬운 상태를 SED. 이 녹아웃의 변종이 전염성 대장염 모델의 사용, 본래 신호 단백질이 부족한 많은 사람들이, 장 감염 및 염증의 해상도에 필수적인 여러 호스트 단백질을 드러내 indispensible있다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Luria 국물 </td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> 물 1L에 LB 가루 25g을 추가합니다. 사용하기 전에 압력솥. </td></tr><tr><td> 그리드와 광장 바닥 판 </td><td> 어부 </td><td> 08-757 - 11A </td><td></td></tr><tr><td> 팔콘 문화 관 </td><td> Sarstedt </td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td> 전구는 위 gavage 바늘이 팁 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 18060-20 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ML의 주사기 </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDa FITC - dextran </td><td> 시그마 </td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td> 구연산 </td><td> 시그마 </td><td> C7129 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 나트륨 시트르산 </td><td> 어부 </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> 우선 당 </td><td> 어부 </td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td> 산성 구연산 덱스 트로 오스 </td><td></td><td></td><td> 20 MM ctiric 산, 110 MM 나트륨 구연산, 5 MM 덱스 트로 오스 </td></tr><tr><td> 블랙 96 - 웰 플레이트 </td><td> 어부 </td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td> 금속 구슬 (5 ㎜) </td><td> Qiagen </td><td> 69,989 </td><td></td></tr><tr><td> 포르말린 10% </td><td> 어부 </td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ML의 약병 </td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> 어부 </td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin </td><td> 어부 </td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td> 크실렌 </td><td> 어부 </td><tD&gt; HC700-1GAL </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> 시그마 </td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin의 착색 병 </td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 시트르산 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 10 MM 나트륨 구연산, 0.05 % 십대 초반 20 pH를 6.0 </td></tr><tr><td> 자궁 펜 </td><td> Cedarlane </td><td> Mu22 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 혈청 </td><td> 시그마 </td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> 어부 </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 </td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 azide </td><td> 시그마 </td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td> 버퍼를 차단 </td><td></td><td></td><td> 2 % 염소 혈청, 1 % BSA, 0.1 % 트라이 튼 X-100, 0.05 % 십대 초반 20 0.05 % 나트륨azide, 0.01 M PBS, pH를 7.2, 4에 혼합 및 저장 ° C. </td></tr><tr><td> 항체 희석 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 0.1 % 트라이 튼 X-100, 0.1 % BSA, 0.05 % 나트륨 azide, 0.04 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td></tr><tr><td> 티르에 대한 차단 버퍼 및 항체 희석 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 위와 같이하지만, 세제의 추가 (트라이 튼 X-100과 십대 초반 20)없이 동일 요리법 </td></tr><tr><td> DAPI와 골드 Antifade의 시약을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> 어부 </td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td> Benchtop 부화 흔드는 </td><td> Barnstead 연구소 선 </td><td> 최대 Q4000 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorometer </td><td> Perkin 엘머 </td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td> 냉장 원심 분리기 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td> 기선 </td><td> 블랙 &amp; 데커 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> Zeiss </td><td> Axio Image.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

the citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis

이 프로토콜은 전염성 질환과 대장염의 강력한 모델을 생산하는 데 필요한 단계뿐만 아니라, 마우스에 Citrobacter rodentium 감염을 특징하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. C.는 rodentium는 밀접하게 임상 적으로 중요한 인간 병원체 enteropathogenic E. 관련되어 g 제외, 손쥐 특정 세균 병원균입니다 대장균 및 enterohemorrhagic E. 대장균. C.로 감염시 rodentium, 면역 적격 마우스는 겸손과 과도 체중 감소, 설사로 고통 받고 있습니다. Histologically, 장 토굴 신장, 면역 세포 침투 및 고 블렛 셀 고갈을 준수하고 있습니다. 감염의 등급이 3-4주 후 이루어집니다. 감염 후 다른 시간 지점에서 장 상피 장벽 무결성, 박테리아 부하 및 조직 학적 손상의 측정은 감염에 민감 마우스 종자의 특성을 수 있습니다. 독성 메커니즘s이 (가) 세균성 병원체가 자신의 호스트,뿐만 아니라 감염에 대한 방어를 특정 호스트 응답의 창자를 이식하는이 제대로 이해하고 있습니다. 따라서 C. 장용 세균 감염의 rodentium 모델은 이러한 프로세스에 대한 우리의 이해에 도움이 할 수있는 유용한 도구 역할을합니다. 장용 박테리아는 또한 염증성 장 질병 (IBDs)에 연결되었습니다. 그것은 IBD 환자에서 볼 수 maladaptive 만성 염증성 반응이 장의 박테리아에 장 점막 면역 시스템의 이상 노출 후 유전자 민감한 개인에 개발하는 가설되었습니다. 따라서, 전염성 대장염의 모델의 연구는 장용 박테리아에 잠재적으로 병원성 호스트 응답을 정의하기위한 중요한 가능성을 제공합니다. C.는 rodentium 유도 대장염은 IBD의 pathogenesis의 잠재적 인 메커니즘에 대한 우리의 이해를 발전, 장용 박테리아에 대한 호스트 응답의 분석을 허용 하나의 희귀 한 모델이다;소설 예방 및 치료 치료의 개발에 필수적.

표준 감염 실험이 진행되는 동안, 마우스는 100 μl 박 C.의 gavage을 통해 약 2.5 X 10 8 CFU에 감염된 rodentium 문화. C.와 C57BL / 6 마우스의 감염 겸손과 과도 체중 감소, 설사에 rodentium 결과이다. C57BL / 6 마​​우스와 드문, 동물은 병이되고 euthanization가 필요할 수 있습니다 있지만. 따라서, 쥐가 다른 변종은 감염에 의해 영향을받습니다 할 수있는 범위를 결정하기 위해, 체중 ?...

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The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium 감염이 장의 세균 감염을 공부뿐만 아니라 마우스의 면역 반응 및 대장염를 개최 할 수있는 중요한 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 장벽 무결성, 병원체 부하와 손쥐 전염성 대장염에 대한 병원체 및 호스트 공헌의 철저한 특성을 허용하는 조직 학적 손상의 측정을 설명합니다.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; 마우스 모델 : 감염성 대장염에 대한 공부 병원체 및 호스트 기부

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

26.3K 조회수.  BC Children's Hospital. Citrobacter rodentium 감염이 장의 세균 감염을 공부뿐만 아니라 마우스의 면역 반응 및 대장염를 개최 할 수있는 중요한 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 장벽 무결성, 병원체 부하와 손쥐 전염성 대장염에 대한 병원체 및 호스트 공헌의 철저한 특성을 허용하는 조직 학적 손상의 측정을 설명합니다.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

의 4D 좌석 Multimodality 이미징<em&gt; Citrobacter rodentium</em마우스에서&gt; 감염

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

로컬 및 전신 사이트에서 병원체에 의한 만성 염증을위한 마우스 모델

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

와 실험 감염<em&gt; 리스테리아</em&gt; 호스트 인터페론-γ 응답 유학을위한 모델로

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 Ex Vivo 닭 기본 Bursal 세포 배양 모델

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...