우리는 개발 버전이 10의 기반이되는 원래의 프로토콜을 가르치는 아이다 드 라 쿠 르스에 감사드립니다. Buttitta 연구소의 작품은 NIH 교부금 GM086517에 의해 지원됩니다.

1. 축산 비행 <ol><li> 크로스 10 ㎖ 효모 포도당 보통 3 또는 원하는 다른 단백질이 풍부한 미디어 좁은 플라스틱 병에서 원하는 유전자형의 파리. 생체 내 형광 단백질 발현과 추적 조직의 특정 표현과 혈통에 사용할 수있는 광범위한 초파리 유전자 변형 도구는 다른 4,5 자세히 설명되어 있습니다. 24 시간 자손 컬렉션 시리즈를 얻기 위해 매일 신선한 유리 병에 부모를 전송하거나 더 정확한 스테이징, 한천 플레이트에서 배아를 수집하고 10 설명 된대로 유리 병에 새로 부화 한 유충을 전송합니다. 실험을 통해 균일 한 조건을 보장하고 혼잡 방지하기 위해, 하나의 유리 병 F1 자손의 총 개수는 100 개 이하이어야한다. 실험의 유전 디자인에 따라 원하는 발달 단계까지 적절한 인큐베이터에 튜브를 유지합니다. </li><li> 실험 동물을 수집하여 제 3 애벌레 성숙한 유충이 필요합니다정확한 번데기 스테이징 애벌레의 해부 또는 흰색 prepupa (WPP)에 대한 개발 110-120에 대한 시간의 령 (L3). 비 증식 상태로 전환 등의 극적인 세포주기의 변화는 변태 12,13 동안 별개의 timepoints에서 발생합니다. 번데기의 따라서 정확한 스테이징 (개발 1 시간 이내) 변태 동안 재생 세포주기 데이터에 대한 필수적입니다. 그림 1과 같이 WPP (0 시간 APF) 번데기 형성 후 0 시간에 해당 패널의 I. 약간의 습도를 유지하기 위해 물 2.5 mL로 젖은 접힌 Kimwipe에 35mm 페트리 접시에 WPP를 수집합니다. 나이 번데기까지 적절한 온도 단계 (시간 APF) 원하는. 개발 29 1.2 배 빠른 속도로 진행합니다 18에서 더 느리게 ° C와 2.2 배 ° 표준 25 ° C 14에서보다 C. </li><li> 9,11가 필요한 경우 복제를 혈통 추적에 열 충격 flipase (HS-FLP)에 의한 재결합을 활성화하기 위해 열 충격 동물. 유충, 몰입의 열 충격물 목욕 (37 ° C로 설정) 및 유충을 확보에 유리 병이 완전히 빠져들 수 있습니다. 번데기의 열 충격, 파라 필름 완전히 물속에 그 물을 욕조에와 페트리 접시를 밀봉하십시오. 동물의 생존을위한 충분한 산소를 교환 할 수 있도록, 열 충격 후 파라 필름을 제거해야합니다. 열 충격의 기간은 flipase의 사용 유전자 원하는 클론의 수의 활동에 따라 달라집니다. 우리는 일상적으로 HS-FLP 유전자 동안에, HS-FLP 첫 번째 염색체에있는 유전자 35 밀리미터 요리 번데기의 열 충격에 대한 2-4 분에 유충의 클론에게 15 추적 혈통 &quot;flipout&quot;를 유도 7-8 분 사용 두 번째 염색체는 20 분을 필요로합니다. 열 충격 클론 비슷한 숫자를 얻었다. </li></ol> 세포 분열 및 해부의 시간의 비율은 각 조직에서 복제 크기를 결정합니다. 정상적인 조건에서, 우리는 클론 20 분 열 충격 (두 번째 염색체에 HS-FLP 유전자를 사용하여) dissec와 애벌레 날개에 유도 것을 발견테드 48 시간 후, 복제 당 네 개의 셀 주위에 평균과, 클론 당 10 세포 클론 당 두 개의 셀에 이르기까지 크기에 약 20 ~ 30도 분리 된 클론이 포함되어 있습니다. 반면, 0 시간 APF에서 배양 접시에있는 번데기의 동일한 HS-FLP 유전자를 가진 7 분 열 충격에 36 시간 이상 해부 수익률도 평균과 1 ~ 4 셀까지 (약 15-25) 클론을 분리 클론 당 2.2 세포. 이러한 데이터는 연구 결과에 따라 조직의 평균 셀 배가 시간을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 2. 해부 <ol><li> 부드럽게 1X PBS를 포함하는 투명 유리 해부 접시에 애벌레 / 번데기를 전송합니다. </li><li> 해부 현미경과 충분한 빛을 사용하여, 부드럽게, 선명 이녹스 5 forcep과 복부에 유충을 파악 마이크로 가위로 전방 제를 잘라 애벌레를 잡고 후방을 향해 입 영역을 안쪽으로 밀어 앞쪽에 세 번째 반전 표피 정상 (그림 1A). 조심스럽게 opaqu 제거전자 체지방과 같은 날개, 눈이나 뇌 원하는 조직의 가시성을 높이기 위해 남아있는 용기. 원하는 조직을 해부, 청결 포셉, 입 후크의 눈, 또는 눈 (그림 1G)의 뇌와 기관 및 표피에서 날개를 제거. </li><li> 번데기 해부를 들어, 번데기 안쪽 (그림 1C)을 손상을 방지하기 위해, 공기 거품이있는 곳에 부드럽게 번데기 케이스의 앞쪽 끝으로 번데기를 파악하기 위해 forcep을 사용합니다. 반대 손에 포셉 또는 마이크로 가위는 올바른 파악을위한 위치 유동 번데기를하는 데 도움이 될 수 있습니다. 청결 마이크로 가위로 번데기의 후방 끝을 잘라. 이 단면 컷 흉부와 머리에 원하는 조직으로 histolyzed 지방을하지 않고 내부 압력을 해제하기 위해 동물의 지느러미 부분을 향해 약간의 각도로 만들어 져야한다. 날개와 전방의 눈 - 뇌 단지를 피하는 등의 중간을 따라 조심스럽게 잘라냅니다. 조심스럽게 번데기에서 번데기를 제거번데기 표피의 후방 가장자리를 잡고 번데기 경우 (그림 1D)의 당겨 케이스. 집게와 눈 - 뇌 복잡한 표피 전방에있는 작은 구멍을 찌를. 고무 전구 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 histolyzed 지방과 나머지 창자 조직을 제거하기 위해 부분적으로 해부하는 번데기를 통해 PBS 해부 솔루션을 씻는다. 이것은 또한 효과적으로 나중에 유리 피펫의 내부에 달라 붙는 해부 조직의 발생률을 감소 지질과 단백질과 유리 피펫을 윤활. </li><li> 번데기 날개를 얻으려면, 표피 날개를 포위하고 날개 자체는 번데기 (그림 1E)에서 치러야해야합니다. 이 측면에서 쫓아 내기 전에 두 날개 표피의 가장 뒤쪽 끝을 파악하기 위해 다른 forcep을 사용하여 당겨 또는 힌지 근처의 날개 아래 forcep을 조종하면서 하나의 forcep으로 머리에 의해 번데기를 누른 할 수 있습니다 시체 (Figure 1E). 날개는 절단 된 후 또는 신체에서 제거하고 멀리 시체 및 기타 자료의 더미에 넣어 힌지에 찢길 수있다. </li><li> 눈 - 뇌 복잡한 빠질와 번데기 (그림 1F, 1H)에서 무료로 될 때까지 번데기 눈이나 뇌를 얻으려면, 번데기를 씻는다. forcep을 사용하여 부드럽게 두뇌에서 떨어져 번데기의 눈을 끌어와 원하는 조직을 저장합니다. </li><li> 결과가 이상 세포가 동물을 연 후 PBS에 남아 정확도가 떨어질대로, 각각의 샘플을 해부하는 45 분보다 오래 걸릴하지 않습니다. </li></ol> 3. 조직 해리와 DNA 염색법 <ol><li> 윤활 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 5 ML의 폴리스티렌 튜브 (그림 1G)의 라이브 DNA 얼룩 솔루션의 0.5 ML로 해부 조직을 전송합니다. DNA 얼룩 솔루션에 가능한 적은 PBS로 전송 (이하 300 μL), 트립신의 희석으로 조직의 분리를 억제합니다. </li><li> SHAKI와 튜브를 품어NG 23 500 RPM (우리는 에펜 도르프 Thermomixer 사용)에서 ° C. </li><li> 중간 속도 (5 설정)에서 5 초간 부드럽게 그 소용돌이 70 분 알을 품다. 밑에 소용돌이로 교반 세포 대단히 짧은 시간으로 이어질 것입니다 동안 과도한 소용돌이로 교반은 세포 분열 및 양식 파편을 발생합니다. 23 흔들어 샘플을 반환 ° 속도 5시 5 초 동안 한 번을 소용돌이로하기 전에 추가로 15 ~ 20 분 동안 500 rpm에서 C. </li><li> 두뇌와 36hAPF 세 이상 번데기 눈, 수정 프로토콜이 필요합니다. 1.7 ML의 microcentrifuge 튜브에 45 ~ 60 분 동안 500 rpm에서 23 ° C에서 DNA 얼룩 솔루션의 조직을 떼어 놓다. 그런 다음 하나 하나 수동으로 약 50 ㎕의 DNA 얼룩 솔루션과 신속한 수동으로 그려진 된 파스퇴르 피펫 16 (약 100 ~ 150 μm의 개방)의 위아래로 피펫과 함께 해부 접시에 전달하여 조직의 큰 덩어리를 떼어 놓다. 5 ML 튜브에 DNA 얼룩 솔루션의 0.5 ML의 나머지 부분과 각각의 해리 표본을 전송합니다. 추가로 45 품다23 -30 분 (총 배양 시간 최대 90 분) ° 500 rpm으로 흔들어 C는 수풀까지 더 이상 표시되지 않습니다. </li><li> 주 무 세포 투명 번데기 날개 표피 해리되지 않습니다하지만 완전히 해리 샘플은, 조직의 거의 큰 눈에 보이는 덩어리가 있어야합니다. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법 <ol><li> 조율 cytometer에 전원을 켜고 조율 소프트웨어를 엽니 다. cytometer에 레이저는 시작 메뉴를 통해 켜져 있어야하고, 매일 성능 테스트는 데이터 수집의 하루 전에 충분한 점수와 성과 추적 구슬로 수행해야합니다. 유체 수준은 절반 이상 전체 및 성능 테스트 전에 비워 낭비해야한다. 조율의 시작, 적절한 보정 및 작동에 대한 세부 사항은 조율 사용 설명서 (에서 찾을 수 있습니다 <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf" target="_blank">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf</a> ) </li><li> 새로운 테를 디자인매개 변수가 4.3로 표시와 함께 빈 작업 공간에 4 점 플롯과 2 히스토그램을 작성하여 mplate, 또는 실험에 적합한 이전 디자인 템플릿을 선택하고 수집 할 샘플의 수를 나타냅니다. 우리는 Vybrant DyeCycle 바이올렛 GFP 또는 부록 I.에서 RFP 식 살아있는 초파리 세포주기 분석을위한 조율 템플릿 (. 얻는 형식의 파일)을 제공 한 </li><li> 제공되는 템플릿은 그림 2에 표시된 매개 변수 개의 도트 플롯과 두 개의 막대 그래프 (가) 있습니다. 검출을위한 채널은 다음을 포함한다 : FSC와 SSC - 세포의 크기와 막 복잡성, VL1 높이 (H), 폭 (W)와 면적 (A)를 나타내는 전방 산란 및 측면 산란 - DyeCycle 바이올렛 염색 나타내는 바이올렛 레이저 여기 DNA와 BL1을 -A - GFP 형광을 나타내는 블루 레이저 채널 1 지역. RFP 분석을 위해 제공된 템플릿은 optimi 인 블루 레이저 채널 3 (BL3-A)를 사용한다는 점을 제외하고, GFP 분석을위한 템플릿과 동일합니다RFP 감지에 데이빗. </li><li> 템플릿 도트 플롯 원하는 인구에 대한 분석을 제한하고 분석 (그림 2)에서 파편과 세포 대단히 짧은 시간을 제한하는 문이 있습니다. 문 1 파편과 SSC 대 FSC (그림 2A)에 따라 대단히 짧은 시간을 제외합니다. 문 2 중항 (VL1Area 대 VL1Width) (그림 2B)의 신분에 따라 흠없는 세포, 하위 G1 사멸 세포 및 세포 대단히 짧은 시간을 제외합니다. 문 3 문 1과 2에서 세포를 포괄 파생 문이며, GFP (또는 RFP) 음성 세포 대 VL1Height (그림 2C)에 따라 DNA의 콘텐츠를 식별합니다. 문 4 문 1과 2에서 세포를 포괄 파생 문이며, GFP (또는 RFP) DNA 함량 (그림 2C) 대 양성 세포를 식별합니다. GFP (또는 RFP) 대 앞으로 분산 형 (FSC)로 측정 셀 크기의 도트 플롯 게이트 5와 6 (그림 2D)를 생성하는 데 사용됩니다. Y-AXI에 X 축 및 세포 수에있는 두 개의 히스토그램 플롯 DNA 내용문 3 문 4에 의해 정의 된 인구에 대한의. 원하는 경우 (그림 2E와 2F) 히스토그램도 (미도시) 세포의 크기 포함될 수 있습니다. 셀 크기 히스토그램의 경우, 인구는 X 축과 Y 축의 계수에 FSC를 플로팅 게이트 5와 6으로 설정해야합니다. </li><li> 10,000 GFP 또는 RFP 긍정적 인 이벤트 (이 4 번 게이트, 게이트 1의 파생 게이트, 게이트 2 GFP 또는 RFP 긍정적 게이트있을 것입니다)에 중지 녹화를 설정합니다. 6,000 범위 - 10,000 GFP 긍정적 인 이벤트는 전통적으로 출판 품질 프로파일 9,11의 목표왔다. 우리는 고품질의 프로필을위한 4 이벤트 10 충분한 게이트를 얻기 위해 긍정적 인 약 50 %의 GFP는 15 날개 나 눈의 최소를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 우리는 성공적으로 6 날개 (그림 3A)와 같은 적은에서 예비 세포주기 분석을위한 명확한 데이터를 획득했습니다. 300 μL의 인수 볼륨을 설정,이 총 0.5 ML 시료 460 μL에 대해 사용합니다. 따BLE 2 그림 2의 예를 들어 템플릿에서 제공하는 적절한 임계 값 전압 설정을 보여줍니다. </li><li> 표준 민감도 100 μL / 분을 기록 고감도에서 샘플을 실행합니다. 우리는 서로 다른 감도 수준을 가진 우리의 분석에 차이를 거의 찾을 수 있습니다. 세포의 초점 음향으로 인해,이 cytometer에 정확하게 매우 높은 유속 샘플을 측정 할 수 있습니다. 전통적인 cytometers과는 달리, 우리는 초당 1,500 이벤트에 속도까지 인수함으로써 데이터의 손상을 찾을 수 없습니다. 조율 소프트웨어에 의해 생성 기록 된 데이터 파일은 대부분의 세포주기 모델링 소프트웨어와 호환됩니다. FCS 형식에 있습니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> GFP (또는 RFP)에 대한 세포의 크기와 DNA 내용의 히스토그램은 긍정적이고 부정적인 인구를 비교할 수 있습니다. 그들은 수동으로 복사하고 어도비 포토샵 소프트웨어를 사용하여 붙여 넣는 방법으로 계층화 할 수 있습니다. y 축이 자동으로 설정되어 있으면, Y 축은 시간으로 확장 할 수각 샘플에 대한 ighest 계산합니다. 오토 스케일의 Y 축 세트와 두 개의 그래프를 오버레이는 각 모집단에 대한 세계 최대 설정 축 히스토그램의 오버레이를 만듭니다. 이 (그림 3B의 예) GFP 양성 및 GFP 부정적인 인구의 총 세포 수는 동등하지 않은 경우에도 단계적으로 세포주기의 상대적 변화를 시각적으로 쉽게 비교할 수 있습니다. 또한, 사용자 정의 y 축 (y 축 수동 옵션) 히스토그램에 대한 고정 값으로 설정할 수 있습니다. 이 경우 두 집단에 대한 상대 셀 번호를 비교할 수 있습니다. 조율이 실행 당 샘플의 정의 된 볼륨을 사용하기 때문에, 전체 인구의 비율이 각 게이트의 각 실행에 대한 세포의 절대 정량은, 그림 층의 작업 공간에서 실행 (예 :시 자동으로 생성 된 통계 테이블에서 얻을 수 있습니다 ). 도트 플롯과 히스토그램은 간단히 일에서 다른 샘플을 드래그 앤 드롭으로 조율 소프트웨어에서 계층화 할 수 있습니다비교를 위해 열려있는 샘플의 원하는 그래프 위에 오른쪽에 전자 샘플 파일 메뉴를 선택합니다. 그러나 하나의 샘플 (동일한 샘플에서 음 즉, GFP 긍정적 GFP) 내에서 모집단을 오버레이하기 위해, 우리는 포토샵을 사용합니다. </li><li> 두 가지 방법은 인구 세포주기의 다른 단계에서 상대적 백분율을 찾을 수 있습니다. 근사 방법은 G1, S, G2 및&gt; G2 피크의 경계를 묘사하기 위해 사용자 정의 된 지역에 의존합니다. 이 방법은 사용자 정의 영역 내에서 비율을 빠르고 쉽게 추정 (그림 3E)를 할 수 있습니다. 우리는 티닐-데 옥시 우리 딘 (EDU) 설립을 사용하여 S-상 표지 초파리 캔자스 시티 세포와 직접 테스트에 근거를 둔 우리의 영역을 설정합니다. 두 번째 방법은 세포주기 분포의 추정 타사 모델링 소프트웨어를 사용합니다. 우리는 그림 3F, 예를 들어 ModFitLT (진실성 소프트웨어 하우스) 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol>

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	<li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+measurement+and+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).</li><li>Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis.">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li><li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila:+the+laboratory+setup.">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).</li><li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li><li>McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+gene+expression+targeting+with+the+TARGET+and+gene-switch+systems+in+Drosophila.">Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila.</a> Sci STKE. 2004, pl6 (2004).</li><li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary.">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).</li><li>Bjorklund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pathways+regulating+cell+size+and+cell-cycle+progression+by+RNAi.">Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi.</a> Nature. 439, 1009-1013 (2006).</li><li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing.">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93, 1183-1193 (1998).</li><li>de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Drosophila+cells.">Flow cytometric analysis of Drosophila cells.</a> Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).</li><li>Reis, T., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+dE2F1+by+cyclin-dependent+kinases+controls+cell+cycle+timing.">Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing.</a> Cell. 117, 253-264 (2004).</li><li>Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycling+and+patterned+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+during+metamorphosis.">Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).</li><li>Schubiger, M., Palka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+spatial+patterns+of+DNA+replication+in+the+developing+wing+of+Drosophila.">Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila.</a> Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).</li><li>Theodosiou, N. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FLP/FRT+system+to+study+Drosophila+development.">Use of FLP/FRT system to study Drosophila development.</a> Methods. 14, 355-365 (1998).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.H+Exit+from+mitosis+in+Drosophila+syncytial+embryos+requires+proteolysis+and+cyclin+degradation,+and+is+associated+with+localized+dephosphorylation.">P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation.</a> Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에 설명 된 프로토콜은 세포주기, 상대 셀의 크기 및 상대 셀 수 다양한 발달 단계에서 라이브 초파리 조직에서 분석 할 수 있습니다. 이 분석은 세포 유형의 특정 형광 단백질의 발현 또는 추적 계보와 결합 될 때, 자세한 정보는 신중 세포주기 또는 성장 섭동에 대한 세포 반응에 대해 얻을 수 있습니다. 뇌 세포가 체포 90 % G1에 일반적으로있는 경우 원칙적으로 증거로, 우리는 (3...

유동 세포 계측법은 세포 생존, 상대 셀 크기, DNA의 콘텐츠 및 라이브 세포 인구의 형광 단백질 발현의 측정에 사용하실 수 있습니다. S 상, 세포의 인구의 DNA 함량에 대한 정보 중에 핵 DNA의 복제로 인해 다른 세포주기 단계 1-3에서 상대 비율을 추론 할 수 있습니다. 이 방법은 효모에서 포유 동물 모델 시스템에서 세포주기 분석의 초석이되고있다. 초파리 초파리 세포주기 조절의 생체 내 분석에서 유전을위한 훌륭한 모델 시스템이되었다. 파리에서 사용할 수있는 광범위한 유전 도구는 생체 내 형광 단백질 기반의 혈통에 4-6 추적과 함께 세포주기 규제의 우아한 조직의 특정한 시간적 규제 조작을 허용합니다. 유동 세포 계측법은 endorepl 포함, 초파리 세포 유형의 숫자에 DNA 함량을 연구하는 데 사용되었습니다세포 배양 유사 분열 세포에게 7,8 icating. 생체 세포주기 연구를위한 중요한 사전은 라이브 배체 초파리 상상의 디스크 9,10의 유세포 분석, 많은 실험실에서 사용 적응 된 프로토콜에 대한 프로토콜의 개발, 데 라 크루스와 에드가에 의해 만들어졌다. 유도 형광 단백질 발현과 조직의 특정 라벨을 통해 추적 생체 혈통의 유전자와 결합 된이 기술은 생체 내 9에 하나의 전체 세포의 배가 시간, 셀 크기에 유전자 조작 효과에 대한 정보를 얻기 위해 세포주기 단계의 정확한 타이밍을 확인할 수 있습니다 11. 그러나이 방법은 지금까지 사용자가 흥미로운 훽스트 염색 할 수있는 UV 레이저 cytometers를 흐름을 제한하고 있습니다 살아있는 세포에서 DNA를 염색하고 정량화하는 세포의 사용을 투과 훽스트 33342 DNA-intercalating 염료에 의존하고있다. 이들은 일반적으로 단지 분류기 (예 : BD FACS Vanta를에서 발견된다GE, BD FACSAria) 또는 고가의 여러 가지 빛깔의 벤치 탑 시스템 (예 : BD LSR), 기관 흐름의 핵심 시설로 일반적으로 필요로하는 지원을 제공합니다. 우리는 Invitrogen의, Vybrant DyeCycle 바이올렛에서 새로운 라이브 세포 DNA의 염료를 사용하는 훽스트 기반의 프로토콜을 수정했습니다. 이 염료는 더 작은 벤치 탑 분석기의 일반 및 작은 독립적 인 벤치 탑 분석기, cytometer에 집중 조율 어쿠스틱에서 사용할 수있는 보라색 405 nm의 레이저와 호환됩니다. 여기에서 우리는 DyeCycle 바이올렛과 조율을 사용하여 개발의 다양한 단계에서 세포 유형, 셀 크기, 셀 번호와 초파리 조직의 다양한 혈통 분석을 결합 할 수있는 세포주기 분석을위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 초파리 조직과 같은 분석에 적합 cytometers의 수를 확장하고 살아있는 세포주기 분석이 유형의 추가 조직 유형 및 발달 단계에 맞게 수정 될 수있는 방법의 예제를 제공합니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube </td>
 <td>BD Falcon </td>
 <td>352058 </td>
 <td>5 ml tubes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4445315</td>
 <td>Blue / Violet configuration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>Free </td>
 <td>PC only</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td>
 <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td>
 <td>4449754 </td>
 <td>For daily performance test</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 Inox forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11251-20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embryo dishes 
 30 mm x 12mm </td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70543-30 </td>
 <td>Glass dissection dishes </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>022670051 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T4174 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15003-08 </td>
 <td>Straight 5mm Cutting Edge </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td>
 <td>Life Technologies/ Invitrogen</td>
 <td>V35003 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Required reagents and instruments.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Live DNA Stain Solution (10 ml):
 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 
 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 
 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.)
 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
 </td>
</tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td>FSC</td>
 <td>SSC</td>
 <td>BL1</td>
 <td>VL1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Threshold (x1000)</td>
 <td>100</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Voltage (mV)</td>
 <td>2950</td>
 <td>4250</td>
 <td>1800</td>
 <td>1150</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

live cell cycle analysis of drosophila tissues using the attune acoustic focusing cytometer and vybrant dyecycle violet dna stain

유동 세포 계측법은 널리 다른 세포주기 단계에서 상대적 비율을 추론하는 세포의 인구 DNA 함량에 대한 정보를 얻기 위해 사용되었습니다. 이 기술은 성공적으로 생체 내에서 세포주기 조절의 유전 연구의 모델 생물 초파리의 유사 분열 조직으로 확장되었습니다. 셀 타입 특정 형광 단백질 발현과 유전자 조작과 함께 사용할 경우, 하나의 세포 수, 세포의 크기와 생체 내에서 단계적으로 세포주기에 미치는 영향에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나이 살아있는 세포 방법은 UV 레이저가 장착 흐름 cytometers에 사용자를 제한, 세포 투과성 훽스트 33342 DNA-intercalating 염료의 사용에 의존하고있다. 우리는보다 일반적인 보라색 405nm는 레이저와 호환되는 새로운 살아있는 세포 DNA 염료, Vybrant DyeCycle 바이올렛을 사용하려면이 프로토콜을 수정했습니다. 여기에 제시 프로토콜은 세포와 결합 효율적으로 세포주기 분석 할 수 있습니다초파리 조직의 다양한 유형, 상대 셀 크기와 세포 수 정보. 이 프로토콜은 단일 실험실 수준에서 실행 및 관리 할 수있는 작은 벤치 톱 분석기 라이브 초파리 조직에 대한 유용한 세포주기 분석 기술, 조율 어쿠스틱 초점 cytometer에를 확장합니다.

그림 2는 제공된 GFP 템플릿을 사용하여 조직의 후방 절반 GFP를 표현, 유충의 날개 샘플에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 유사한 결과는 같은 조직 유형 및 제공 RFP 템플릿 (그림 3A)를 사용하여 RFP에 대한 발현 패턴을 얻을 수 있습니다. 제공된 템플릿 및 전압 (표 2) 유충의 눈 (그림 3B), 머리와 날개뿐만 아니라, 번데기의 눈, 두뇌 (그림 3D)와 ?...

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Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

라이브의 세포주기 분석을위한 프로토콜<em&gt; 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에 사용&gt; 조직이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 동시에 혈통 추적 또는 형광 단백질의 조직 별 발현을 통해 상대 셀 크기에 대한 정보, 휴대폰 번호, DNA 함량과 세포 유형을 제공<em&gt; 생체 내</em&gt;.

라이브 세포주기 분석<em&gt; 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에와 Vybrant DyeCycle 바이올렛 DNA 얼룩을 사용하여&gt; 조직

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

live-cell-cycle-analysis-drosophila-tissues-using-attune-acoustic

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

13.5K 조회수.  University of Michigan. 라이브의 세포주기 분석을위한 프로토콜 초파리 조직이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 동시에 혈통 추적 또는 형광 단백질의 조직 별 발현을 통해 상대 셀 크기에 대한 정보, 휴대폰 번호, DNA 함량과 세포 유형을 제공 생체 내.

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Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

연구

생물학

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Tali 이미지 기반 Cytometer를 사용하여 GFP의 표현과 생존 능력의 평가

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

마우스 Estrous 사이클 스테이징 확인을 위해 질 세척, 크리스탈 바이올렛의 착색 및 질 Cytological 평가를 수행

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 광 수용체 (photoreceptor)

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

프로토 타입 소형 흐름 사이토와 동반자 미세 유체 혼합 기술의 감소 - 중력 환경 하드웨어 데모

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...