This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).

참고 : 모든 동물 실험은 독일의 법에 따라 수행하고, 튀빙겐에있는 정부 기관에 의해 승인되었다. 마이크로 피펫, 솔루션 및 막 1. 준비 <ol><li> 마이크로 피펫의 준비 <ol><li> 다음 프로그램으로 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 마이크로 피펫을 당겨 : 열을 : (540), 당기 : 125, 속도 : 20 및 지연 : (140) 바늘 길이의 양을 5.5 cm에. </li><li> microgrinder를 이용하여 베벨 바늘 4mm의 적절한 크기의 팁을 얻었다. 팁의 손상을 방지하기 위해 상자 또는 15cm 페트리 접시에 바늘을 저장합니다. </li></ol></li><li> 솔루션의 준비 <ol><li> 플라스미드 DNA 솔루션 <ol><li> 제조사의 프로토콜에 따라 엔도톡신을 준비 자유 맥시 키트를 이용하여 소망하는 cDNA 구조체를 포함하는 플라스미드 DNA를 준비한다. </li><li> 플라스미드 DNA (GFP 스파이크 벡터 없음) 3 ㎍ / ㎕의 최종 농도로 용액을 조정 또는 4 ㎍ /μl의 독소에 (GFP 스파이크 벡터의 1 μg의와) 빠른 그린 (최종 농도 0.05 %)를 포함 트리스 - EDTA 버퍼를 확보. </li></ol></li><li> 라미닌 원액 <ol><li> 1 ml의 최종 용적에 멸균 수 라미닌 1mg을 녹인다. -80 ° C에서 100 ㎕를 분주하고 저장을 준비합니다. </li></ol></li><li> 폴리 -L- 라이신 원액 <ol><li> 1 mg / ml의 최종 농도로 멸균 물 50 ㎖ 중의 폴리 L 리신 50mg을 녹인다. -20 ° C에서 1 분취 량 및 저장을 준비합니다. </li></ol></li><li> 행크의 균형 소금 솔루션을 완료 (전체 HBSS) <ol><li> CaCl2를 10 ㎖의 100 mM이 황산을 10 배 HBSS 100 ㎖, 1 M HEPES 완충액 2.5 ml를 (PH 7.4), 1 M D 글루코스 30 ㎖, 100 mM의 10ml를 조합하여 완전한 HBSS를 준비하고, (4) 1 ml의 M의 NaHCO3. 4 ° C에서 1 L 및 저장에 멸균 업을 추가합니다. 참고 : 오토 클레이브는 모든 솔루션은 1 M HEPES 버퍼링 기대 한 M D-포도당, FIL 있습니다터 멸균. </li></ol></li><li> 슬라이스 문화 매체 <ol><li> 에 기초 배지 이글 35 ㎖, 완전한 HBSS 12.9 ㎖ (1.2.4), 1 M D 글루코스 1.35 ㎖, 200 mM의 L- 글루타민, 250 μL, 그리고 500 μL 첨가함으로써 슬라이스 배양 배지를 준비 페니실린 - 스트렙토 마이신 50 ㎖의 최종 부피를 얻었다. 4 ° C에서 최종 5 %의 농도와 저장소에 말 혈청을 추가합니다. </li></ol></li><li> 낮은 녹는 점 (LMP) 아가로 오스 <ol><li> 아가로 높은 전력에서 1~2 분 동안 전자 레인지에서 가열 하였다 완전한 HBSS 50 ㎖ (1.2.4)에 LMP의 2g을 첨가하여 4 % LMP 아가 용액을 준비한다. 39 °의 C - 37에서 물을 욕조에이 솔루션을 유지합니다. 4 ° C와 재사용의 솔루션을 저장합니다. </li></ol></li><li> 파라 포름 알데히드 솔루션 <ol><li> 흄 후드에서 1X PBS 100 ㎖에 파라 포름 알데히드 4g을 첨가하여 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액을 제조 하였다. 60 ° C로 가열하고 용액 용액 C가 될 때까지 1 N NaOH를 몇 방울을 가하여리어. </li></ol></li><li> 투과성으로 해결 <ol><li> 4 ℃에서 0.3 % Trition X-100을 함유하는 저장소와 1X PBS 300 ㎖의 BSA의 9g 녹인다. 장기간 보관시 10 % 아 지드 화 나트륨을 추가한다. </li></ol></li></ol></li><li> 막 삽입의 코팅 <ol><li> 12 ml의 최종 부피 라미닌 스톡 용액 (1.2.2)와 멸균 수 폴리 -L- 라이신 스톡 용액 (1.2.3)의 일 분취 한 분취 량을 희석. </li><li> 멸균의 각 웰 포함 2 ml로 6 웰 플레이트에 막 삽입을 놓습니다. 멤브레인 위에 코팅 용액 1 ㎖를 첨가하고, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 O / N을 배양한다. </li><li> 배양 후 막을 멸균 건조 1 ㎖로 3 회 삽입 씻는다. 마른 6 웰 플레이트에서 4 주 4 ° C에서 같은 날 또는 저장소의 코팅 막 삽입을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 2. DNA 주입 및 E15.5의 일렉트로와 E18.5 태아 <ol><li&gt; 5 % 이소 플루 란 포화 기화기에 접속 마취 챔버 내에 배치하여 암컷 마우스를 교배 시간 마취. 1 L / min의 속도로 이소 플루 란과 산소를​​ 순환. 2-4 분 동안 또는 마우스의 발 사이에 집어 테스트하는 의식이 될 때까지 상자에 동물을 유지합니다. </li><li> 배아 일에 자궁 경부 전위 (E) 15.5 또는 18.5에 의해 무의식 마우스를 안락사. 배아 (13)를 포함하는 자궁을 해부 차가운 완벽한 HBSS의 15 ~ 20 ml의를 포함하는 페트리 접시에 놓습니다. 참고 : 이후이 시점에서, 얼음의 배아와 조직을 유지. </li><li> 차가운 완벽한 HBSS를 포함하는 두 번째 페트리 접시에 자궁 뿔과 장소에서 각각의 배아를 분리하는 가위를 사용합니다. </li><li> 해부 현미경, 자궁 근육의 벽과 미세 집게 (# 55)와 가위를 사용하여 태반을 끊다. 조심스럽게 난황에서 배아를 놓습니다. </li><li> decapitat에 본의 가위를 사용하여단지 60 ° 각도로 앞다리 위의 전자 배아. 실험은 배아의 유전자형을 필요로하는 경우, 게놈 DNA의 분리를위한 조직 샘플 (꼬리의 작은 조각)를 수집합니다. </li><li> 깨끗하고 건조한 페트리 접시에 머리를 전송합니다. 머리가 60 ° 각도에서 참수되었다 때문에 지느러미 쪽을 배치 할 때, 머리는 한쪽으로 기울해야합니다. </li><li> 브레 그마에 반구 주변의 중앙으로 조심스럽게 바늘을 놓습니다 (그림 1A, B). 5-8 펄스를인가, 펄스 당 10 ~ 15 msec의 지속 기간 동안 압력을 30 파운드를 사용 picospritzer III의 페달을 밟아 DNA 용액 (3 또는 4 ㎍ / μL로) 약 2-3 μl를 주입한다. 펄스의 지속 시간과 수는 더 많은 시간을 필요로하는 작은 개구를 가진 바늘 개구의 직경에 의존한다. 각 펄스 사이의 간격은 1 초에 달한다. </li><li> 전극을 배치하기 전에, EMBR의 머리에 완전한 HBSS 몇 방울을 적용요. &#39;음&#39;말단은 주입 뇌실 태아의 머리 (도 1C, D)의 귀 아래 주입 심실의 반대측 &#39;긍정적 인&#39;전극과 동일한 측에있는 방식으로 전극을 배치. 50 V. 5 펄스를 적용 <ol><li> E 18.5에 대한 E 15.5에 대한 3mm 전극과 5mm 전극을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 뇌의 해부 (3) <ol><li> 전기 천공 후, 미세 포셉 쌍의 도움으로 헤드로부터 피부를 떼어. 스프링 가위를 사용하여 두개골의 정중선 소뇌의 중간에 작은 절개 부위를 만든다. </li><li> 절개에 봄 가위를 삽입하고 시상 봉합을 따라 길이 방향으로 절단. 두개골을 벗겨 미세 집게를 사용하여 두개골에서 뇌를 분리합니다. 15 ~ 20 ml의 차가운 완벽한 HBSS 용액에 뇌 전체를 전송합니다. </li><li> 한편, 4 % LMP 아가 부어껍질 멀리 금형에, 물을 욕조에 37 ~ 39 ℃로 유지했다. </li><li> 작은 국자를 주걱으로 전체 HBSS 중 뇌를 타고 고급 티슈 또는 Kimwipes를 사용하여 HBSS를 초과하는 드레인. </li><li> 아가로 오스에 부드럽게 뇌 전체를 놓고 미세 바늘의 위치를​​ 조정합니다. 아가로 오스가 응고하고 블록 (관상 섹션의 후각 전구가 포인트) 절단 될 때까지 얼음에 금형을 보관하십시오. </li></ol> 4.에 vibratome 단면 및 슬라이스 문화 <ol><li> LMP 아가로 오스 블록을 잘라 내고 &#39;강력 접착제&#39;를 이용하여 시편 단계에 붙입니다. 접착제는 전사 후 건조에 vibratome의 버퍼 트레이 표본 스테이지이고 블록이 용액에 침지를 완료 할 때까지 HBSS 차가운 얼음 채우기. 참고 : 단면 전에 70 % 에탄올로 모든 악기 및 장비 표면을 소독. </li><li> 다음과 같은 새로운 블레이드를 사용하여 250 μm의 두께에 vibratome 섹션을 준비합니다. <ol><li> 블록 위스콘신 트림다음 설정 번째; 주파수 - 60 Hz의 진폭 - 0.7 μm의 속도 16-18mm / 초. 느린 속도 (9mm / 초)에서 위의 설정으로 원하는 조직을 포함하는 부분을 잘라. 후뇌에서 절편 시작, 대뇌에서 5-7 섹션을 수집합니다. </li><li> 구부러진 주걱의 도움으로 HBSS를 완료하고 모든 섹션 (그림 1E) 수집까지 얼음 계속 차가운 얼음 5 mL를 함유 한 깨끗한 6 웰 배양 접시에 섹션을 전송합니다. </li></ol></li><li> 섹션의 배향을 용이하게하기 위해, 멤브레인 부분을 배치하기 전에 완전한 HBSS 100 ㎕와 교차 방식으로 멤브레인 적셔. </li><li> (막에 섹션을 밀어 집게를 사용하여 다음 집게로 부분의 모서리를 선택하고 주걱에 끌어와) 막에 구부러진 주걱을 사용하여 섹션을 전송합니다. 한 막에 5 절까지 놓고 (집게를 사용하여 그림 1 층을 마련). 서로 절을 중복하지 마십시오. <ol><li> 피펫을 사용하여 막 떨어져 HBSS의 초과를 가져 가라. 여기에 사용 된 특정 멤브레인들은 프레임에 부착되고, 티슈 접촉하지만 매체에 의해 커버 할 수없는 조직 배양 플레이트에 삽입된다. </li></ol></li><li> 슬라이스 배양 배지 (1.2.5) (그림 1G, H)의 1.8 ml를 포함하는 6 웰 플레이트에 막 삽입을 놓습니다. 11 DIV 14 DIV 5 % CO 2와 37 ° C에서 배양 접시를 품어. 절반 매체 (0.9 ml)을 격일로 변경합니다. 주 :이 단계에서 브로 모데 옥시 우리 딘 시약을 추가 (BrdU의 10 μM 최종 농도)를 라벨링 배양 시간의 처음 20 시간 동안 미디어에 대한 세포 증식. </li></ol> 면역 형광 염색법에 이어 섹션 5. 고정 <ol><li> 잘라 깨끗하고 날카로운 메스 블레이드를 사용하여의 방향에 따라 막 트림섹션. </li><li> 4 % PFA (1.2.7) 1 ㎖를 함유하는 24 웰 플레이트에 막과 함께 전송 섹션. 15 분 각 1X PBS로 3 회 세척 한 다음 실온에서 1 시간 동안 섹션을 품어. 부드러운 교반과 함께 4 ° C에서 투과성으로 솔루션 섹션 O / N을 품어. </li><li> 다음 날, 투과성으로 용액에 희석 적절한 차 항체와 섹션을, 부화, O / N 또는 교반과 4 ° C에서 48 시간 동안. </li><li> 1X PBS로 15 분간 섹션 3 회 세척하고 투과성으로 용액에 희석 적절한 보조 항체와 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 이차 항체와 배양 후, 10 분 동안 DAPI 염색 한 다음 15 분 동안 1X PBS로 한 번 섹션을 씻는다. </li><li> 15 분 각각의 섹션을 1X PBS로 3 회 세척하고 슬라이드를 현미경에 전송합니다. ImmunoMount를 추가하고 부드럽게 섹션의 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 4 ° C와 자체에서 슬라이드 O / N을 건조매니큐어와 알. 참고 : 항상 4 ° C에서 슬라이드를 유지합니다. <ol><li> 공 초점 현미경 (그림 1I)에 의해 슬라이스 문화를 분석합니다. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

해마는 학습과 기억에 중요한 기능을 가지고있다. 치아 이랑도 신경이 개발하는 동안뿐만 아니라 성인기에 걸쳐뿐만 아니라 발생 두 뇌 영역 중 하나입니다. 산후 많은 공통 요소를 포함하는 유사한 방식으로 성인 해마 신경 진행한다. 이러한 요소의 규제 메커니즘을 정의하는 것은 다시 새로운 치료법 및 예방 조치로 이어질 것입니다 신경 퇴행성 질환을 이해하는데 매우 도움이 될 것입니다. ?...

해마는 기억과 학습에 중요한 역할뿐만 아니라 감정적 인 행동을한다. 하나의 주 기능은 신경계의 높은 소성을 필요로 장기 메모리로 단기 메모리의 통합으로 구성. 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus)는 입력 정보에 대한 기본 게이트웨이 역할을하고 성인이 1, 2를 통해 또한 지속적인 신경 두 개의 뇌 영역 중 하나입니다. 해마 구조의 개발이 늦은 배아 발생 동안, 특히 제 3-4주 산후 3 중에 발생한다. 치아의 초기 개발 과정에서 줄기 세포 풀이 성인 신경 4뿐만 아니라 산후에 필요한 설립 이랑. 생후 개발 뉴런뿐만 아니라 성인 신경시 미성숙 최종적 성숙한 신경 전구 세포에 대한 여러 단계를 통해 줄기 세포에서 다양한 단계를 통과. 신경의 발현의 다른 단계에서특정 유전자는 해마 회로 5,6에 성숙하고 새로운 뉴런의 통합을 허용 할 필요가있다. 이 유전자의 많은의 발현 패턴과 함수를 정의 허용 마우스 유전학과 면역 조직 화학 염색에 의한 표현형 분석뿐만 아니라 분자 방법을 사용. 또한 마이크로 어레이 분석뿐만 아니라 크로 마틴 면역 침강 (에 칩)에서 잠재적 인 직접 및 간접 표적 유전자 7,8에 대한 정보를 제공합니다. 그러나, 치아 이랑의 특정 개발에 해마 개발의 규제 메커니즘에 관한 많은 오픈 질문은 여전히​​ 존재한다. 하향 또는 상향 조절 (up-regulation)의 관심 및 / 또는 표적 유전자 개발 중에 그들의 운명을 따르의 유전자 중 특정 유전자가 세포의 적은 수의 조작을 허용하는 필요한 시스템을 조절하는 방법을 추가 통찰력을 얻기 위해. 자궁 일렉트로에서 shRNA를, 관심 또는 Cre 호텔 recombina의 유전자의 cDNA그 자체는 도구를 제공합니다. 전기 천공에 사용되어야 원하는 DNA 또는 RNA를 작은 발현 플라스미드의 존재를 확인한다. 이 접근법은 매우 성공적으로 인해 깊은 뇌 해마 레이어 구조의 위치로 치아 이랑의 개발을 검토 더 도전 접근법을 개발 피질 9,10 공부에서 구현되지만된다. Organotypic 슬라이스 문화 다음 예 자궁 전기는이 문제 (11, 12)을 우회하는 한 방법입니다. 대조적으로 자궁 전기가 아닌 전체 배아 만 머리 따라서 해마 치아 이랑 (dentate gyrus)을 향해 shRNA를 / DNA를 직접 할 수있는 더 유리한 방법으로 전극을 배치 할 수 있도록 사용됩니다에서. 우리 그룹은 성공적으로 치아 이랑 (dentate gyrus) 개발 (8) 중에 전사 인자 Bcl11b의 역할을 연구하기 위해 전 자궁 전기를 사용. Bcl11b는 R로 치아 이랑 (dentate gyrus) 개발의 이중 역할을면역 조직 화학에 의해 입증 된 바와 같이 선조 세포의 증식뿐 아니라 분화 egulating. 이러한 과정에서 상기 Bcl11b 관여하는 구조를 정의한, Polleux 기 11,12의 프로토콜은 프로토콜 부분에서 후술하는 바와 같이 치아 이랑 (dentate gyrus)을 연구하기 위해 조절 하였다. 첫번째 접근법에서 질문 Bcl11b 자율적 신경 세포 분화 세포를 조절할지 여부를 해결 하였다. 두 번째 방법은 Desmoplakin, Bcl11b의 직접적인 표적 유전자가, Bcl11b 표현형을 구출 할만큼 충분한 지 여부를 조사했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="271">
	<tbody>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:73px;">Company</td>
			<td style="width:63px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Flaming/ Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:73px;">Sutter Instruments Company (USA)</td>
			<td style="width:63px;">P-97</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Fine Glass Pipettes</td>
			<td style="width:73px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:63px;">G100F-4</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Microgrinder</td>
			<td style="width:73px;">Narishige, Japan</td>
			<td style="width:63px;">EG-44</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Anesthetic Bracket unit</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0412</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Halovet Vaporizer</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0398</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Fluovac System</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0387</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">IMS Fluosorber</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0415</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Anesthetizing Chamber</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0460</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Electroporator</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">CUY21 EDIT</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Tweezers with disk electrodes</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">LF650P3</td>
			<td style="width:64px;">3 mm electrodes for E15.5</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Tweezers with disk electrodes</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">LF650P5</td>
			<td style="width:64px;">5 mm electrodes for E18.5</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Picospritzer III</td>
			<td style="width:73px;">Parker Hannifin Corporation</td>
			<td style="width:63px;">P/N 052-0500-900</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:71px;">HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:63px;">920120</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Dissection Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td>
			<td style="width:63px;">Stemi SV8</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Leica</td>
			<td style="width:63px;">Leica DM IL LED</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Leica</td>
			<td style="width:63px;">Sp5II</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:71px;">6 well dish</td>
			<td rowspan="2" style="width:73px;">BD Falcon</td>
			<td rowspan="2" style="width:63px;">#353502</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">6 well dish</td>
			<td style="width:73px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:63px;">#657160</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:73px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:63px;">#353090</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Fast Green</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">F7252</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:71px;">Laminin</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">#L2020</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">#P5899</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:63px;">15003-08</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:63px;">14084-08</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Forceps</td>
			<td style="width:73px;">Dumont #55</td>
			<td style="width:63px;">11255-20 Inox</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">HBSS 10X</td>
			<td style="width:73px;">Life Technology</td>
			<td style="width:63px;">14180-046</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">BME</td>
			<td style="width:73px;">Life Technology</td>
			<td style="width:63px;">41010-26</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

전사 인자의 Bcl11b 삭마 전구 세포 증식 및 치아 이랑 (dentate gyrus)의 감소 된 크기와 셀 번호의 결과 신경 세포 분화의 손상을 야기한다. 또한 돌연변이 신경 세포는 학습과 기억 손상 (8)의 원인이되는 해마 회로에 통합하는 데 실패. 전 자궁의 전기가 사용되었다 이러한 과정에서 Bcl11b의 규제 메커니즘 (들)에 대한 질문에 대답합니다. 문제를 해결하는 데는 Bcl11...

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Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

9.4K 조회수.  University of Ulm. Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

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Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific Cre models, deletion of a protein throughout a tissue or cell population often leads to complex phenotypes resulting from multiple interacting mechanisms. Determining whether a phenotype results from disruption of a cell autonomous mechanism, which is intrinsic to the cell in question, or from a non-cell autonomous mechanism, which would result from impairment of that cell&#8217;s environment, can be difficult to discern. To gain insight into protein function in an in vivo context, in utero electroporation (IUE) enables gene deletion in a small subset of cells within the developing cortex or some other selected brain region. IUE can be used to target specific brain areas, including the dorsal telencephalon, medial telencephalon, hippocampus, or ganglionic eminence. This facilitates observation of the consequences of cell autonomous gene deletion in the context of a healthy environment. The goal of this protocol is to show how IUE can be used to analyze a defect in radial migration in a floxed transgenic mouse line, with an emphasis on distinguishing between the cell autonomous and non-cell autonomous effects of protein deletion. By comparing the phenotype resulting from gene deletion within the entire cortex versus IUE-mediated gene deletion in a limited cell population, greater insight into protein function in brain development can be obtained than by using either technique in isolation.

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

단백질 삭제의 유도를 통해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로는 형질 전환 모델에서 신경 세포의 마이그레이션에 적자를 정의하려면

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

연구

발생학

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation에 접근

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

해 부 및 마우스 뇌 개발의 코로나 슬라이스 준비

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.