The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

윤리 문 : 이 프로토콜에 기술 된 실험 절차는 독점적 초파리 작업 및 독일의 동물 복지 관련 법률의 적용을받을 수 없습니다 포함한다. 미디어, 도구, 그리고 파리의 1 준비 <ol><li> 탄산 수소 칼륨 17없이 변경 시판 가루 M3 성장 매체를 준비합니다. 주의 : 눈과 피부를 자극 함. 10 % 소 태아 혈청으로 보충 배지, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg은 / ㎖ 스트렙토 마이신. 최상의 결과를 위해 열 불 활성화 및 곤충 배양 테스트 태아 혈청을 사용합니다. -20 ° C에서 분취에서 0.2 μm의 병 상단 필터 장치 및 저장을 통해 (중간이라고 함) 완전 배지를 필터링합니다. 사용 전에 필터 (0.2 μm의 주사기 필터 팁) 매체는 다시 침전물을 제거합니다. </li><li> 약리학 적 분석에 대한 억제제 원액을 준비합니다. Dissol분량 씩 적당한 용매 및 저장소의 화학 물질을했습니다. (: 눈과 피부를 자극주의)을 디메틸 설폭 시드 예를 들어, 28.69 mM의 anacardic 산의 재고 솔루션을 준비합니다. </li><li> 해부 번데기 고환 및 단일 낭종 절제술의 중단을위한 도구를 준비합니다. 이 샤프하고 딱딱한 바늘보다는 포셉 쌍을 사용한다. 집게의 쌍의 2 개의 아암 사이에 개발 모세관 력은 매우 어려운 매체 소량 단일 낭종 절개한다. 예를 들어, 접종 루프 홀더에 삽입 스테인리스 곤충 핀의 끝을 사용한다. </li><li> 성인 초파리 충분한 수 (약 40-60 파리)와 적절 세 번데기, 씨앗을 약 10 대형 배양 병 (4cm 직경 튜브)를 얻기 위해. HP 스위치를 분석하기 위해, 자신의 내생 패턴 12,16,22에 H2AvD-RFP 및 ProtamineB-eGFP는 표현 파리를 사용합니다. 25 ℃ 표준 조건 하에서 배양 바이알; 최대 4-5일 셋째-령 유충 크롤링까지 약에 대한 C ° 및 튜브 (25)의 벽에 번데기를 시작합니다. </li></ol> 해부를위한 24 시간짜리 번데기를 구하는 2 마킹 또는 화이트 수집 예비 - 번데기 <ol><li> , HP 스위치에 특정 화학 물질의 영향을 테스트 약 24 시간 APF 12에서 번데기 고환을 해부합니다. 무대 번데기를 구하려면 유충을 pupating로 준비된 플라이 문화 유리 병을 (섹션 1.4 참조) 가능한 많은 흰색 사전 번데기를 식별합니다. 번데기에서 첫 번째 단계에서 사전 번데기는 움직이지 않은 먹이, everted spiracles과 흰색 색상의 번데기와 오히려 단축 애벌레로 나타납니다. 번데기는 번데기 개발 (26)의 다음 단계를 나타냅니다 30-60 분, 내 황갈색 갈색이된다. </li><li> 튜브의 외측에 영구 마커 사전 번데기의 위치를​​ 표시한다. 약 24 시간 동안 25 ° C에서 튜브를 품어. <ol><li> 또한,PBS 버퍼에 적신 작은 붓으로 유리 병의 측면에서 사전 번데기을 선택합니다. 그런 다음 새로운 50 ㎖의 반응 관의 측면에 사전 번데기를 전송하고 약 24 시간 동안 25 ° C에서 배양. </li></ol></li></ol> 번데기 형성 후 약 24 시간에서 번데기 고환의 3 해부 <ol><li> 10cm 플라스틱 세포 배양 또는 배양 접시에 매체의 몇 방울 (약 80 ㎕의 각)를 배포합니다. 집게의 폭 넓은 쌍 또는 중간에 적신 브러쉬를 사용하여, (섹션 2 참조) 배양 병에서 24 시간 APF 단계에서 번데기을 선택합니다. 접시에 매체의 각 드롭 한 번데기를 전송합니다. </li><li> 절개를 들어, 광섬유 일루미네이터 구비 입체 현미경을 사용한다. 이 문화에 적절한 개발을 방지 할 수로 해부하는 동안 RT 위 고환에 열을 가하지 마십시오. <ol><li> 제 5 집게 이쌍와 번데기를 해부하다. 한 쌍으로, 가장 후방에서 번데기를 잡아일부 (후부 spiracles) 및 위치에 고정. </li><li> 포셉의 다른 쌍의 앞쪽에 spiracles을 잡고 그 앞쪽 끝에서 번데기 아가미를 엽니 다. 흉부의 적어도 일부가 노출 될 때까지 번데기 케이스를 벗겨. </li><li> 가장 후단에 의해 위치에 번데기를 계속 누르고 있습니다. 번데기의 내부 압력을 해제하려면, 번데기의 머리 영역으로 집게의 쌍의 두 팔을 삽입합니다. </li><li> 집게를 열고 앞쪽 방향으로 집게를 이동하여 열려있는 번데기를 추출. 이 운동으로 생성 된 개방의 첫 번째 시도에서 가능한 한 커야합니다. 압력이 고환이 작은 구멍을 통해 직접 추진되고 가장 자주 중단되고이 있으므로 출시되기 전에 그 후방 끝에서 번데기의 손상을 방지. </li><li> 번데기가 개방되면, 번데기의 방출 내압 라 통해 신체 지방 세포 및 조직의 응집체를 누르는 것을 관찰헤드 영역 RGE 개구. 번데기 고환이 이미이 물질 번데기 밀려되었는지 여부를 확인합니다; 이는 어떤 경우에 일어난다. 고환은 24 시간 APF에서 다른 조직에 연결되어 있지 않은, 따라서 번데기 23에서 쉽게 배출 될 수 있습니다. </li><li> 그들은 번데기에 남아있는 경우이 고환 손상을 줄 수 있으므로 집게와 번데기를 압박하지 마십시오. 한 쌍의 핀셋을 사용하여 개구의 크기를 증가시킨다. </li><li> 그런 다음 가장 후단에 번데기를 개최합니다. 번데기에서 고환을 해제 전방에 후방에서 번데기의 내용을 밖으로 다른 집게 쌍 부드럽게 행진을 닫습니다. </li></ol></li><li> 미리 잘라 200 μL 피펫 팁으로 그들을 잡아 당겨 고환을 수집합니다. 고환과 전송 체 지방 세포의 수를 줄이기 위해 매체의 단지 매우 소량의 전송을 시도. 새로운 배양 접시에서 매체로 고환을 놓습니다. 단 몇 지방 바디 셀 때까지 고환에게 매체와 여러 번 세척의는 남아있다. </li><li> 라이브 영상의 경우, 매체와 유리 바닥 배양 접시에 고환을 전송하고 반전 영상 현미경을 사용합니다. 약물 분석의 경우, 5 단계를 계속합니다. </li></ol> 남성 생식 줄 낭종 및 라이브 영상의 4 해부 <ol><li> 유리 바닥 배양 접시에 하나 이상의 번데기 고환을 전송합니다. </li><li> 광섬유 조명과 두 개의 스테인레스 스틸 바늘 스테레오 현미경을 사용하여 남성 생식 세포 낭종의 해부 (1.3 절 참조). <ol><li> 한 바늘,주의 깊게 전방 또는 후방 끝에 하나의 고환을 고정하려고합니다. 위치를 잡습니다. 고환에 다른 바늘을 삽입하고 옆으로 바늘을 이동하여 고환 칼집을 방해. 낭종의 대부분은이 운동에 의해 고환에서 발표 될 예정이다. </li><li> 한 바늘 위치에있는 고환을 계속 누르고 있습니다. 다른 바늘 고환에서 남아있는 낭종 밖으로 조심스럽게 행진. </li><li> 신사로 구분 집계 낭종 중LY는 낭종의 클러스터를 통해 또는 200 μL 피펫 팁을 사용하여 매체와 새로운 배양 접시에 낭종을 전송하여 옆으로 바늘을 이동. </li></ol></li><li> 단일 낭종의 라이브 이미징을위한 반전 영상 현미경으로 배양 접시를 이동합니다. 바늘 필요하다면 다시 낭종을 분산. <ol><li> 위상 콘트라스트와 형광 현미경을 사용하여 낭종의 무대를 확인합니다. </li><li> 원하는 단계의 낭종에 초점을 맞 춥니 다. 낭종이 배양 접시의 바닥에 부착하기 때문에 초점이 떠있는 경향이하지 않는, 자주 이상 이미징 실험을하는 동안 초점과 낭종의 위치를​​ 확인합니다. 참고 : 고정화 폴리-L-라이신과 함께 요리를 코팅하는 초기 배아 줄 낭종의 발전에 해 롭습니다. 대신, 개별 낭종이 분리 될 수있다. 약간의 연습으로, 아주 조심스럽게 바늘로 눌러 특정 낭종을 지목 할 수있다. 이것은 별도의 숭배 단일 낭종의 전송을 허용합니다현미경의 시야에 맞는 그려진 아웃 팁 유리 파스퇴르 피펫 우레 요리. 격리 된 낭종은 다음도 쉽게 장기 배양 한 후 배양 접시에 재배치 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 본래 번데기 고환과 5 약리 분석 <ol><li> 12 회 반복 한 실험의 배지 500 ㎕를 함께 24 - 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰을 채운다. 미리 잘라 200 μL 피펫 팁을 사용하여 각 웰에 전송 한 번데기의 고환. <ol><li> 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 격리 된 고환에서 프로타민의 존재를 확인합니다. 고환은 HP 스위치가 낭종의 하나에 자리를 차지하게되지 않았 음을 나타냅니다 ProtamineB-eGFP는 신호 없어야합니다. 이미 ProtamineB-eGFP는 양성 낭종을 보여 고환을 교체합니다. </li><li> 제 12 웰에 원하는 최종 농도에 도달하기 위해 희석 된 저해제 화합물 (anacardic 산)을 함유하는 배지 500 μl를 추가웰당 배지 1 ㎖ 중의 (150 μM). 처리되지 않은 컨트롤과 같은 나머지 우물을 사용; 억제제 화합물과 함께 사용되는 용매로 동일한 양으로 배지 500 μl를 추가한다. 주 : 많은 다른 화합물 및 용매를 사용하는 경우, 대조군으로 단독 배지를 사용하는 것이 더 효율적일 수 있으며 별도의 실험에서, 용매의 농도를 증가의 영향을 테스트하기 위해. </li></ol></li><li> 어둠 속에서 24 시간 동안 25 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 전술 한 바와 같이 배양 고환에 프로타민의 존재를 다시 확인합니다. 제어 고환 이제 HP 스위치를 통해 전환을 나타내는 하나 이상의 ProtamineB-eGFP는 양성 낭종을 표시해야합니다. </li><li> 200 ㎕의 팁과 피펫을 사용하여, 폴리-L-라이신 코팅 된 슬라이드에 고환을 전송 다른 12,27,28 설명 된대로 적절한 형광 항체 스쿼시 준비 및 얼룩을합니다. </li></ol>

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저자는 경쟁의 이익이 없다.

제시된 프로토콜은 특정 발달 단계에와 배양 접시에있는이 세포와 조직의 생체 개발에 초파리 고환 및 단일 배아 줄 낭종을 해부 할 수있는 능력에 모두 기반이 각 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 하나의 응용 프로그램은 정자 개발하는 동안 중요한 프로세스의 약리 조작이다. 중요한 것은이 쉽게 비행 유전학을 기반 기능 분석을 사용하여 얻은되지 후 감수 정자에 액세스 할 수 있습니다. 다른 애플리케이션은 생활과 생식 세포 및 정소 개발 현미경 관찰이다. 특히 문화에 초파리 세포와 장기의 기능이 응용 프로그램의 이점은 생존하고 RT에서 정상적인 분위기에서 개발. 따라서, (25 ° C의 표준 사육 온도로 가열) 가열 단계가 장착 된 반전 영상 현미경 라이브 이미징 실험에서 의미있는 결과를 얻기에 충분하다. 또한라이브 이미징을위한 형광 단백질 태그 단백질을 표현하는 더 많은 유전자 변형 플라이 균주가 존재하거나 쉽게 설정할 수 있습니다. 특정 발달 단계의 번데기 고환 또는 세균 줄 낭종을 얻으려면, 그것은 하나가 초파리 개발의 타이밍을 잘 알고하는 것이 중요합니다. 각 단계에 대한 정확한 타이밍은 실험실 배양 조건에 따라 다양하고, 긴장을 비행 경험적으로 설정해야 할 수도 있습니다. 위에서 설명한 바와 같이, 이것은 예를 들면, HP 스위치를 대상으로, 약리학 분석에 특히 중요하다. 이러한 실험의 경우, 타이밍도 한 집단 내에서 약간 다를 수 있기 때문에 항상 실제 억제제 시험 전에 ProtamineB-eGFP는 신호 정자를 확인하는 것이 좋습니다. 첨부 된 지방이 신체 조직의 무료 그대로 장기 조기 번데기 단계에서 고환을 해부 실험을 가능하게해야 위의 프로토콜에 따라. 이 고환과, 더욱 더, GE의 격리RM 줄 낭종은 매우 약합니다. 그러므로, 취급 및 집게, 바늘 및 피펫을 이용하여 정소 낭종 및 전사에 필요한 손재주와 경험을 개발하는 것이 중요하다. 특히 감수 초 후 감수 생식 세포 발달을 목표로 연구는이 혜택을 누릴 것입니다. 그것은 성인 고환에서 긴 편모 늦은 정자의 낭종을 해부 비교적 쉽지만, 그것은 이전 스테이지를 얻기 어렵다. 이 프로토콜 다음과 같은 초기 번데기 고환에서 이러한 낭종을 해부하는 것은 훨씬 더 효율적입니다. 일반적인 비행 피로, 번데기 만 약 50 %가 남성 될 것 명심하십시오. 따라서, 필요한 고환의 수만큼 번데기 적어도 두번 해부 준비. 대안으로, 고환이 그대로 유충 3:23, 34의 좌우 지방 신체 조직에 매립 반투명 라운드 장기를 식별 할 수 있으므로, 입체 현미경을 사용하여 남성 L3 유충을 식별하기, 및 신선한 배양 병에 그들을 수집 할 수 있음 수준비 및 해부에 대한 사전 번데기를 선택하는 데 사용 될 수있다. 이는 남성 미리 35 번데기를 식별하는 것도 가능하다. 이전에 18에보고 된 바와 같이 우리는 격리 된 세균 줄 낭종과 문화에서 그대로 번데기 고환이 모두 빛에 민감한 것으로 나타났습니다. 이 빛이 감도는 약물 학적 분석에 사용되는 일부 화학 물질에 대한 유지 수 있습니다. 따라서, 배양 동안 어둠 속에서 분석의 배양 접시를 유지하는 것이 가장 좋습니다. 개발 고환과 함께 시간 경과 이미징 실험을 계획 할 때 마찬가지로, 특히, 절연 낭종은 너무 긴 노출 시간 및 / 또는 너무 높은 샘플링 속도가 생체 개발을 억제 할 수 있습니다 점에 유의하십시오. 적절한 샘플링 레이트는 실험적으로 결정되어야한다. 배양 접시에서 세균 및 / 또는 곰팡이 감염 이상 성장은 심각한 문제가있다. 너무 많은 세균에 감염된 배양 접시는 생체에는 Deve을 지원하지 않습니다고환 및 낭종의 lopment. 따라서, 설명 된 배지 페니실린 및 스트렙토 마이신 (단계 1.1 참조)하지만, 장기 배양 중에 포함 이러한 항생제는 저하 될 수 있으며 그들의 활성을 감소 것이다. 이는 생존 기간 한정 이유 중 하나 (최대. 72 시간) 상기 프로토콜을 사용하여 관찰 할 때 배양 낭종 수 있었다. 그러나이 시간 프레임은 요리 배지 정규 교환에 의해 확장 될 수 없었다. 우리는 다른 요소는 생식기의 다른 조직에서 성장 신호들의 부족으로, 배양 생존에 영향을 미칠 수 있음을 결론 지었다. 한편, 이후의 개발이 빠르게 감수 초파리 포유류보다. 초파리에서 spermiogenesis은 약 90 시간 소요되며, HP 스위치는 감수 분열 9,12 후 50 ~ 60 시간 사이에 일어난 일입니다. 따라서이 프로토콜을 구현할 약 48 시간의 통상의 생존 시간은 SPE에 피봇 발생 과정을 수행하기 위해 적합같은 감수 분열 또는 HP의 스위치로 rmatogenesis. 세균 또는 진균의 오염이 깨끗 툴과 미디어를 사용함으로써 회피 될 수 있지만, 제시된 프로토콜은 파리 때문에 엄격히 무균 작업 조건을 사용하고 표준 조건 하에서 발생하는 경우 정소 이미 박테리아를 포함하는 비행하지 않는다. 그럼에도 불구하고,이 문화 기술의 일부 응용 프로그램은 해부 파리 혜택을 누릴 수 있습니다 또는 (프로토콜, 17,36,37 참조) 무균 조건에서 발생합니다. 약리 분석법 억제제 또는 각종 효소의 활성화 제로서 작용하는 화학적 화합물의 용도에 따라 다르다. 일반적으로 그러한 실험에 사용 된 화합물은 종종 타겟 특이성에 크게 다르다. 이점으로서,이 산 anacardic 억지 P300 / CBP, PCAF,와 모자 (38)의 MYST 가족 구성원, 예를 들어, 전체 효소 클래스를 타겟팅 할 수있는 잠재력을 제공한다. 이 방법의 단점은 오프 대상 또는 세포 독성 효과 INDUC 잠재력이 될 수이러한 화합물에 의해 에드. 따라서, 번데기 고환 또는 낭종 분석에 사용 된 각 화합물은 세포 독성 및 다른 농도에서 특정 효과를 테스트해야합니다. 또한, 배양 조건, 화합물 농도 또는 활성 및 세포 투과도의 변화에​​ 약간의 차이가 유도 효과의 변동을 초래할 수있다. 따라서, 각각의 실험에서 치료 성공을 모니터링하는 것이 필요하다. 우리가 150 μM에서 anacardic 산을 사용할 경우 히스톤 H4 아세틸 지속적으로 감소하면서 예를 들어, 우리는 간 때로는 약간 고환 내의 염색질 응축 표현형의 강도에 약간의 변화를 관찰했다. 배양 초파리 고환과 약리 분석법은 정자 4,12,14,21의 전후 감수 기전을 분석하기 위해 사용되어왔다. 이 유전자 도구 후 감수 정자에 액세스 할 수 어렵 기 때문에 된 essentia와 선수를 대상으로합니다L 개의 사전 감수 및 감수 기능이 생체 외 접근법은 대안을 구성한다. 또한, 원칙적으로, 상기 방법은 시간이 지남에 따라 처리 된 생식 세포의 발달을 따라 실험 - 펄스 추적하도록 구성 될 수있다. 그러나, 우리는 아직이 가능성을 시험하지 않았다. 초기 번데기 고환을 사용하는 것은 약물 분석의 장점이다. 첫째, (24 시간 APF 정도) 젊은 번데기 고환의 얇은 외피는 화학 물질의 개선 투자율을 허용 할 수 있습니다. 포스트 감수 HP 스위치를 공부 둘째, 번데기 고환은 HP 스위치가 영향을 받거나되었는지 여부의 직접 판독을 가능하게 프로타민-GFP 발현 플라이 라인에서 24 시간 APF에서 해부. 현재까지, 초파리 기관, 고환 및 생식 - 라인 낭종을 포함한 조직의 생체 외 배양을위한 여러 프로토콜 (예 4,14,17,20,39,40 참조)이 개발되었다. 재배 매체에 사용되는 일반 조건1979 년에 설립되었다 여기에 제시된 프로토콜 17. 문화 시스템은 나중에 성인 고환 사에서 분리 후반 이후 감수 낭종의 개별화기구의 생체 내 이미징에 적응했다. 이전에, 우리는 이러한 조건이 또한 주위에 48 시간 12 그들의 낭종에서 생존과 감수 초 후 감수 생식 세포의 분화를 지원한다고합니다. 다른 문화 시스템 (19)과는 대조적으로이 문화에서 관찰 발달시기 (자세한 내용은 12 참조) 고정 된 샘플에서 결정 타이밍에 대략 일치했다. H2AvD-RFP 및 프로타민-GFP 형광 신호는 배양 생식 세포의 핵 염색질 형태 및 조성물을 시각화 할 수있다. 우리는 문화의 발달 단계의 명확한 식별을 위해이 같은 낭종의 코일과 같은 다른 기준 유리한 것으로 나타났습니다. 중요한 것은, 제시된 프로토콜은 플라이 EXT의 첨가를 포함하지 않는다소 태아 혈청 이외 RACT 또는 다른 성장 인자. 또한, 우리는 조건이 체외 문화 감수 분열의 형광 현미경 영상과 호환되는지 여기 보여준다. 이미지는 장기 발전을 지원하기 편한 매체 적당한 해상도를 얻을 수있다. 이것은 Voltalef 오일 41,42에서 단기 (약 3 시간)의 관찰을 가능하게하는 프로토콜 대조적이다. 재배 및 번데기 고환 및 단일 남성 생식 세포 낭종의 약물 치료를 위해 위에서 설명한 절차는 초파리의 정자에서 연구 할 수있는 많은 유전, 후성 유전 학적, 생물학적 세포, 또는 발달 질문에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 세균 온라인 줄기 세포에 초점을 맞추고, 특히 연구를 포함한다. 그것은 배양 성인의 라이브 영상 다음에 할 수있는 줄기 세포 개발이 20,43를 고환 보였다. 그러나, 성숙한 정소의 연동 운동 수렁시간은 이미지 수집 방해합니다. 따라서, 어느 촬상 단편화 고환 43 또는 실시 이미징 실험의 수는 손실 된 데이터 집합 (20)을 설명하기 위해 증가되어야한다을 사용하여 수행된다. 초기 번데기 고환 (24 시간 APF)는 아직 근육 세포에 동봉되어 있지 않습니다. 조금이라도 나이가 고환 (36-45 시간의 APF)은 몇 연동 움직임을 보여줍니다 (그림 3 및 보충 비디오 비교 1) 나타납니다. 따라서, 그대로 장기 어린 번데기 고환의 재배가 대안이 될 수있다. 또한, 한 번, 번데기 고환을 해부 할 수있는 능력을 숙달 결국 고립 세균 줄 낭종은 작은 세포 집단이기는하지만 동종의 소스로 단일 낭종을 사용하여 추가 응용 프로그램을 수 있습니다. 이미 증명 된 바와 같이 예를 들어, 그것은, 정자의 정의 단계 동안에 특정 유전자의 전사 조절을 분석하기 위해 RT-qPCR에 수행하는 것이 가능하다 <sup&gt; 15.

많은 종의 수컷 생식 세포의 발달 과정은 순차적이다. 형태 학적 및 성적으로 고도의 전문 정자의 형성에 절정에 중요한 일련의 사건이 특징입니다. 초파리에서, 고환 분할의 끝에서 세균 라인 줄기 세포는 비대칭 1,2 (개요를 그림 1 참조) 새로운 줄기 세포와 spermatogonium, 즉 차별화하기 위해 최선을 다하고 딸 셀을 야기합니다 . spermatogonium는 감수 분열의 시작과 함께 인상적인 성장과 전사 활동의 단계가 spermatocyte 단계라고, 유사 분열 분열의 네 라운드를 거쳐합니다. 하나 spermatogonium 유래 세포는 서로 접속하고이 체세포-구조 낭종이라고도 래핑 동기화 번들로 발전 유지. 감수 분열이 완료되면, 수컷 생식 세포의 형태가 완전히재구성 (개략적으로도 1에 도시). 처음 라운드 정자는 유체 역학적 헤드 구조를 형성하는 신장 및 편모가 개발한다. 5 - 결국, 정자 세포는 개별화 3이라는 복잡한 세포 자멸 - 관련 메카니즘에 의해 서로 분리된다. 9 - 노랑 초파리와 포유 동물 종을 포함하여 많은 종에서는 반수체 남성 생식 세포의 크로 마틴의 놀라운 후생 유전 학적 재 배열을 동반 생식 세포의 형태 학적 변화는 (HP 스위치) 6 히스톤 - 투 - 프로타민 스위치를했다. 아마도 거의 모든 표준 히스톤 많은 히스톤 변종 분자는 DNA에서 제거하고 성숙 정자의 크로 마틴에 특정 매우 컴팩트 한 nucleoprotamine 구조의 결과로 작은 기본적인 단백질 프로타민에 의해 대체된다. HP 스위치의 일반적인 특성은 t이다먼저 전이 단백질에 의해, 그리고 마지막으로 프로타민에 의한 히스톤 변형에 의해 정식 히스톤의 그는 교체. 12 -이 ​​모든 히스톤 제거 7,10 직전에 같은 히스톤 H4의 아세틸 화 수준의 급등 등의 후생 유전 학적 마크가 일부 변경, 동반한다. 전부는 아니지만 대부분은, 상술 된 공정의 성숙, 완전히 가임 정자의 개발에 필수적이다. 이것은 포유류의 정자의 공유로, 무척추 시스템 1,8,9와 유사성 상당한 양의 초파리뿐만 아니라 인간뿐만 아니라 사실이다. 남성 생식 세포 발달을 공부하는 것은 크게 초파리 모델 시스템에서 촉진된다. 파리는 유 전적으로 매우 액세스 할 수 있습니다. 돌연변이의 발생뿐만 아니라 융합 유전자 또는 RNA 간섭 플라이 구조 발현 균주의 설립은 적은 노력한다. 그러나, 포스트 - 감수 정자, 돌연변이 체의 사용 연구D 유전자 간단한 도구 한계에 도달 할 수 있었다. 초파리의 정자에서 전사는 감수 분열에 항목으로 거의 완전히 중단. 16 - 따라서, 포스트 감수 정자는 주로 확장 감수 의향 (13)에서 합성 병진 억압 저장 mRNA를 기반으로합니다. 따라서, RNA 간섭 또는 비 조건부 변이체의 사용과 같은 도구는 또한 특별히 미리 감수 또는 감수 생식 세포 발달에 필수적인 기능을 수행 유전자 산물의 사후 감수 역할을 연구하는데 적합하지 않다. 20 - 이러한 경우에 이용 될 수있다 초파리의 장점 중 하나는 문화 매체 4,12,17에 생체 개발을 해부 그대로 고환 생식 세포의 경우에도 낭종의 능력이다. 고환이나 세균 줄 낭종의 해부 및 재배는 살아있는 세포에서 배아 세포 개발뿐만 아니라 현미경 관찰을 할 수 있지만LSO와 약리학 적 분석의 사용 등, 이러한 히스톤 acetyltransferases (HAT들), 히스톤 디 아세틸 라제 (HDACs), 토포 이소 머라 제 또는 테아 같은 효소 복합체의 억제제. 따라서, 포스트 - 감수 정자 중에 효소 기능을 조작과 관계없이, 전 배아 감수 또는 감수 4,12 기능의 발달 결과를 모니터링하는 것이 가능하다. 약리학 적 분석에서, 우리는 이전 감수 의향 동안 bromodomain 단백질의 아세틸 화에 의존하는 지역화뿐만 아니라 모자 HDACs 12,21 타겟팅 특정 억제제를 사용하여 포스트 감수 정자의 후생 유전 학적 HP 스위치 히스톤 아세틸 화 수준의 관련성을 분석 하였다. 이러한 분석에서 HP 스위치를 표적으로하는 융합 유전자 histone2AvD-RFP 및 내인성 패턴 protamineB-eGFP는 12, 22를 표현하는 비행의 피로를 사용하여 가능하게하고, 관찰 한 것번데기 고환에서 정자 제 24 및 48 시간 (12) 사이 APF HP 스위치를 통과한다. 제시된 프로토콜은 초파리의 번데기, 배양 조건, 그대로 번데기 고환과 약물 분석에서 고환 및 낭종의 절개를 설명합니다. 이를 위해, 번데기 형성 (APF) 후 약 24 시간에서 번데기 고환 해부 (도 1 및 2 참조). 이때, 정소는 다른 조직에 대한 연결을하지 않은과 억제제 화합물 23,24으로 더 침투를 허용 만 얇은 외피에 의해 둘러싸여있다. 고환은 쉽게 문화에 취할 수 bean- 또는 서양 배 모양의 기관입니다. 이 고환 배양, 해부, 특정 억제제로 처리됩니다. 이어서, 억제제의 효과는 면역 형광 분석하고 융합 단백질 발현을 형광 현미경을 사용하여 관찰하고, 핵 morphol 비교함으로써미처리 된 생식 세포의 치료에 생식 세포의이 ogy. 이 프로토콜에서 제시하는 조건은 문화 고환 생식 세포 낭종을 개발의 라이브 영상을 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Anacardic acid</td>
			<td style="width:105px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:99px;">172050</td>
			<td style="width:247px;">brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-acetyl-Histone H4</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-598</td>
			<td>brand: Upstate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioObserver.Z1 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont 5-Inox forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fiber optical&#160; illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inoculation loop or pin holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5018</td>
			<td rowspan="2" style="width:247px;">In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5014</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plates, 24-wells</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>351147</td>
			<td>brand: Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen Strep</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15070</td>
			<td>brand: Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stemi SV6 binocular</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

포유류 및 노랑 초파리의 정자 중에 수컷 생식 세포가 필수적 발생 과정의 일련의 개발. 이 줄기 세포 인구, 유사 분열 증폭 및 감수 분열에서 차별화가 포함되어 있습니다. 또한, 포스트 - 감수 세균 세포 형태학 극적인 재 형성 공정뿐만 아니라 생식 라인 염색질 히스톤 투 프로타민 스위치 글로벌 후생 유전 학적 재구성을 겪는다. 돌연변이 또는 기타 유전 적 도구를 사용하여 포스트 감수 정자에서 단백질의 역할을 연구하는 것이 종종 필수적 배아 사전 감수, 또는 조사 하에서 감수 단백질의 기능에 의해 방해된다. 이러한 단백질의 돌연변이 체의 사후 감수 표현형의 발달 이전 블록을 통해 가려 질 수있는, 또는 표현형의 해석은 복잡 할 수있다. 모델 생물 초파리 melanogaster가이 문제에 대한 바이 패스 제공 : 그대로 고환 및초기 번데기 해부 생식 세포의 경우에도 낭종 배지에서 체외 개발할 수있다. 이러한 문화를 만들기 사용은 고환과 배아 줄 낭종의 생식 세포 생활의 미세한 영상을 수 있습니다. 중요한 것은, 재배 및 고환 생식 세포는 감수함으로써 사후 단계를 포함하여, 정자 중에 효소 기능의 조작을 허용하는, 약리학 적 억제제가 액세스된다. 제시된 프로토콜은 해부 번데기 고환 생식 세포 낭종을 배양하는 방법에 대해 설명합니다. 번데기 고환 및 배양 조건의 개발에 대한 정보는 문화에 살고 고환 생식 세포 낭종의 현미경 영상 데이터와 함께 제공됩니다. 또한 히스톤 아세틸 트랜스퍼 라제 억제제 anacardic 산을 사용하여 히스톤 투 프로타민 스위치를 표적 분석을들 포스트 감수 정자 형성을 연구하는 약리학 적 분석을 설명한다. 원칙적으로,이 배양 방법은 많은 O를 해결하도록 구성 될 수있다사전 및 사후 감수 정자에서 거기 연구 질문.

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Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

해부, 이미징 및 약물 학적 치료 : 초파리의 번데기 고환 및 단일 남성 생식 줄 낭종의 생체 내 문화

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.3K 조회수.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

비디오: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila 애벌레 NMJ의 해부

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

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Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

해부 그리고 스테 이닝 Drosophila 애벌레 난소

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

기본 인간 난관 상피 세포의 전의 VIVO 문화

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Pupal의 복부 Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.