저자는 기술 지원을 길버트 녹색 감사합니다. 이 작품은 MGP에게 수여 NIAMS / NIH (R01-AR060484) 및 DOD (W81XWH-12-1-0555) SMY 수여,에서와 NIH (U24의 CA92871와 U54 CA151838)에서 교부금에 의해 지원되었다

모든 동물 연구는 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용위원회의 규정에 따라 수행되었다. 1. 생체 내에서 골격 콜라겐 리모델링의 적외선 (NIR) 형광 이미징 근처 <ol><li> 갇힌 CMP와 꼬리 정맥 주입의 사진 활성화 <ol><li> 전송 및 주입시 손실 가능성에 대한 추가 10 μL 쿠션, 투약 용액 100 ㎕를 각 마우스에 갇힌 CMP 용액 110 μL (20-30그램 마우스 무게를) 준비합니다. IR680-AHX-NB (GPO) 멸균 PBS 용액에서 100 μM 시스테인의 11 μL 9 원액 (400 μM)의 11 μl를 혼합 한 후 1X PBS 버퍼와 110 μL에 전체 볼륨을 가지고. 최종 펩타이드 솔루션은 IR680-AHX-NB (GPO) 9의 4 nmol의 및 1X PBS 용액 100 μL에있는 시스테인 1 nmol의가 포함되어 있습니다. </li><li> 천천히 withdra주의 깊게 펩타이드 투명 배럴과 작은 게이지 (28 ~ 30 G) 바늘 0.5 ml의 인슐린 주사기로 솔루션 및 W 기포를 제거합니다. 램프가 2 ~ 5 분 동안 워밍업 할 수 있도록 UV 램프를 켭니다. </li><li> 사진을 활성화 할 수 있도록 직접 5 분 동안 UV 램프 (365 nm의,&gt; 25 mW의 / ㎠)에서 펩티드 함유 주사기를 놓습니다. </li><li> 한편, 가열 램프 아래에 제한 수단에 마우스를 위치, 꼬리 또는 귀 태그 또는 발가락 문신 등의 식별 방법에 대한 영구 마커와 마우스를 라벨, 70 %의 알코올로 꼬리를 소독. </li><li> 즉시 UV 활성화 한 후, 우선적으로 꼬리의 뒤 부분에서, UV 활성화 IR680-AHX-NB (GPO) 꼬리 정맥에 9 용액 100 μl를 주입. 주사 후 다시 케이지에 마우스를 놓습니다. </li></ol></li><li> 콜라겐 리모델링 활동의 근적외선 형광 이미징 <ol><li> 세트진주 임펄스 2.0 소프트웨어를 사용하여 37 ° C에 충격 화상 카메라의 영상 침대의 히터 플레이트. </li><li> 산소의 2 % 이소 플루 란 (isoflurane)을 포함하는 마취 유도 챔버로 누드 또는 면도 마우스를 놓습니다. 처리 도중 호흡의 빈도 (~ 1/sec)를 모니터링하여 마우스 움직임의 부족에 의해 마취 비행기의 깊이를 확인합니다. </li><li> 마우스를 마취 한 후, 진주 이미 저 서랍을 열고 영상 침대에 동물을 배치합니다. 신속 코 콘 플러그를 제거하고, 이미징 프로세스 동안 (코 콘을 통해 2 리터 / 분에 전달 산소의 2 % 이소 플루 란으로) 마취 마우스를 유지하기 위해 코 콘 내부에 마우스의 총구를 밀어 넣습니다. 마우스가 자리에되면, 서랍을 닫습니다. </li><li> 악기가 이미지 소프트웨어 패널의 &quot;준비&quot;표시되면 이미지를 획득 &quot;버튼&quot;다음 상자 &quot;&quot;700 채널 &quot;,&quot;하얀 ​​빛 &quot;과&quot;85 미크론을 클릭합니다. NIR (여기 685 nm의 방출 720 NM)D 백색광 사진은 자동 초점과 노출을 사용하여 촬영합니다. </li><li> 녹음이 완료되면, 서랍을 열고 마우스를 설정하고, 다른 각도에서 이미지를 수집. 마우스가 다시 전면 (복부), (지느러미) 또는 카메라에 직면 측면으로 배치 할 수 있습니다. 구속은 관심 영역 (예를 들어, 갈비뼈, 발목과 손목)의 최고의 전망을 얻기 위해 팔다리를 스트레칭으로 테이프의 좁은 스트립을 사용할 수 있습니다. </li><li> IR680-CMP의 골격 이해를 관찰 할 수있는 적절한 시간은 투여 량 (1 ~ 4의 nmol / 마우스)에 따라 24-96 시간 포스트 분사 (HPI) 사이에있다. 고해상도 이미지를 얻기 72 HPI 후, 수술 집게와 가위를 사용하여 피부 (머리카락)를 제거 깊은 마취를하는 동안 자궁 전위에 의해 마우스를 희생하고, 상기 한 바와 같이 NIR 형광으로 이미지를하십시오. </li><li> 인수 NIR 형광 이미지를 분석 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. 예에있는 콜라겐의 시각화 생체0; 조직 섹션 <ol><li> 재료 준비 <ol><li> 10 %의 1 ㎖ 탈 이온수 (W / V) BSA 솔루션을 준비합니다. 실온 수욕 염소 혈청 1 ㎖를 해동. X 5cm 대략 2 cm의 크기에 파라 필름의 몇 조각을 잘라. </li><li> 염소 혈청 500 μL, 10X PBS 1 ㎖ 탈 이온수 8.5 ㎖를 혼합하여 차단 완충액 10 ㎖를 준비한다. 탈 이온수 4.45 ㎖ 및 500 ㎕의 10 배 PBS로 (W / V) BSA 10 %의 50 μl를 희석하여 CMP 희석액 5 mL를 준비합니다. </li><li> CMP 희석 버퍼를 사용하여 5 μm의, 카복시 표지 리테이너 타입 CMP, CF NB (GPO) 9 (480 μM)의 주식 솔루션을 희석. CMP 최적 농도는 조직 유형 및 조직 샘플의 특성에 따라, 2.5-30 μM에서 변화한다. 100 μL의 볼륨은 하나의 조직 절편 슬라이드를 염색하는 것이 좋습니다. 공식화 CMP의 한 solut를 저장어둠 속에서 이온. </li><li> 마우스 각막 조직 슬라이드를 실온으로 평형화하자. 5 분 1X PBS 버퍼에 슬라이드를 품어. 이 데모에 사용 된 마우스 각막 조직은 8 μm의 두께로 저온 절단 된 조직 테크 10월 중간에 냉동 보관 1 시간, 위해 PBS 용액에 4 % 파라 포름 알데히드로 시작하고, 충전 된 유리 슬라이드에 마운트되었습니다. </li></ol></li><li> 조직 염색 및 이미징 <ol><li> 가습 챔버에서 슬라이드를 놓습니다. 각 슬라이드에 차단 솔루션의 0.5 ML을 적용하고 실온에서 30 분 동안 슬라이드를 품어. 종이 타월에 슬라이드를 내듯 차단 솔루션을 제거합니다. </li><li> 각 슬라이드의 조직 섹션을 포함하는 CF NB (GPO) 9 솔루션의 약 100 μl를 적용합니다. CMP 용액이 조직을 침투 할 수 있도록 2 분간 슬라이드를 배양한다. </li><li> UV 램프를 켭니다. 램프가 예열 ​​될 때, CMP 덮인 조직을 노출 SE갇힌 CMP한다 탈 보호하는 6 분 (365 nm의, ~ 8 mW의 / cm 2)의 UV 광에 ctions. UV 노광 한 후, 건조를 막기 위해, 파라 필름의 조각을 각 슬라이드 조직 절편을 커버. 가습 실에서 슬라이드를 놓고 2 시간 동안 4 ° C에서 그들을 품어. </li><li> 1X PBS에서 DAPI 용액 1:3,000 희석을 준비합니다. CMP 염색 한 후, 부드럽게 집게와 파라 필름을 제거하고 여분의 CMP 솔루션을 제거하기 위해 종이 타월에 슬라이드를 얼룩. 각 조직 슬라이드로 희석 DAPI 솔루션의 약 100 μl를 적용하고 실온에서 1 분 동안 품어. </li><li> 염색 후, 5 분 동안 염색 항아리에서 1X PBS 버퍼에 슬라이드를 담가. 언 바운드 염색 에이전트를 씻어 신선한 1X PBS에이 배를 반복합니다. </li><li> 조직 섹션에 장착 매체의 방울을 추가하고 공기 방울이 피하면서 유리 커버 슬립으로 커버. 빛으로부터 그들을 보호하기 위해 골판지 슬라이드 트레이에 슬라이드를 넣습니다. </li><li>이미지 콜라겐 가닥 (FITC 채널) 및 세포 핵 (DAPI 채널) 형광 현미경을 이용하여 조직 슬라이드에서. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+collagen+strands+by+photo-triggered+triple-helix+hybridization.">Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).</li><li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis:+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease.">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K:+its+skeletal+actions+and+role+as+a+therapeutic+target+in+osteoporosis.">Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).</li><li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts.">et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).</li><li>Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-synthesis+of+a+protease-activatable+collagen+targeting+probe.">Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe.</a> Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+modification+of+collagen+scaffolds+mediated+by+triple+helical+propensity.">Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity.</a> Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).</li><li>B&#228;chinger, H. P., Morris, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+thermal+stability+of+type+II+collagen+in+various+solvents+used+for+reversed-phase+high+performance+chromatography.">Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography.</a> Matrix. 10, 331-338 (1990).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+collagenous+proteins+by+fluorescently+labeled+collagen+mimetic+peptides.">Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides.</a> Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).</li><li>Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-tethered+collagen+mimetic+peptides+for+studying+heterotrimeric+triple-helical+interactions.">Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions.</a> Biopolymers. 95, 94-104 (2011).</li><li>Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-the-resin+N-terminal+modification+of+long+synthetic+peptides.">On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).</li><li>Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+modification+of+collagen+directed+by+collagen+mimetic+peptides.">Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+growth+factors+on+collagen+scaffolds+mediated+by+polyanionic+collagen+mimetic+peptides+and+its+effect+on+endothelial+cell+morphogenesis.">Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis.</a> Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).</li><li>Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-assisted+visualization+of+binding+interactions+between+collagen+mimetic+peptide+and+collagen+fibers.">Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).</li><li>Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-bound+VEGF+mimetic+peptides:+design+and+endothelial+cell+activation+in+collagen+scaffolds.">Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds.</a> Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).</li><li>van Hagen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+radiolabelled+cyclic+DTPA-RGD+analogue+for+tumour+imaging+and+radionuclide+therapy.">Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy.</a> Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).</li><li>Boudko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+propagation+of+the+collagen+triple+helix+in+single-chain+and+trimerized+peptides:+transition+from+third+to+first+order+kinetics.">Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics.</a> J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).</li><li>Ackerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+dependence+of+the+folding+of+collagen-like+peptides.">Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides.</a> J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Brodsky, B., Persikov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+collagen+triple+helix.">Molecular structure of the collagen triple helix.</a> Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜에서 알 수있는 바와 같이 CMP한다 갇힌의 UV 활성화는 공통 꼬리 정맥 주사 프로토콜 (19)만을 추가 단계이기 때문에, CMP의 배송은 간단하다. 키는 uncaged 및 준 단일 가닥 상태에서 펩타이드 프로브를 삽입하는 것입니다. 케이지 그룹은 자기 조립에서 CMP를 방지하고 그것이 CMP 트리플 헬릭스에 접하기 시작하는 시점에서 UV 빛에 의해 제거 될 때까지 콜라겐 (그림 2B)에 결합. 주사제는 신속하게 독성을 최소화하기 위해 UV 조사시 쪼개진 케이지 그룹과 반응 할 수있는 시스테인이 포함되어 있습니다. 다른 변종 (예 : SKH-1 DR-1)와 다수의 마우스는이 제제를 사용하여 테스트 한, 우리는 6 개월까지이 마우스에있는 어떤 행동이나 다른 건강 결함을 감지하지 못했습니다. 사출 UV 노출 직후에 수행하지 않는 경우, CMP한다 기준 혼성화 능력이없는, homotrimeric 삼중 나선으로 접힐 것이다. 그림 2c는 주사 전에 CMP한다 완전히 긴 지연 시간 (&gt; 이일)에 의해 배 나선으로 재 조립 된 극단적 인 경우를 보여줍니다. 이 문제를 회피하기 위해, CMP 솔루션은 상대적으로 낮은 농도 (예를 들면 ~ 40 μM)에서 제조, 즉시 UV-decaging 후 생쥐에 주입해야한다. 때문에 희석 조건에서 CMP한다의 느린 배 나선 접는 속도 (폴딩의 절반 시간 :&gt; 50 분)와 짧은 자외선 노출 및 주입 시간 (5 ~ 7 분 합계), CMP한다 대부분의 단일 혈류를 입력 이 프로토콜을 준수 할 때 양식을 좌초. 농도를 재 조립 속도 18에서 극적인 감소로 이어지는, 혈액 풀의 20 배 감소로 일단 주입, CMP한다은 단일 가닥으로 남아있을 것으로 예상된다. 주입이 지연 (예 인해 동물의 처리에) 및 homotrimeric 폴딩이 의심되는 경우, 부분적으로 조립 된 펩타이드는 70 이상으로 가열하여 활성화 할 수 있습니다76, C는 신속한 냉각 주입 한 다음 단일 가닥에 CMP한다 해리합니다. 덜 편리하지만, 이러한 열 해리 CMP한다은 (그림 2D)을 대상으로 생체의 결과를 기대합니다. NIR 신호의 최대 50 %가 머리에 의해 차단 될 수 있기 때문에이 데모에서는, 누드 마우스는 근적외선 형광 이미징에 사용되었다. 머리 마우스 모델 (검은 머리카락과 함께 특히 사람)로 작업 할 때, 우리는 전기 면도기 나 헤어 리무버를 사용하여 이전 영상에 관심 영역에 마우스를 면도하는 것이 좋습니다. 그림 1에서, 동물의 음식에 엽록소의 자동 형광에 의해 발생합니다 동물의 복부에서 거짓 긍정적 인 신호가있다. 이러한 배경 신호는 크게 약 사일 전에 이미지에 정제 다이어트에 마우스를 전환하여 낮출 수있다. 그림 1 (a)에 보이는 것과 같이, 강한 CMP의 흡수량은 꼬리 스핀에있다전자. 따라서 불완전 꼬리 정맥 주사로 인한 아티팩트를 방지하기 위해, 우리는 주사 부위는 형광 이미지에서 포착되지 않도록 꼬리의 후방 부에 주입 추천합니다. 표시 CMP는 다른 방법을 사용하여 감지하기 어려운 생체 내에서 콜라겐 리모델링의 특정 위치의 타겟팅 및 이미징을 할 수 있습니다. 예를 들어, ELISA-기반의 혈액과 소변 분석은 절단 된 콜라겐 텔로 펩타이드 단편 대해 민감하지만 가용성 항원을 표적으로하기 때문에 상기 방법은 콜라겐 회전율의 소스를 지역화 없다. NIR을 사용하여 생체 내 이미징 기술의 주요 한계는 헤모글로빈 710분의 680 nm의 근적외선 염료의 내생 끄는대로 CMP한다 근위 풀링 적혈구로 깊이 침투 감쇠 담금질 있습니다 표시. 생체 내 이미징에서 CMP의 미래 응용 프로그램은 직접 감마 방출 핵종 또는 양전자 EMI 레이블이 CMP한다을 사용하여 SPECT 또는 PET 영상을 포함tters, 콜라겐 리모델링 (예를 들면 골다공증, 관절염, 동맥 경화, 섬유화)을 포함하는 질병 상태의 진단을위한. 이러한 무선 표지 CMP 유사체 조직의 깊이와 풀​​링 된 적혈구의 존재로 인한 신호 손실의 한계를 제거하고, 병에 걸린 조직의 정량적 측정을 수 있습니다. 또한, 상대적으로 늦게 촬영 시간 (예 : 48 ~ 96 HPI)는 CMP한다의 느린 바인딩 및 정리로 인한 어려운 콜라겐 리모델링의 급격한 변화를 따라 만들 수 있습니다. 이러한 제한은 바인딩 속도론 및 CMP의 이미징 요원의 친 화성의 추가 공학에 의해 극복 될 수있다. CMP는 작은 구조가 변성 된 콜라겐에 결합하기 때문에, CMP 기반 콜라겐 영상은 수 만 이미지 콜라겐 섬유 5 번째 고조파 발생 현미경을 보완. 찬란과 CMPS 조직 절편을 염색 할 때, 우리는 도움이 부화 발견4 ° C,에서 UV 활성화 펩타이드 솔루션의 샘플은 삼중 나선 하이브리드는 낮은 온도 1,20에 용이하기 때문이다. 또한 염색 항아리에 신선한 PBS 버퍼에있는 슬라이드를 담그는 것은 단순히 샘플을 통해 세척 버퍼를 피펫 팅보다 훨씬 더 잘 작동하는, 언 바운드 CMP한다 씻어 수있는 가장 효과적인 방법입니다 것으로 나타났습니다. CMP-콜라겐 가닥 하이브리드는 매우 구체적이고 강력하므로이 비디오에 제시된 간단한 염색 프로토콜은 쉽게 추가 생체를 costaining에 대한 수정 및 고정되지 않은 조직 섹션에서 성능이 저하 된 콜라겐을 식별 할 수 있습니다. 이것은 다양한 조직 학적 샘플에서 콜라겐 섬유를 검출하기 위해 항 - 콜라겐 항체를 사용하는 효과적이고 편리한 대안이다.

콜라겐, 포유 동물에서 가장 풍부한 단백질은 세포의 증식 및 분화를 지원함으로써 조직 발달 및 재생에 중요한 역할을한다. 섬유 콜라겐 (예를 들어, 유형 I, II), 결합 조직의 조직에 기계적인 힘을 제공하는 동안, 네트워크와 같은 콜라겐 (타입 IV)는 세포가 부착하고 조직 조직을 형성하는 기저막의 기본 골격을 형성한다. 콜라겐 리모델링 콜라겐 분해 (단백질 분해 효소에 의해) 및 합성 (성장 인자에 의해 추진)을 모두 포함한다. 콜라겐 리모델링, 뼈의 예를 들면, 정상 조직의 갱신 과정, 초과 개조 활동, 또는 비정상적인 위치에있는 그것의 발생의 한 부분이지만, 일반적으로 나타냅니다 상처 부상이나 암, 골다공증, 관절염과 같은 만성 병적 인 상황에 대응을 치유하고, 섬유증 1-4. 직접 이미지 콜라겐은 생체 내에서 리모델링을 진행하는 능력은 진행 상황에 대한 이해로 이어질 수이러한 질병의 이온뿐만 아니라, 새로운 진단 및 치료. 예를 들어, 라이브 영상은 중증도 및 질환의 위치에 대한 정보를 제공 할 수 있고, 또한 새로운 치료제의 효능을 평가하기 위해 사용될 수있다. 다 광자 레이저 스캐닝 현미경과 두 번째 고조파 발생 살아있는 쥐 5에 종양 세포 외 기질 리모델링 모니터링을위한 영상 원 섬유 콜라겐에 적용되었습니다. 그러나,이 방법은 침습적 인, 투명 등쪽 피하 지방 챔버에 장착 할 동물을 필요로한다. 콜라겐 리모델링의 직접적이고 비 침습적 영상은 특별히 개조를 겪고 콜라겐을 대상으로하는 조사에서 도움이 될 것입니다. 이러한 조사는 정상 조직 6 풍부 온전하고 성숙한 콜라겐에서 리모델링 콜라겐을 구별 할 필요가 있기 때문에 준비하기가 어렵습니다. 콜라겐입니다 트리플 헬릭스라는 매우 희귀 한 단백질의 구조로 구성되어 있습니다콜라겐 리모델링 동안 매트릭스 메탈로 프로테아제 (MMP)와 같은 단백질 분해 효소에 의해 절단. 분해 콜라겐 조각은 배 나선 구조를 잃고 더 특이 단백질 분해 효소 (1)에 의해 소화 펼쳐진 가닥 (젤라틴),가. 그것은 최근에 삼중 나선 구조로 접을 수있는 성향을 가지고 콜라겐 모방 펩티드 (CMP)가 구체적으로 어느 열 변성에 의해 또는 효소 분해 1,7하여 삼중 나선 상태에서 분해되는 콜라겐 가닥을 대상으로 할 수 있다는 것을 발견했다. 바인딩은 주로 단량체 CMP한다과 변성 된 콜라겐 가닥 사이에 삼중 나선 교잡에 의해 구동된다. CMP한다 콜라겐 하이브리드, 갇힌 CMP를위한 작은 구동력으로 실온에서 homotrimeric 트리플 나선에 자기 조립하기 때문에 [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, NB (GPO) 9로 지정, O : 하이드 록시 프롤린], 개발 된 어느 사진 분해성 니트로가 포함되어그룹 (NB) 펩티드의 중앙 글리신 부속. NB 케이지 그룹은 입체적으로 트리플 헬릭스에 접어에서 CMP를 방지, 아직, UV 조사에 의해 케이지 그룹의 제거는 바로 삼중 나선 접이식 콜라겐 하이브리드 1을 트리거합니다. 근적외선 (NIR) 형광 물질로 표지 단량체 CMP한다이 체계적으로 쥐를 모델로 전달 될 ​​때, 구체적 대상과 일반 (예를 들어, 뼈와 연골)을받은 조직 병리학 (예 : 종양) 1 개조의 변성 된 콜라겐의 생체 내 이미징 할 수 있습니다 . 형광 표지 된 CMP한다 또한 조직 학적 조직 섹션에 콜라겐을 묘화를 위해 사용될 수있다. 조직 학적 연구에서 수확 조직은 종종 세포 구성 요소와 열화 전체 조직의 형태를 유지하기 위해 고정으로 유지됩니다. 열, 유기 용매로 처리, 화학적 상호 린킨을 포함하는 고정 절차,G 시약 (예를 들어, 파라 포름 알데히드), 콜라겐 (8)의 삼중 나선 구조를 변성. 이 변성 CMP 하이브리드을위한 사이트를 생성합니다. 그것은 그 찬란 CMP한다 특별히 더 효율적으로 섬유 성 간 조직 9 병적 상태의 손쉬운 식별을 허용 항 콜라겐 항체보다 고정 된 조직 섹션에서 콜라겐에 (예를 들어, 피부, 각막, 뼈를) 바인딩 할 수 있습니다 나타났다. CMP는 콜라겐의 모든 타입에 공통 삼중 나선 모티프의 아미노산 서열을 함유하는 변성 콜라겐 가닥을 표적. 따라서 CMP는 광범위한 스펙트럼 콜라겐 착색제 간주 될 수 있습니다. 여기, 우리는 형광 표지 리테이너 타입 CMP한다를 사용하여 생체 내에서 변성 된 콜라겐 섬유 및 생체 조직 절편에서 II) 시각화 콜라겐을 영상) 나에 대한 세부 실험 절차를 제시한다. NIR 태그, IR680은, 라이브 영상, 간편하게 조절할에 갇힌 CMP에 결합시켰다전자 카르복시 (CF)는 표준 형광 현미경과의 호환성을 위해 조직 염색 작업에 사용되었다. 이 프로토콜은 콜라겐 리모델링에 관련된으로 CMP한다의 이미징 응용 프로그램에 초점을 맞추고 있습니다. CMP 합성하는 방법은 이전의보고 1,7,9-15에서 찾을 수 있습니다. 이 비디오 보고서에서, 정상 마우스와 마우스 각막의 조직 섹션에서 영상 골격 조직은 데모 목적을 위해 선택되었다, 여기에 제시된 방법은 쉽게로, 콜라겐 리모델링 (예를 들어, 종양, 상처 치유를) 포함하여 많은 병리 생물학적 모델에 적용 할 수 있지만 물론 콜라겐이 들어 거의 모든 접두사 조직 샘플에 관해서.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IRdye 680RD Maleimide (IR680)</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">929-71050</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5(6)-Carboxyfluorescein</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">21877-5G-F</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Advanced Chemtech</td>
			<td style="width:137px;">YC2200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Butler Veterinary Supply</td>
			<td style="width:137px;">4/4/5260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">G9023-10ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:137px;">10236276001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluoroshield mounting medium</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">F6182-20ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:643px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:137px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:123px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:137px;">1447T17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Pearl impulse imager</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">9400</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Surgical forceps and scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EasyDip slide staining system</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;">M900-12B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">20-place cardboard microscope slide tray</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-545-c</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;">Eclipse TE2000-E</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides

콜라겐은 조직 형성 및 유지 보수를 지원하는 세포 외 기질 (extracellular matrix)의 주요 구조 요소입니다. 콜라겐 리모델링이 정상 조직 재생의 중요한 부분이지만, 개조 활동의 과도한 양의 종양, 관절염, 그리고 다른 많은 병적 인 상태에 참여하고있다. 콜라겐 리모델링 중에 콜라겐 분자의 삼중 나선 구조는 세포 외 환경에서 프로테아제에 의해 방해된다. 또한, 많은 조직 학적 조직 샘플에 존재하는 콜라겐 부분적 고정 보존 방법에 의해 변성된다. 따라서 이러한 변성 콜라겐 가닥 생물 이미징을위한 효과적인 목표를 제공 할 수 있습니다. 우리는 이전에 사진 트리거 콜라겐 고유 삼중 나선 구조를 형성하여 변성 된 콜라겐 가닥과 혼성화 할 수 있습니다 갇힌 콜라겐 모방 펩티드 (CMP)를 개발했다. 이 절차의 전반적인 목표는 변성 된 콜라겐 가닥 r에 이미지에) 내가있다생체 내에서 정상 개장 활동 esulting하고, ⅱ) 사진 트리거 리테이너 타입 CMP한다을 사용하여 생체 조직 섹션에있는 콜라겐을 시각화 할 수 있습니다. 효과적인 하이브리드 생체 내 및 생체 영상에서 성공을 달성하기 위해, 형광 표지 리테이너 타입 CMP한다은 사진을 활성화하거나 정맥 주사하기 직전에, 또는 직접 조직 섹션에 활성화됩니다. 접두사가 마우스 각막 조직 섹션에서 누드 마우스와 콜라겐의 일반 골격 콜라겐 remolding는이 절차에서 몇 군데 있습니다. 여기에 제시된 CMP-콜라겐 하이브리드 기술을 기반으로 영상 법은 조직의 리모델링 과정의 깊은 이해로 이어질뿐만 아니라, 높은 콜라겐 리모델링 활동과 관련된 질환에 대한 새로운 진단의 개발을 허용 할 수 있습니다.

그림 1은 사진 트리거 IR680-AHX - (GPO) 9는 24-96 시간 포스트 주사 후 건강한 여성 SKH1 누드 마우스에 배포하는 방법의 일반적인 결과를 보여줍니다. 그것은 언 바운드 대부분의 펩타이드는 크게 비우게되어있는 시점에서, 24 HPI 후 골격 명백한 CMP 축적을 보여줍니다. 개조 콜라겐 가닥과 혼성화의 CMP 공정은 특히, 다른 펩티드 이미징 프로브 (예 RGD 16)에 대조적으로, 상대적으로 느린 것으로 보인다. 이것은 대부분의 가능성이 있기 때문에 콜라겐 트리플 나선 (17, 18)의 느린 접는 속도입니다. 단지 약간의 신호 감소가 24 HPI (그림 1) 후 볼 수 있습니다 그러나, 한 번 하이브리드, CMP 가닥은 강하게, 콜라겐 조직에 바인딩됩니다. 96 HPI에서, 피부 제거 후 마우스의 NIR 형광 화상은 깨끗이 IR680-AHX-(GPO)의 골격 흡수를 보여 등뼈와 늑골에서뿐만 아니라, 무릎 내의 9, 발목,손목, 낮은 턱 (그림 2A). 생체 조직 염색에서 사진 트리거 형광 표지 된 리테이너 타입 CMP한다 특별히 조직 섹션의 변성 콜라겐 가닥 하이브리드. 그림 3에서, CMP 염색 명확 콜라겐 특정 착색제로 사용하는 방법을 보여줍니다 각막 기질에 잘 병렬 콜라겐 섬유를 보여준다. <img alt="그림 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> 그림 1. 누드 마우스의 시리얼 NIR 형광 이미지 9 네 일 동안 골 흡수를 보여주는 사진 - decaged IR680-AHX - (GPO)를 정맥으로 관리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:contenT 폭 FO = &quot;4 인치&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2. 사진 - decaged IR680-AHX - (GPO)를 투여 한 쥐의 NIR 형광 이미지 9 (A), UV 노출 (B)없이 IR680-AHX-NB (GPO) 9 감금, 트리플 나선형 [IR680-AHX - (GPO를 prefolded CMP에 의한 피부 제거 후 96 HPI에서) 9] 3 (C), 또는 열 해리 단일 가닥 IR680-AHX - (GPO) 9 (D). 골격 타겟팅은 A와 D에서 관찰 할 수있다. NIR 형광 신호는 무지개 규모에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> 그림 3. 마우스 공동의 형광 현미경 사진rneal 조직 섹션 파라 포름 알데히드에 접두사 및 DAPI 및 사진 트리거 CF (GPO)로 염색 9, 프로토콜 2를 사용 (녹색 CMP 스테인드) 조밀 한 콜라겐 기질을 표시뿐만 아니라 파란색 세포 상피 세포와 내피 세포 (DAPI 스테인드 ) (스케일 바 : 100 μm의).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides at JoVE.com

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

이 절차는 IR 형광 마우스에서 콜라겐 리모델링 활동의 영상뿐만 아니라 변성 콜라겐 가닥과 혼성화 사진 트리거 할 수 있습니다 갇힌 콜라겐 모방 펩타이드를 사용하여 조직 섹션에있는 콜라겐의 생체 염색 근처 생체 내에서 보여줍니다.

변성 콜라겐 물가 이미징<em&gt; 생체 내</em&gt;와<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 리테이너 타입 콜라겐 미메시스 펩티드의 사진 트리거 하이브리드를 통해

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

imaging-denatured-collagen-strands-vivo-ex-vivo-via-photo-triggered

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

11.8K 조회수.  University of Utah.  이 절차는 IR 형광 마우스에서 콜라겐 리모델링 활동의 영상뿐만 아니라 변성 콜라겐 가닥과 혼성화 사진 트리거 할 수 있습니다 갇힌 콜라겐 모방 펩타이드를 사용하여 조직 섹션에있는 콜라겐의 생체 염색 근처 생체 내에서 보여줍니다. 

비디오: Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

고해상도 3D 영상의 전 VIVO</em마이크로 중부 표준시로> 생물 학적 샘플

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

연구

생체공학

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

정상과 비정상적인 인간 조혈의 전직 생체내 흉내

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

기본, 섬유 긴 간격 및 Segmental 긴 간격 콜라겐의 체외 합성에

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Microtissue 안정화를위한 미세 유체 장치에서 레이어별로 층 콜라겐 증착

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

곡선 변환 기반 도구를 사용하여 피브릴라 콜라겐 조직을 정량화

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...

The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies

The chicken embryo and the blood-vessel rich chorioallantoic membrane (CAM) is a valuable in vivo model to investigate biomedical processes, new ultrasound pulsing schemes, or novel transducers for contrast-enhanced ultrasound imaging and microbubble-mediated drug delivery. The reasons for this are the accessibility of the embryo and vessel network of the CAM as well as the low costs of the model. An important step to get access to the embryo and CAM vessels is to take the egg content out of the eggshell. In this protocol, three methods for taking the content out of the eggshell between day 5 and&#160;8 of incubation are described thus allowing the embryos to develop inside the eggshell up to these days. The described methods only require simple tools and equipment and yield a higher survival success rate of 90% for 5-day, 75% for 6-day, 50% for 7-day, and 60% for 8-day old incubated eggs in comparison to ex ovo cultured embryos (~50%). The protocol also describes how to inject cavitation nuclei, such as microbubbles, into the CAM vascular system, how to separate the membrane containing the embryo and CAM from the rest of the egg content for optically transparent studies, and how to use the chicken embryo and CAM in a variety of short-term ultrasound experiments. The in vivo&#160;chicken embryo and CAM model is extremely relevant to investigate novel imaging protocols, ultrasound contrast agents, and ultrasound pulsing schemes for contrast-enhanced ultrasound imaging, and to unravel the mechanisms of ultrasound-mediated drug delivery.

This protocol describes three methods on how to obtain and use 5 to 8-day old chicken embryos and their chorioallantoic membrane (CAM) as an in vivo&#160;model to study contrast-enhanced ultrasound imaging and microbubble-mediated drug delivery.