우리는 우리의 실험실에서 콜라겐 fibrogenesis 연구를 위해 자신의 시간과 노력을 기부 한 모든 많은 과거의 학부, 대학원 및 사후 박사 학생을 감사드립니다. 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회는 지속적으로 우리의 콜라겐 연구를위한 기금을 제공하고 있습니다.

참고 : 모든 프로토콜에 사용되는 물 저항&gt; 18이 MΩ.cm. 1. 기본 콜라겐 원 섬유 <ol><li> 물 6 μl, 200 MM 20 μl이 HCL과 microfuge 튜브와 혼합의 KCl 400 MM의 10 μl로 pH를 7 조정 HPO 4 오세영 조화를 이루고 있습니다. </li><li> microfuge 튜브와 혼합에 콜라겐 단량체 (0.01 N HCL에 ~ 3 MG / ML) 4 μl를 추가합니다. 이 솔루션은 명확하고 무색해야합니다. </li><li> 37 미리 예열 된 열 블록에 반응 혼합물을 포함하는 microfuge 튜브를 삽입 ° C 및 3-4 시간에 출발합니다. 이 시점에서, 솔루션은 약간 흐리다 주로 기본 콜라겐 원 섬유를 포함해야합니다. </li></ol> 2. 섬유 긴 간격 콜라겐 <ol><li> 실온에서 24 시간에 걸쳐 물 네 번 변화, 물 400 ML에 대해 12-14 kDa MWCO 막을 사용하여 콜라겐 단량체 (0.01 N HCL에 ~ 3 MG / ML) 1 ML을 Dialyze. dialyzed collag바로 사용하지 않는 전용 모노머는 4 ° C에서 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다. </li><li> 물을 20 μl 물 3 MG / ML α1-산성 당 단백질의 20 μl와 microfuge 관 dialyzed 콜라겐 모노머의 20 μl 조화를 이루고 있습니다. 이 솔루션은 명확하고 무색해야합니다. </li><li> 30 분 동안 실온에서 반응 혼합물을 포함하는 microfuge 튜브 둡니다. 이 시점에서, 솔루션은 흐린이어야하며 주로 FLS 콜라겐 원 섬유를 포함해야합니다. </li></ol> 3. Segmental 긴 간격 콜라겐 <ol><li> 물을 67 μl, 산도 3.3 100 MM 글리신 - HCL 버퍼 60 μl와 microfuge 튜브와 혼합의 물에서 10 MG / ML ATP의 40 μl 조화를 이루고 있습니다. </li><li> microfuge 튜브와 혼합에 콜라겐 단량체 (0.01 N HCL에 ~ 3 MG / ML) 33 μl를 추가합니다. 이 솔루션은 명확하고 무색해야합니다. </li><li> 2 시간 동안 실온에서 반응 혼합물을 포함하는 microfuge 튜브 둡니다. 이 시점에서, 해결책은 아직 확실 나타나지만해야합니다대부분 SLS 콜라겐이 포함되어 있습니다. </li></ol> 4. AFM 특성 <ol><li> 다니엘 끈적 테이프의 한 부분으로 운모 표면을 덮고하여 다음을 멀리 필링 AFM 기판에 부착 된 운모의 한 부분의 표면. 운모의 전체 층이 표면에 위반을 줄이고 운모를 재사용하는 경우 기존의 샘플이 제거되어 있는지 확인하기 위해 흘리고되었는지 확인하기 위해 나중에 테이프를 확인합니다. </li><li> 갓 흘리고 운모 기판에 콜라겐 섬유 솔루션 20 μl을 적용합니다. 5 분에 출발합니다. </li><li> 부드럽게 물과 콜라겐 섬유의 솔루션을 씻어 내 버리지. 직접 운모 기판의 중심에 있지만 가장자리에 물을 적용하고 샘플을 가로 질러 흐르고 허용하지 것이 좋습니다. </li><li> 질소 가스의 완만 한 흐름에 따라 표면을 말린다. 이 운모 기판의 중심에서 가장자리에서 스트림이 아닌을 지시하는 것이 좋습니다. </li><li> 200 × 배율의 광학 현미경에 따라,기본 및 FLS 콜라겐 샘플 원 섬유의 clumps를 표시합니다. SLS의 콜라겐이 표시되지 않습니다. </li><li> 세 가지 콜라겐 구조의 독특한 특성은 AFM으로 관찰 할 수 있습니다. 일반적으로, 실리콘 AFM 프로브를 사용하여 간헐적 접촉 모드에서 AFM과 우리는 이미지를 기본 콜라겐 원 섬유, FLS와 SLS의 콜라겐이 접촉 모드에서 AFM과 우리가 일반적으로 이미지 실리콘 질화물 AFM 프로브를 사용하여 원 섬유 반면. 우리는 때문에 시간과 비용을 고려이 작업을 수행합니다. 실리콘 AFM 프로브는 일반적으로 이미지 기본 콜라겐 원 섬유의 좁은 구간 구조들이 특히 유용한 실리콘 질화물 AFM 프로브보다 선명합니다. 그러나, 실리콘 AFM 프로브는 실리콘 질화물 AFM 프로브보다 콜라겐 샘플의 오염에 대해 더 많이 경향이 자주 교체해야합니다. 따라서, 우리는 대부분 해상도가 더 필요합니다 이미징 기본 콜라겐 원 섬유에 대한 실리콘 AFM 프로브의 사용을 보유 우리는 prol에 간헐적 접촉 모드에서 작동유용성의 긴 사연은 평생. </li></ol> 우리는 적어도 몇 콜라겐 구조를 표시해야합니다 초기 100 × 100 μm이 검사를하는 것이 좋습니다. 그 안에서, 확대에서 10 사이즈 × 10 μm 2 다음 2 × 기본 및 FLS 콜라겐, 또는 SLS 콜라겐의 미세한 기능의 구간 주기성을 관찰하는 두 μm 2 스캔합니다. 또한 초기 스캔이 대표인지 확인하기 위해 콜라겐 샘플에 적어도 두 개의 다른 지역을 확인하는 것이 좋습니다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

콜라겐 단량체를 정화하는 것은 낮은 산도와 온도에 안정적이며, 기본 콜라겐 원 섬유의 형성은 기본적으로 콜라겐 모노머 솔루션의 pH 및 온도를 높여 포함됩니다. 단량체의 밴드 콜라겐 원 섬유의 reconstitution에 대한 절차는 50 년 이상 동안 존재했습니다. 15 년 전 콜라겐과 첫 번째 연구에 사용 된 저희 연구실은 7 절차에 따라되었음을 절차는 1986 10 채프만과 동료에 의해 ​​요약. 그 이전 일에 콜라겐 섬유 형성을위한 조건은 34에서 오세영이 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0.2, 산도 7.4) 버퍼에 0.18 MG / 콜라겐 모노머의 ML ° C. 있었다 이것과 우리가 노력 한 다른 절차의 단점은 원하는 밴드 원 섬유와 함께 형성 항상 unbanded 원 섬유가 있다는 것입니다. 새로운 조건 ~ 산도​​ 7 100 MM 인산과 100 밀리미터 KCl의 0.3 MG / 콜라겐 모노머의 ML 3-4 시간에 37 ° C에서 떠났다.에게 procedure는 기본 콜라겐 원 섬유를 만들기 위해 이전 절차에서 모든면에서 차이가 여기에 설명했다. 하지만 대부분의 현저하게, 우리는 버퍼 농도를 높여 100 밀리미터 KCl을 추가하여 이온 강도를 두 배로했습니다. 독점적 밴드 콜라겐 원 섬유의 더 일관성 형성에 이온 강도 결과에 증가하고 있습니다. 콜라겐 모노머 솔루션은 사용 제조업체의 권장 기간을 통과했을 때 우리의 경험에서이 절차는 기본 유형 콜라겐을 생산하지 않은 유일한 시간이었다. 이 문제가 발생하면, 어떻게 모든 여전히 관찰 많은 원 섬유에 unbanded하지만 주로 unbanded 아르 이하의 원 섬유의 범위를 관찰합니다. 유효 기간이 만료 콜라겐 모노머은 종종 여전히 기본 콜라겐를 만들기 위해 사용할 수 있지만, 실패 할 경우, 새로운 콜라겐 모노머은 분명히 구입해야합니다. FLS 먼저 Highberger 외에 의해 확인되었다. 콜라겐 준비에 17 Orekhovic에 반영H 외. 18. 또한 연구 Highberger와 슈미트는이 FLS (12)의 형성을 촉진 α1-산성 당 단백질이라고 빠졌다는 생각이 들어서. 우리는 나중에 상업적으로 이용 가능한 콜라겐 모노머과 낮은 산도에서 α1-산성 당 단백질을 결합 천천히 산도는 24 시간 11 물에 대한 혼합물을 dialyzing으로 증가 할 수 있으므로 FLS의 콜라겐을위한 절차를 복제 할 수있었습니다. 우리는 지금 첫번째 물에 대한 콜라겐 모노머를 dialyzing하고 간단하게 FLS의 콜라겐을 형성하기 위해 물에 α1-산성 당 단백질과 결합하여 그 절차의 수정을 제시한다. 여기에 설명 된 FLS 콜라겐 조립 조건은 훨씬 더 많은 시간이 소요됩니다. 콜라겐 모노머는 아직 물에 대한 사전 dialyzed 할 필요가 있지만 대량으로 수행 한 후 ° C 안정적이 사용 될 때까지 4에 저장할 수 있습니다. 이 새로운 절차 수율은 주로 밴드 콜라겐 원 섬유를 FLS. 우리의 경험에서, α1-산성 glyco낮은 결합 단백질과 물이 콘텐츠와 단백질, 그리고 추론 높은 당도하여 성공적으로 FLS 원 섬유를 만드는 것이 중요합니다. 우리는 일반적으로 우리가 사용하는 α1-산성 당 단백질의 많은 82 이하의 결합 %의 단백질과 물이 콘텐츠가 있다는 것을 제조업체에 문의하십시오. 그리고 너무 오래 기본 콜라겐 합성, 콜라겐 모노머하는 절차로도 FLS의 콜라겐을 생산하는 고장이 발생할 수 있습니다. 또한, 투석에 사용되는 물의 순도는이 절차의 중요합니다. 예를 들어,도에 대한 콜라겐 모노머 ~ 8 MΩ.cm보다는 FLS의 콜라겐을 형성하지 않습니다 콜라겐 솔루션&gt; 18 MΩ.cm 물 결과의 투석. 세 콜라겐 섬유 유형, 할 수있는 가장 쉬운는 SLS의 콜라겐입니다. SLS의 초기 준비는 슈미트와 동료 15 설명했다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 coll를 사용하여 SLS의 콜라겐을위한 12 년 전 그 프로 시저의 적응을 발표agen 14. 절차는 간단하게 2 밀리그램 / ML ATP와 0.05 %에서 0.5 MG / 콜라겐 모노머의 ML (V / V) 산도 3.5 아세트산을 결합하고, 하루 아침에 실온에서 혼합을 떠날 entailed. 우리의 경험에서 제어 할 수 있어야합니다 SLS 조립의 중요한 점은 반응 솔루션의 pH입니다. SLS는 crystallites의 누적 clumps에 더 많은 기본 조건 (~ 산도를 3.6-3.9) 결과에 조립. 더 많은 산성 조건 (~ 산도를 2.9-3.2) 산도 3.3-3.5의 이상적인 조건 하에서 조립 사람들보다 얇은, 더 분리 crystallites의 결과입니다. 이 범위 (&lt;2.8과&gt; 4) 이외의 반응 PHS는 SLS 콜라겐를 얻을하지 않습니다. 과거에는, 우리는 아세트산을 추가하여 반응 혼합물의 pH를 조정. 더욱 절차를 단순화하기 위해이 원고에서 우리는 pH를 제어 할 수 글리신 - HCL 버퍼를 도입했습니다. 위에서 설명한 프로토콜에서 형성된 세 가지 콜라겐 구조는 문자가그 istic 기능은 나노 미터의 해상도를 할 수있는 수단으로 discerned 할 수 있습니다. 기본 및 FLS 콜라겐은 ~ 67 나노 미터와 ~ 270 nm의 periodicities을 구간을 특징으로하고 있습니다. SLS의 콜라겐의 긴 치수는 ~ 360 nm의 것입니다. 우리는 세 가지 콜라겐 구조를 특성화 AFM을 사용하는 방법 구체적으로 설명하고 있습니다. 단, AFM 프로브는 &lt;10 나노 미터 반경을 가지는 연락처 또는 간헐적 접촉 모드에서 AFM 운영은 이미지이 콜라겐 구조를 할 수 있어야한다. 또한, 전자 현미경은 수 있으며 이러한 콜라겐 구조에게 19을 특징하는 데 사용되었습니다. 이러한 절차의 주요 이점은 그들이 원하는 콜라겐은 건설 주로 생산한다는 것입니다. 이 반응에서 찾을 수있다 콜라겐의 유일한 다른 형태는 종종 AFM 이미지의 배경에 표시됩니다 시작 단량체입니다. 기본 및 FLS 콜라겐의 경우, 그들은 쉽게 unrea의 대부분에서 분리 될 수물 결과 네이티브 또는 FLS 콜라겐 펠릿의 반복 원심 분리와 세척로 cted 단위체. 우리는 고급, 상업적으로 이용 가능한 출발 물질을 사용하여 원시, FLS와 SLS의 콜라겐을 만들기위한 간단하고 신뢰성이 절차를 제시했습니다. 이러한 모든 절차에 사용되는 콜라겐 모노머는 정화 형태로 상업적으로 사용할 수 있습니다. α1-산성 당 단백질과 ATP는 상업적으로도 가능에 있습니다.

콜라겐은 세 폴리펩티드 사슬에서 형성 트리플 나선형 구조를 가지고 구조 단백질의 클래스입니다. 이 트리플 나선형 단량체은 또한 점점 더 큰 구조를 형성 할 수있는 hierarchal 방식으로 조립. 1 확인되었습니다 최소 28 유전자 다른 콜라겐 종류가 있습니다. 결합, 콜라겐으로 합성 한 모든 콜라겐 단백질 2 90 %까지 I 지배적 인 양식 회계를 입력과 동물에서 발견 된 총 단백질의 30 %를 차지합니다. 입력 I의 콜라겐은 피부, 인대, 힘줄과 뼈에 fibrillous 구조로 발견됩니다. 원자 힘 현미경 (AFM)과 전자 현미경 (EM) I 기본 콜라겐 섬유는 일반적으로 ~ 67 nm의 3-5 (보통 D-구간로 칭함)의 특징 기간과 구간 표시 형식의 이미지. 제가 콜라겐 모노머는 두 개의 동일한 α1 (I) 체인 하나 α2 (I) 체인보다 각각 더로 구성된 트리플 나선형 heterotrimer입니다 입력긴 천 아미노산. 그것은 긴 길이와 직경 1.4 나노 미터에 300 nm의 크기와 얇은입니다. 콜라겐 단량체가 쉽게 자연적으로 형성된 높은 순서 구조에게 6 파괴함으로써 얻을 수 I를 입력합니다. 우리 7 많은 사람들의 8-10는 이러한 수용성 단량체 빌딩 블록은 다음 체외에서 D-밴드 원 섬유를 (그림 1) 재구성하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. 기본 콜라겐 원 섬유뿐만 아니라, 두 개의 다른 높은 순서 콜라겐 구조는 같은 단량체 빌딩 블록을 사용하여 체외에서 형성하는 것으로되어 있습니다. 두 구조는 섬유 긴 간격 (FLS) 및 segmental 긴 간격 (SLS) 콜라겐 (그림 1)입니다. 콜라겐 모노머은 α1-산성 당 단백질과 결합 될 때 FLS 콜라겐은 원래 콜라겐 같은 fibrillous 구조이지만, 원래 콜라겐 11. 체외에서보다 큰 구간 주기성을 특징으로하는, FLS의 콜라겐이 형성 <suP&gt; 12. FLS의 콜라겐은 비록 거의 13도 생체에서 관찰되지 않았습니다. 단량체가 결정 격자 14처럼 레지스터에 정렬되어 있기 때문에 SLS의 콜라겐이 crystallites으로 설명되어 있습니다. 콜라겐 모노머는 아데노신 삼인산 (ATP) 15와 결합 될 때 SLS의 콜라겐이 형성한다. 자연적으로 발생 SLS의 콜라겐은 섬유 아세포의 문화 매체에서 관찰되지만 추출 조직 샘플에서 가능성이 작은 크기와 구별 지형은 16 부족으로 인해.되었습니다 이 원고의 목표는 잘 FLS, 심지어 가장 경험이 연구자가 재현 할 수있는 SLS의 콜라겐과 같은 기본 콜라겐 원 섬유를 만들기에 대한 자세한 절차를 제시하는 것입니다. 상업적으로 이용 가능한 고급 출발 물질을 사용하여, 우리는 가능한 한 간단하게 프로토콜을 만들기 위해 노력하고 아직도 그들을 안정적으로 작동하고 있습니다. 어떻게 다른 콜라겐 구조를 특성화 AFM을 사용하는 방법 또한 자세히만든 s입니다. 이 작품이 높은 순서 콜라겐 구조 중 하나 이상을 공부 및 / 또는 기타 응용 프로그램에서 전구체로 사용하려면 연구자에게 도움이 될하지만, 현재 전문 지식의 부족하거나 조직 샘플에서 작동하도록하지 않으 않습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 재료 / 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> I 콜라겐 모노머를 입력 (~ 3 MG / ML 0.01에서 N HCL) </td><td> Inamed 고급 Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> 롯 1,261,443 (2.9 MG / ML, 산도 2.1) 롯 1,629,346 (3.2 MG / ML, 산도 2.1) 롯 6006 (3.2 MG / ML, 산도 2.1) </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 연구 Biochemicals 국제 </td><td> A-141 </td><td> 롯 FBJ-1194A </td></tr><tr><td> 소 플라즈마에서 α1-산성 당 단백질 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G3643 </td><td> 많은 051K7440 (89.8 %) 많은 011K7410 (82 %) 많은 065K7405 (71.2 %) 많은 063K7495 (71.9 %) 많은 117K7535 (75.9 %) (단백질 + 수분 함량) </td></tr><tr><td> A1-산 glycopr인간의 플라즈마에서 otein </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G9885 </td><td> 많은 128H7606 (70.9 %) 많은 049K7565V (68 %) (단백질 + 수분 함량) </td></tr><tr><td> 운모 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - 실리콘 SPM-센서 </td><td> Nanoworld </td><td> NHC </td><td> 우리는 간헐적 접촉 모드에 실리콘 AFM 탐침을 사용하는 것이 </td></tr><tr><td> Veeco의 Nanoprobe 팁 </td><td> Veeco (현재 Bruker AFM 프로브) </td><td> NP-S </td><td> 우리가 접촉 모드에 사용하는 실리콘 질화물 AFM 프로브 </td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of native, fibrous long spacing and segmental long spacing collagen

콜라겐 원 섬유는 구조 비계와 기계적 강도를 제공하기 위해 동물 조직의 세포 외 기질에 존재한다. 이러한 기본 콜라겐 원 섬유는 ~ 67 nm의 특성 구간 주기성을 가지고 길이와 직경 1.4 나노 미터에 300 nm의 아르 유형 I 콜라겐 단량체의 계층 총회를 통하여 생체에 형성된다. 체외에서, 그에게 조건을 변화하여 단량체 빌딩 블록이 노출되어, 50 미크론까지의 길이 저울에 이르기까지 독특한 구조는 기본 타입 원 섬유뿐만 아니라 포함 건설뿐만 아니라, 섬유 긴 간격 및 segmental 긴 간격 콜라겐. 할 수 있습니다 여기, 우리는 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 콜라겐 모노머의 세 가지 콜라겐 구조를 형성하기위한 절차를 제시한다. 우리와 다른 사람들이 세 가지 유형의를 만들기 위해 과거에 출판 한 프로토콜을 사용하는 것은 일반적으로 구조의 혼합물로 연결됩니다. 특히, unbanded 원 섬유는 일반적으로 F했다기본 콜라겐을 만들 때 ound, 그리고 섬유 긴 간격 콜라겐을 만들 때 기본 원 섬유는 종종 참석했다. 이 새로운 절차는 거의 대부분 원하는 콜라겐 섬유 종류를 생산의 장점이 있습니다. 원하는 구조의 형성은 원자 힘 현미경을 사용하여 영상으로 확인됩니다.

기본 콜라겐 100 MM 인산에 ~ 0.3 MG / ML 콜라겐 모노머 37에서 왼쪽으로 pH를 7 100 밀리미터 KCl의 반응 혼합물 ° C 3-4 시간에 대한 명확한 ~ 67 나노 미터는 D-구간과 기본 타입 콜라겐 원 섬유를 포함하는 솔루션을 얻을 것입니다 unbanded 원 섬유없이. 200 × 배율의 광학 현미경에서 여러 원 섬유의 clumps는 일반적으로 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경 (그림 2)에서 볼 특히 때 운모 기판에 볼 수 있습니다. 전형적인 예제에서 임의의 100 × AFM의 100 μm이 검사는 일반적으로 긴 5-50의 마이크론 이상의 몇 원 섬유가 표시됩니다 (그림 3A-C). 개인, 구분 콜라겐 원 섬유는 쉽게이 단계에서 식별 할 수 있습니다. 512 × 512 픽셀이 이미지 스캔을 통해 10 × 10 μm 2 스캔 크기로 확대하면 모든 원 섬유가 밴드하는 표시 (그림 3D-F </stroNG&gt;). 정확하게 구간 주기성을 측정하기 위해서는 2 × 2 μm이 스캔 크기 (도 3g-I)로 확대하는 것이 가장 좋습니다. 주기성을 구간 것은 단순히 측정하고 여러 봉우리 나 계곡 사이의 길이 방향의 거리를 평균에 의해 결정될 수있다. AFM 소프트웨어가 허용하는 경우 또는, 1 차원 푸리에도 사용할 수 있습니다 단면 길이 방향을 따라 변환 할 수 있습니다. 그림 4는 섬유와 해당 종 방향 단면의 AFM 높이 이미지를 보여줍니다. FLS 콜라겐 1 MG / ML μ1 - 산성 당 단백질 및 30 분 동안 실온에서 왼쪽으로 물에 ~ 1 MG / ML 콜라겐 모노머의 반응 혼합물은 FLS의 콜라겐 원 섬유의 솔루션을 얻을 수 있습니다. 기본 콜라겐의 경우 관찰되는 것과 유사 원 섬유의 Clumps은 쉽게 200 광학 현미경 × m 아래에있는 운모 기판에 볼 수 있습니다agnification. 전형적인 예제에서 AFM에 의해 무작위로 100 × 100 μm이 검사는 일반적으로 적어도 몇 원 섬유를 표시합니다. 512 × 512 픽셀이 이미지 스캔 크기, 구간 주기성이 표시 10 × 더 정확하게 10 μm이 스캔 (그림 5A) 또는과 2 × 2 μm이 스캔 (그림 5B). 그림 5C로 확대하여 측정 할 수 있습니다 FLS 섬유의 길이 방향이 단면. SLS 콜라겐 2 밀리그램 / ML ATP의 반응 혼합물이와 산도 3.3 100 MM 글리신 - HCL 버퍼에서 ~ 0.5 MG / 콜라겐 모노머의 ML은 2 시간 동안 실온에서 왼쪽으로는 SLS의 콜라겐의 솔루션을 얻을 수 있습니다. 일반적으로, SLS의 crystallites은 광학 현미경으로 표시되지 않습니다. AFM은 SLS의 crystallites의 존재를 확인하기 위해 필요합니다. 전형적인 예제에서 AFM에 의해 무작위로 100 × 100 μm이 검사는 일반적으로 여러가 표시됩니다점. 10 × 10 μm 2 스캔으로 확대하는 것이 여러 SLS의 crystallites (그림 6a가) 표시됩니다. 그리고 2 × 2 μm 두 검사 (그림 6B)가 SLS의 결정자의 미세한 구조를 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> 그림 1. 콜라겐 모노머의 체외에서 형성 될 수있다 콜라겐 원 섬유의 세 가지 구조적으로 다른 형태. AFM 이미지는 모두 같은 크기 규모 (2 × 2 μm 2)에 콜라겐 모노머와 세 개의 높은 순서 콜라겐 구조를 묘사. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> 그림 2. 운모의 기본 콜라겐 원 섬유의 광학 현미경 DIC (A) 손길이 닿지 않은 및 (b) t을 thresholded하고 날카롭게로 ~ 200 × 배율의 디지털 이미지원 섬유를 강조 O. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> 운모에 대한 기본 콜라겐 원 섬유의 그림 3. AFM 이미지. 간헐적 접촉 모드 AFM 진폭 이미지가 표시됩니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> 그림 4. () 0.5 × 1 μm이 간헐적 접촉 모드 AFM 높이 이미지 (수직 규모 = 100 나노 미터) 및 기본 콜라겐 섬유의 (b)는 길이 방향 단면도. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> 그림 5. 운모의 FLS의 콜라겐 원 섬유의 AFM 이미지. () 10 × 10 μm이 접촉 모드 AFM 편향 이미지, (B) 2 × 2 μm이 접촉 모드 AFM 편향 이미지와 (C)의 길이 방향FLS 콜라겐 섬유의 단면. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> 그림 6. 운모에 대한 SLS의 콜라겐의 AFM 이미지. 간헐적 접촉 모드 AFM 진폭 이미지가 표시됩니다.

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In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

간편하고 재현 절차는 일반적인 상업적으로 이용 가능한 유형 I 콜라겐 모노머에서 세 구조적으로 구분 콜라겐 어셈블리를 만들기위한 설명되어 있습니다. 기본 유형은 섬유 긴 간격 또는 segmental 긴 간격 콜라겐은 300 nm의 긴 1.4 나노 미터 직경 단량체 빌딩 블록이 노출되는에 조건을 변화하여 구성 할 수 있습니다.

기본, 섬유 긴 간격 및 Segmental 긴 간격 콜라겐의 체외 합성에

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

13.6K 조회수.  University of Toronto. 간편하고 재현 절차는 일반적인 상업적으로 이용 가능한 유형 I 콜라겐 모노머에서 세 구조적으로 구분 콜라겐 어셈블리를 만들기위한 설명되어 있습니다. 기본 유형은 섬유 긴 간격 또는 segmental 긴 간격 콜라겐은 300 nm의 긴 1.4 나노 미터 직경 단량체 빌딩 블록이 노출되는에 조건을 변화하여 구성 할 수 있습니다.

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Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Polycaprolactone, 엘라스틴, 콜라겐을 사용하여 네이티브 아티 건축을 모방하기 위해 트라이 - 계층 Electrospinning : 예비 연구

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

연구

생체공학

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12. Although tobacco tars and related products in the particle phase of cigarette smoke are major causes of carcinogenic and mutagenic related diseases, cigarette smoke contains significant amounts of free radicals that are also considered as an important group of carcinogens9,10. Free radicals attack cell constituents by damaging protein structure, lipids and DNA sequences and increase the risks of developing various types of cancers. Inhaled radicals produce adducts that contribute to many of the negative health effects of tobacco smoke in the lung3. Studies have been conducted to reduce free radicals in cigarette smoke to decrease risks of the smoking-induced damage. It has been reported that haemoglobin and heme-containing compounds could partially scavenge nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke4. A 'bio-filter' consisted of haemoglobin and activated carbon was used to scavenge the free radicals and to remove up to 90% of the free radicals from cigarette smoke14. However, due to the cost-ineffectiveness, it has not been successfully commercialized. Another study showed good scavenging efficiency of shikonin, a component of Chinese herbal medicine8. In the present study, we report a protocol for introducing common natural antioxidant extracts into the cigarette filter for scavenging gas phase free radicals in cigarette smoke and measurement of the scavenge effect on gas phase free radicals in mainstream cigarette smoke (MCS) using spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spectroscopy1,2,14. We showed high scavenging capacity of lycopene and grape seed extract which could point to their future application in cigarette filters. An important advantage of these prospective scavengers is that they can be obtained in large quantities from byproducts of tomato or wine industry respectively11,13

Spin-trapping ESR spectroscopy was used to study the effect of plant antioxidants lycopene, pycnogenol and grape seed extract on scavenging gas-phase free radicals in cigarette smoke.

메인 스트림 담배 연기에 자유 래디 칼을 감지하고 가스 단계 청소를위한 프로토콜

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

현장 압축 하중과 뼈, 치주 인대 치아 섬유 공동의 상관적인 비 침습 이미징

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

마이크로 실리콘 캔틸레버의 이용은 세포 수축 기능을 평가하기 위해<em&gt; 체외</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

열 Nanoimprinting 기술과 인간의 내 피 식민지 형성 세포의 응답의 심사에 의해 그라데이션 Nanopattern의 제조

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

전체 게놈 DNA 분석을 위한 매우 긴 읽기 시퀀싱

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...