이 작품은 AMK 최에 NIH 부여 P01의 HL108801, R01 - HL60234, R01 - HL55330, R01-HL079904에 의해 지원되었다. S. Ryter는 난봉꾼 호흡기 연구소에서 급여 지원을 받았다.

참고 : 브리검 여성 병원 / 하버드 의과 대학 지역의 기관 동물 관리 및 사용위원회는 다음과 같은 절차를 승인했다. 1. 맹장 내고와 빵꾸 같은 배경의 마우스를 사용합니다 (C57BL / 6), 8-10 주 된 남성. 암컷 생쥐는 패혈증에 의한 치사율에 대한 남성보다 더 강한입니다. 팔주 세 이상 마우스는 CLP 후 생존의 측면에서 젊은 쥐보다 변수 결과를 생산하고 있습니다. 약 N은 비교 그룹에 10 마우스는 생존 분석을 위해 사용되어야한다 =. N = 3-5 마우스는 autophagy에 분석 실험에 적합하다. <ol><li> 설치류 수술에 적합해야한다 멸균 작은 수술기구 (즉 메스, 가위 무딘 해부 집게를) 사용합니다. </li><li> 마취 혼합물을 제조 : PBS의 7.95 mL에 자일 라진 (AnaSed 주사 100 ㎎ / ㎖)의 150 μL와 케타민 (Ketaset 700 μl를 추가 &#160; CIII, 100 ㎎ / mL). </li><li> 절차를 수행하는 동안 무균 조건을 보장하기 위해, 장갑, 얼굴 마스크와 수술 가운을 착용한다. </li><li> 동물의 무게를. intraperitonally 주입을 마취 (IP) μL (g에서 10 배의 체중)의 투여 량에서 3 단계에서 언급 한 혼합물. 예를 들어, 22g 무게 마우스의 마취 혼합물의 10x22 = 220 μl를 관리 할 수​​ 있습니다. 따라서, 자일 라진 및 케타민의 최종 투여 량은 17 ~ 80 ㎎ / kg 체중, 각각이다. 그 마취가 적절한 지 확인, 극한의 더 굴곡 발가락 핀치 이후에 생산 될 수 없습니다 참고 :. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 사용합니다. </li><li> 그들의 뒤에 깨끗한 작업 표면에 동물을 배치합니다. 꼬리와 뒷발은 수사관을 지향하고 있습니다. . 알코올 (70 %의 EtOH 용액)을 참고하여, 복부의 피부를 소독 : 외과 분야는 완전히 접촉을 통해 상처의 오염을 피하기 위하여, 면도해야모피. 또한, 최적, 순환 온수 패드는 수술 중 마취 된 쥐의 normothermia을 유지하는 데 사용되어야한다. </li><li> 메스를 사용함으로써, 작은 피부 절개 길이 방향과 평행하게 약 1cm은 정중선하는 왼쪽. 복강에 아직 침투하지 마십시오. 초기 절개를 확장하는 작은 가위를 사용합니다. </li><li> 복부 근육을 확인하고 복강에 액세스 할을 해부하다. </li><li> 무딘 해부 집게를 사용하여, 맹장을 확인하고 복강 밖으로 이동합니다. (이것은 치명적인 출혈로 이어질 수) mesenterial 혈관이 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 중간 등급 패혈증을 달성하기 위해 맹장의 60 %를 결찰. 같거나 저급 패혈증 맹장 결과의 25 % 미만을 결찰 반면 동일하거나 맹장의 75 % 이상을 결찰하는 것은 일반적으로 고품위 패혈증 초래한다. 회맹 (이것은 장 연속성을 차단할 수) 결찰하지 않도록주의하십시오. </li><li> 를 사용함으로써21 G 바늘, 결찰 근처에 한 관통 한 구멍 (2 개 구멍)에 의해 맹장 천공. 천공 방향은 장간막에서 맹장의 안티 장간막 측에 있어야한다. mesenterial 혈관에 구멍을하지 않도록주의. </li><li> 바늘을 제거합니다. 가볍게 두 개의 구멍을 통해 개방성을 확인하기 위하여 맹장 결찰 짤; 배설물의 소량 만이 그들을 통해 압출한다. </li><li> 복강에 결찰 및 천공 맹장 이동합니다. 참고 : 가짜 마우스의 경우, 1.10 ~ 1.12 단계를 건너 뜁니다. </li><li> 복부 근육을 닫 바늘을 절단 실크 봉합 수술에게 6-0를 사용합니다. 복부 피부를 닫 바늘을 절단 실크 봉합 수술에게 6-0를 사용합니다. </li><li> 열 및 절차를 수행하는 동안 손실 된 수분을 대체 할 예비 가온 1 ML (37 ° C) 생리 식염수의 IP를 주입한다. 자신의 소생 할 때까지 가열 램프 아래에 마우스를 놓고 참고 :. 최적, 안전 온난화 장치 (SU순환 온수 패드) 등 CH 대신 가열 램프를 사용할 수있다. </li><li> 수술 후 진통을 달성하기 위해 (. 0.05 ㎎ / ㎏ 체중 SC)의 buprenorphin 주입 참고 :.은 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물이 방치 할 수 없습니다. 수술 적 치료를 겪은 동물이 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 반환 할 수 없습니다. </li><li> 음식과 물에 대한 무제한 액세스를 다시 자신의 새장에있는 동물을 놓습니다. 그들은 (예 : 터치시 이동 장애 또는 청색증 등의 임상 증상으로 표시) 빈사가되면 마우스는 안락사됩니다. 그 전에 안락사에 죽는 것을 피하기 위해 마우스마다 4 시간을 확인합니다. </li></ol> 2. 조직 수확 및 고정 <ol><li> 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 솔루션을 준비 889 ml의 PBS는 37 % PFA 111 ML을 추가합니다. </li><li> CO 2에 의한 마취 또는 케타민 / 자일 라진의 하나를 사용하여 마우스를 희생높은 복용량에서 olution. </li><li> 깨끗한 작업 표면에 마우스를 고정시킨다. 그것을 소독 70 %의 EtOH 용액으로 복부와 가슴 피부를 스프레이. </li><li> 복부 및 흉부 피부뿐만 아니라 기관의 지역을 커버하는 피부를 제거하는 메스와 작은 가위를 사용합니다. </li><li> 그 주변의 조직 (근육과 결합 조직)을 제거하여기도를 알 수있다. </li><li> 기관의 주위에 (바늘을 절단하지 않고) 봉합사를 놓습니다. 아직 조이지 마십시오. </li><li> &#39;삽관&#39;기관으로 작은 말초 정맥 카테터 (20 G)를 사용합니다. 기관의 눈물을 피하기 위해 카테터 삽입시주의해야합니다. 기관의 가장 큰 직경이 바로 윤상 연골 아래에 있습니다. </li><li> 기관 / 카테터 주위에 봉합사를 조입니다. 기관에 카테터 만 플라스틱 캐 뉼러를 떠나 바늘을 제거합니다. 니들은 플라스틱 캐 뉼러를 삽입하기위한 가이드 선으로 만 제공. </li><li> 기관에 플라스틱 캐 뉼러를 확보 한 후, 일을 절단전자, 복부의 근육, 배를 열고 다이어프램을 보여준다. </li><li> 바늘을 사용하여, 기흉 (흉강으로 공기 즉, 삽입)을 생성하기 위해 격막을 천공. 폐는 축소되어야한다. </li><li> 작은 가위를 사용하여, 가슴 뼈 (흉골)을 따라 절단 다이아 프램을 제거, 갈비뼈를 제거하고 심장과 폐를 알 수있다. </li><li> 기관에 삽입 된 플라스틱 캐 뉼러를 통해, 30cm의 H 2 O의 압력 하에서 포름 알데히드 용액으로 폐를 고정합니다. </li><li> 폐를 제거하고 24 시간 이후에 70 %의 EtOH로 솔루션에 대한 4 % PFA에 넣지 처리까지. </li><li> 심장, 간, 신장을 식별하고 제거 할 수 있습니다. 동일한 방식으로, 처리 될 때까지 70 %의 EtOH에이어서 용액을 24 시간 동안 4 % PFA로 그들을 배치. </li></ol> 3. GFP 마우스 및 GFP의 슬라이드보기 <ol><li> 1 단계, 수술 후 절차에 따라 GFP-LC3 마우스에 CLP 및 가짜 수술을발 프로토콜의 단계 2에서 설명한 바와 같이. </li><li> 파라핀 조직 (즉, 폐, 심장, 간, 신장)을 포함하고 직렬 5 μm의 섹션에서 그들을 잘라. </li><li> 파라핀이 녹아 조직이 반투명 나타날 때까지 30 ~ 60 분 동안 60 ° C에서 배양하면 GFP 염색에 대 한 준비. </li><li> 자일 렌, 크실렌 대체,로 5 분 크실렌 1, 자일 렌 2, 자일 렌 (3)의 표준 등급 시리즈 Deparaffinize 다음 등급의 EtOH 시리즈의 3 분의 배양 : 후 100 %, 95 % 75 % 및 증류수에 헹군다. 참고 : 탈 파라핀 샘플 배경을 증가 조직의 건조를 방지 한. </li><li> 10-20 분 동안 레인지 작동하여, 구연산 완충액 (10 mM의 시트르산 나트륨 산, 0.05 % 트윈 20, pH를 6.0)를 사용하여 항원 검색을 수행. 조직의 건조를 방지하기 위해 주기적으로 버퍼를 대체 할주의하십시오. </li><li> 솔루션은 항원 검색을 완료하는 벤치에 20 분 동안 식히십시오. </li><li> PBS로 2 배를 씻으십시오. 여분의 버퍼와 육 차원 속의를 제거nsfer 슬라이드 상자 또는 건조를 방지하기 위해 다른 가습 실에서 수평 위치로 랙에서 슬라이드. </li><li> 10 % 정상 당나귀 혈청 (도 5 % 소 혈청 알부민, 또는 차 항체가 생성되는 동물 바람직 혈청) PBS에 실온에서 45 ~ 60 분을 차단합니다. </li><li> 가습 실에서 4 ° C에서 하룻밤 PBS에서 1:100 희석에서 기본 GFP 항체에 샘플을 품어. 부드럽게 조직과 균일 한 접촉을 촉진하고 증발을 방지하는 항체와 조직을 통해 파라 필름의 작은 조각을 적용합니다. 참고 : 나머지 단계는 실온에서 수행된다. </li><li> 초과 기본 항체를 제거하는 PBS로 5 배를 씻으십시오. 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 PBS에있는 이차 항체 1:500-1:1,000에 품어. </li><li> 과잉 차 항체를 제거하는 PBS로 5 배를 씻으십시오. 원하는 경우,이 단계에서의 슬라이드를 counterstain. </li><li> 형광 차 항체를 사용하는 경우, 70 % EtOH로 F에서 0.1 % 수단 검정을 품어또는 15 ~ 20 분은 형광도를 줄일 수 있습니다. 조직 주위에서 초과 수단 검정을 닦아내고 20 분 동안 PBS로 5 배 씻는다. </li><li> coverslip에 샘플을 장착 및 설치 솔루션으로 설정 될 때까지, 수평으로 저장합니다. </li></ol> 4. 대체 프로토콜 : GFP-LC3의 직접 검출 <ol><li> (50 / 50) V / 10월 PBS V의 ~ 500 mL를 Cannulate 및 팽창 폐. </li><li> cryomold의 바닥에의 OCT 소량을 넣어 OCT에서 포함 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 금형 해부 폐 단지를 배치합니다. </li><li> 메틸 부탄은 드라이 아이스를 사용하여 냉장을 통해 천천히 동결. </li><li> 조직이 완전히 덮여 얼어 될 때까지 더 OCT를 추가합니다. -80 ° C에서 드라이 아이스와 저장소에 보관 </li><li> cryomicrotome를 사용하여, 빛의 섹션을 보호하는 5 ~ 10 μm의 두께 부분을 잘라. 저장소 섹션 및 -80 ° C에서 나머지 조직 </li><li> , 이미지에 대한 슬라이드를 준비 냉동고에서 섹션을 제거하고 즉시 건조를 방지하기 위해 PBS의 드롭을 적용하려면. </li><li> 4 % PFA로 30 분 동안 수정. PBS로 세척. </li><li> 10 분 동안 DAPI / Hoescht을 적용합니다. PBS로 3 회 세척한다. </li><li> coverslip에 샘플을 장착 및 설치 솔루션으로 설정 될 때까지, 수평으로 저장합니다. </li><li> 표면 형광 또는 공 초점 현미경을 사용하여 이미지. 최대 1 개월 4 ° C에서 보관 샘플. </li></ol> 5. 전자 현미경에 대한 조직의 준비 <ol><li> 고정 약 1mm의 큐브로 조직을 잘라. </li><li> 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼, pH를 7.4에서 2 %의 포름 알데히드, 2.5 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)의 조직을 고정합니다. </li><li> 1 ~ 2 시간 동안 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼로 세척. 참고 : 고정 된 조직을 4 ℃에서 0.1 M 나트륨 cacodylate에 저장 될 수있다 </li><li> 1 시간 동안 0.2 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 1 % 오스뮴에 수정 프로그램을 게시합니다. </li><li> 10 분 배를위한 0.2 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 씻어. </li><li> 70 % EtOH로, 20 분 배에 탈수. 90 %의 EtOH, 10 분 2X에서 탈수. 100 %의 EtOH에 탈수,20 분의 2 배. </li><li> 10 분 2X 용 프로필렌 옥사이드 (에폭시 프로판)와 함께 배양한다. </li><li> 1 시간 프로필렌 옥사이드 / 에폭시 수지 혼합물 (50:50)으로 배양한다. 에폭시 수지의 혼합물이다 : 24g 한천 100 수지, 도데 세닐 숙신산 무수물 13g, 13g 및 무수 메틸 나 1ml의 N-벤질 디메틸 아민. 나무 주걱을 사용하여 일회용 비이커에 철저하게 섞는다. </li><li> 세척제 유리 병에 에폭시 수지 하룻밤 (이 남아있는 프로필렌 옥사이드가 증발 할 수 있습니다)에 품어. </li><li> 새로 제조 된 수지로 표시 캡슐에 포함. 48 시간 동안 60 ° C에서 중합. </li><li> 전자 현미경 필름 상에 80 또는 60 kV의에서 투과형 전자 현미경을 사용하여 사진 조직 섹션. 사진 용지에 이미지를 인쇄하거나 디지털 미디어를 저장합니다. </li><li> 핵을 포함하는 손상 세포에 autophagosome 형성을 분석합니다. 낮은 전력 필드 (E. g. 2,000-4,000 X)는 유핵 세포를 식별하기 위해 사용될 수있다. 일반적으로 6,800-10,000 X 이미지는 일에 사용됩니다autophagosome 정량화입니다. 적절한 통계적 표현을위한 15 ~ 30 필드에서 단위 면적당 autophagosomes를 계산합니다. Autophagosomes 늦게 단계 autophogosomes이 채워진 액포를 닮은 이중 막 구조를 가지고. </li></ol>

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저자는 선언 할 경쟁 금융의 이익이 없다

CLP의 주요 장점은 연구원이 (저에 대한 중간 및 높은 수준에서 즉) 다른 심각도의 패혈증을 조사 할 수 있다는 것입니다. 유도 패혈증의 심각도는 맹장 결찰의 길이 (가장 중요한 결정 인자)에 의해 영향을받는, 천자 사용 바늘의 크기와 구멍의 수는 15을 수행 하였다. 또한, 마우스의 피로와 성별은 패혈증의 정도에 영향을 미칠 수 있으며, 몇 가지 계통이 다른 사람보다 더 민감하고...

패혈증, 감염에 대한 전신 염증 반응은 비판적으로 아픈 환자 1에서 사망의 주요 원인을 나타냅니다. 자주 polymicrobial 패혈증에 이르는 복강 내 감염, 최대 60 % 2의 상당한 사망률이있는, 패혈증 케이스의 20 %를 차지하고있다. 패혈증 관련 사망률은 주로 다음 장기 부전 3,4에 다 장기 부전의 결과. 이 질병의 발병 메커니즘에 추가적인 조사가 급하게 신규하고보다 효과적인 치료법의 개발을 촉진하기 위해 필요하다. 맹장 결찰술 및 천자 (CLP) 방법은 생체 내에서 모델링 패혈증 일반적으로 사용되는 절차입니다. 궁극적으로 맹장 박테리아 가득으로, polymicrobial 복막염에서의 천자 결과, 혈액 (균혈증)에 박테리아의 전위, 패 혈성 쇼크, 다 장기 부전 및 사망 5. 그것은 일반적으로 CLP 임상 반영 접수더 정확하게 설치류에 독소 또는 정제 된 박테리아의 주사와 같은 이전 기술보다 현실 따라서, CLP는 패혈증의 발병 기전의 조사, 따라서 실험 유도 6 (하지 제한없이이기는하지만) 황금 표준으로 간주된다. 이 논문에서, 우리는 패혈증의 발병 메커니즘은 autophagy에 포함 여부를 평가하기위한 프로토콜을 설명합니다. autophagy에, 진화 적으로 보존 된 휴대 과정은 손상된 단백질과 같은 미토콘드리아 같은 세포 내 소기관의 턴 오버를 촉진하고 세균 7,8 등의 세포 내 병원균의 정리에 중요한 역할을합니다. autophagy를하는 동안, 세포 내 단백질이나 세포 소기관은 이후 저하 9의 리소좀에 전달 autophagosomes라는 이중 막 결합 소포로 압수됩니다. 단백질의 수는 autophagy에 관련 유전자의 포유 동물 동족체 (ATG)으로 식별 된,원래는 autophagy의 과정을 조절하는 효모에서 발견. LC3B-I (자유 양식)에서 미세 소관 관련 단백질 1 경쇄 3B (LC3B) (Atg8의 상동)의 변환 (포스파티딜 에탄올 아민 - 복합 양식)-II를 LC3B하려면 autophagosome 형성 9에있는 중요한 단계를 나타냅니다. Autophagic 장애는 노화와 암, 신경 퇴행성 질환 (10)을 포함하여 인간의 질병과 연관되어 있습니다. 또한, autophagy에는 면역 세포 (8)에 의해 항원 프레 젠 테이션, 림프구 개발과 사이토 카인의 분비와 같은 타고난 및 적응 면역에 영향을 미칩니다. 따라서, autophagy에 또한 감염에 전신 염증 반응 (즉, 패혈증)에 역할을 할 수 있다는 합리적인 것 같다. 지금까지 여러 가지 방법이 생체 내에서 조직 손상에 autophagy에의 역할을 평가하기 위해 기술되었다. 이들은 녹색 형광 단백질 (GFP) LC3 표현 생쥐의 사용과 자동의 정량화를 포함전자 현미경으로 조직 된 phagosomes는 (이 두 가지 방법은이 논문에서 설명합니다). 추가 방법은 조직 균질 autophagic 단백질 발현의 정량화하고, (다른 곳에서 설명) autophagic 플럭스의 분석 11 ~ 13 있습니다. 이 검토의 목적은 실험 패혈증의 컨텍스트에서 생체 내 autophagy에 대한 평가를 위해 현재의 프로토콜을 제공하는 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >GFP-LC3 Transgenic Mice</td>
			<td >Riken (Japan)</td>
			<td >RBRC00806</td>
			<td >GFP-LC3#53</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >568-0606</td>
			<td>Xylazine HCl Injection Vet</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >995-2949</td>
			<td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A405-20</td>
			<td>Histology Grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A407-1</td>
			<td>For Sterilizatiion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >silk surgical sutures 6-0</td>
			<td >Owens &#38; Minor</td>
			<td >2300-0078OG, 017624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >buprenorphine-HCl</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >614-5157</td>
			<td>Buprenex Ampules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde (37%) solution</td>
			<td >JT Baker</td>
			<td >S898-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >xylenes</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP monoclonal antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G10362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoescht</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>944403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OCT</td>
			<td >VWR scientific</td>
			<td >25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan Black</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-203760</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate</td>
			<td >Electron microscopy Sciences</td>
			<td>15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >propylene oxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>240397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar 100 resin</td>
			<td >Agar scientific</td>
			<td > R1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>46346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >methylnadic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-benzyldimethylamine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>185582</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice

실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 polymicrobial 패혈증 발생 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. 여기서, 프로토콜 CLP 기술을 사용하여 마우스에 다양한 중증도의 패혈증을 유발하도록 제공된다. autophagy에 스트레스와 병원균 침입에 대한 근본적인 조직의 반응이다. 실험 패혈증의 맥락에서 생체 내에서 autophagy에를 평가하기 위해 현재의 두 프로토콜도 여기에 표시됩니다. (I), 녹색 형광 단백질 (GFP) - LC3 융합 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스는 CLP을 실시한다. GFP 신호 (puncta에)의 현지화 강화는 면역 또는 공 촛점 분석에 의해 하나 정량으로, 향상된 autophagosome 형성을 감지하고, autophagy에 경로의 따라서 변경 활성화하는 데 사용할 수 있습니다. (autophagy에 자극 마커 등) 단위 조직 면적당 (II) 향상된 autophagic 액포 (autophagosome) 형성은 전자 현미경을 사용하여 정량화 될 수있다. 패혈증 autophagic 반응의 연구는 중요한 샘플입니다조직이 감염에 반응하는 메커니즘을 이해 onent. 이 지역에있는 연구 결과는 궁극적 중요한 치료 의학의 주요 문제를 나타내는 패혈증의 발병 기전을 이해에 기여할 수있다.

균혈증은 초기 CLP-유도 패혈증 14 후 6 시간으로 마우스에 존재한다. (오한, tachypnoea 및 손상 모터 활동 포함) 패혈증의 임상 증상은 수술 후 약 12​​ 시간으로 나타납니다. 마우스는 복막염의 유도 후 약 18 시간에서 죽기 시작 CLP를 실시. 더 심한 더 증가 패혈증은 ​​치사율 (15)이다. CLP 후 7 일에서 60 %의 사망률 중급 패혈증 결과 (이 시간 제한을 넘어, 사망자가 예상되지는) 동?...

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Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. CLP - 유도 패혈증의 컨텍스트에서 생체에 autophagy를 평가하는 현재의 프로토콜이 여기에 제시된다 : (GFP) - LC3 마우스를 사용 autophagy에 측정을위한 프로토콜, 및 전자 현미경에 의해 autophagosome 형성을 측정하기위한 프로토콜.

맹장 결찰 및 마우스에서 autophagy에 공부를 모델로 패혈증 관통 유도

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

cecal-ligation-puncture-induced-sepsis-as-model-to-study-autophagy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.1K 조회수.  Brigham and Women's Hospital.  실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. CLP - 유도 패혈증의 컨텍스트에서 생체에 autophagy를 평가하는 현재의 프로토콜이 여기에 제시된다 : (GFP) - LC3 마우스를 사용 autophagy에 측정을위한 프로토콜, 및 전자 현미경에 의해 autophagosome 형성을 측정하기위한 프로토콜. 

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Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for establishing new therapeutic approaches in this field. Therefore, animal models are required that are able to closely mimic the human disease and also sufficiently deal with scientific questions. The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. In this model, a small stent is surgically inserted into the ascending colon of mice or rats leading to a continuous leakage of intestinal bacteria into the peritoneal cavity. The procedure results in peritonitis, systemic bacteraemia, organ infection by gut bacteria, and systemic but also local release of several pro- and anti-inflammatory cytokines. The lethality of CASP can be controlled by the diameter of the inserted stent. A variant of this model, the so-called CASP with intervention (CASPI), raises opportunity to remove the septic focus by a second operation according to common procedures in clinical practice. CASP is an easily learnable and highly reproducible model that closely mimics the clinical course of abdominal sepsis. It leads way to study on questions in several scientific fields e.g. immunology, infectiology, or surgery.

Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. This article describes the surgical procedure of CASP. The CASP model and its variants allow the systematic investigation of various problems concerning the subject of sepsis.

콜론은 (CASP) 복막염 스텐트 Ascendens - Polymicrobial 복부 패혈증에 대한 표준 모델

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

연구

면역학 및 감염병학

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

사용<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 모델 생물로 공부하기<em&gt; 레지오넬라 뉴모 필라</em&gt; 감염

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

마우스에 동종 CD4 T 세포 반응을 연구하기 위해 테일 피부 이식

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

신생아 Polymicrobial 패 혈 증에 대 한 제어 마우스 모델

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

세칼 결찰 및 천자 및 비강 내 감염 이중 모델 패혈증 유발 면역 억제 설계

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

결핵 균복합체를 연구하기 위한 감염 모델로 무척추동물 갤러리아 멜로넬라 사용

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...