이 작품은 건강의 펜실베니아 부서에서 교부금에 의해 지원되었다. 박사 미겔 가르시아 토스 카노이 연구 중에 알폰소 마틴 Escudero 재단에 의해 후원 템플 대학에서 박사 후 연구원였다. 우리는 비디오의 제작을위한 Iliya Yordanov 케빈 Kotredes 감사드립니다.

1. 인간 패혈증의 마우스 모델로 Cecal 내고 주사 이 절차에 대한 C57BL / 6 마​​우스 (이전 7-9주)이 사용됩니다. <ol><li> intraperitoneally에게 1시 1분 케타민 (75mg/kg)과 xylazine (15mg/kg)의 솔루션을 주입하여 마우스를 마취. 참고로, 20g 무게 마우스로 1시 1분 솔루션을 30 μl를 주입. 또는, 마우스는 마취 기화기를 사용하여 흡입 isoflurane과 anesthetized 수 있습니다. </li><li> 마우스의 복부를 면도하고는 70 % 알콜 면봉 (아래 그림의 순서대로 1 번)로 닦고 다음에 첫번째 신청 betadine 솔루션으로 영역을 소독. Chlorhexidine는 대체 소독제로 사용할 수 있습니다. 옵션 : 무균 드레이프가 지역 청소 유지하기 위해 사용할 수 있습니다. </li><li> 무균 조건에서 1-2센티미터 정중선의 개복술 연습과 인접한 대장 (2 3)과 맹장을 폭로. </li><li> 이게 맹장은 단단히 6.0 실크 봉합사 (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon)과 출혈도 잡았있는 ileo - cecal 밸브 아래의 바닥에, 같은에 천공 회 19 게이지 바늘 (4 및 5)와 함께 이게 맹장의 측면. 내고 지점이게 맹장의 말초 월말부터의 거리로 정의 출혈도 잡았이게 맹장의 길이가 심각 노출된 정도를 확인됩니다. ≤ 1cm의 거리 중순 - 투 - 낮은 등급 패혈증을 생산하면서&gt; 1cm의 거리는 고급 패혈증을 생산하고 있습니다. 또한 여기에 표시된 cecal 천공 방식을 사용하면 (이게 맹장을 통해 바늘을 소개)를 통해 주사 기법을 통해 표준과는 다릅니다. 두 방법은 동일한 패혈증의 결과를 안정적으로 생산하고 있습니다. 그러나, 관통 기법 중 하나 단점은이게 맹장이 짜낸 때 압출 대소변의 양을 조절 용이하지 않는다는 것입니다. </li><li> 이게 맹장은 부드럽게 천공 사이트 (6)에서 대소변의 작은 금액을 압출 성형하는 압착합니다. 이게 맹장은 복막 캐비티에 반환되고 복막은 6.0 실크 봉합과 함께 닫힙니다. (7). </li><li> 피부가 목표 7mm 클립 (RS - 9258, Roboz 외과 용구) 또는 미셸 상처 클립 (7mm, RS - 9270) (8)와 함께 닫힙니다. </li><li> subcutaneously 25G 바늘을 사용하여 미리 예열 0.9 % 생리 식염수 1 ML 주입하여 쥐를 소생. 이 유체 인공 호흡 측정 패혈증의 hyperdynamic 단계를 유도합니다. 이 중요한 단계는 토론 섹션에서 추가로 설명합니다. </li><li> 옵션 : subcutaneously 주사 buprenorphine (0.05mg / kg의 체중) 또는 게시 수술 진통제에 대한 tramadol (20mg/kg의 체중). 이러한 약물은 호흡과 운동을 억제 수 있습니다 통보 이러한 효과는 패혈증의 징후 것으로 잘못 이해할 수 있습니다. </li><li> 동물 손난로 일시적으로 배치하거나 그들이 마취에서 회복까지 또는 150W의 적외선 가열 램프에 노출 케이지 즉시 반환됩니다. 복구 시간은 30 분 1 시간 거리에 있습니다. </li><li> 음식과 새장 바닥에 놓여 물 (히드로겔)에 무료로 액세스할 수 있습니다. </li><li> 생쥐 1-2주 위해 생존을 위해 매 12 시간 감시하거나 다른 매개 변수의 분석에 대해 서로 다른 시간 지점에서 euthanized 있습니다. </li></ol> 실험 설계를위한 제어로, 가짜 동물 내고 주사없이 개복술 기술을 수행합니다. 수술 마우스 후 6 ~ 12 시간 기면되어 발열, piloerection, 설사, huddling, 그리고 불안감을 개발할 것이다; 패혈증의 증상. 매우 심한 패혈증과 마우스는 거의 전 죽음으로 이동하고 체온의 극적인 감소 전시하실 수 있습니다. 이 단계에서 마우스 연장 통증과 고통을 피하기 위해 euthanized해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig0.jpg" alt="그림 0" /> 2. 가장 일반적인 분석 매개 변수 프로 시저의 결과를 평가하는 다른 매개 변수는 기관, 세포 추출물이나 체액의 분석하실 수 있습니다. 샘플 3 시간에서 수술 후 일주일 다른 시간 지점에서 수령하실 수 있습니다. <ol><li> 쥐 생존. </li><li> 혈청, 복막 캐비티 및 장기 추출물의 크린 시토킨 및 chemokines. <ol><li> 인터루킨 - 6 : 생산 monocytes, 돌기 세포, macrophages, B 세포, T 세포, granulocytes, 마스트 세포와 많은 세포 유형별로 공개했다. 그것은 급성기 반응과 염증에 중요한 역할을합니다. </li><li> 종양 괴사 인자 - α가 : 염증과 apoptosis에 중심 역할을 Pleiotrophic 시토킨. monocytes, macrophages, neutrophils, 돌기 세포 및 섬유아 세포에 의해 제작. </li><li> nterleukin - 1β : monocytes, NK 세포, 돌기 세포, B 세포 및 T 세포에 의해 제작. 발열과 급성 위상의 단백질 합성을 유도. </li><li> 인터루킨 10 : phagocytic 이해와 Th2 반응을 부여하지만 antig 억제EN 프레 젠 테이션과 Th1 반응 전염증성. </li><li> 인터루킨 10 : phagocytic 이해와 Th2 반응을 부여하지만 항원 프레 젠 테이션과 Th1 전염증성 응답을 표시하지 않습니다. </li><li> 단핵구 chemotactic 단백질 1 (도 CCL2라고도 함) : 신병의 monocytes, 메모리 T 세포 및 조직 손상과 감염의 사이트에 돌기 세포. </li><li> KC (CXCL1) : macrophages 및 내피 세포에 의해 제작. 마우스 KC는 강력한 호중구의 유인 및 활성입니다. </li><li> RANTES : 단핵구 chemoattractant. 그것은 unstimulated CD4을 chemoattract 수 + / CD45RO + 메모리 T 세포와 CD4 + 및 자극 나의 적 및 메모리 phenotypes와 CD8 + T 세포. </li><li> 인터페론 - γ : Th1 세포, 세포 독성 T 세포, 돌기 세포 자연 킬러 (NK) 세포에 의해 분비. 항원 프레 젠 테이션과 macrophages에 lytic 활동을 증가하고 Th2 세포 활동을 억제. 백혈구 마이 그 레이션에 필요한 접착력 및 바인딩을 촉진하고 북한 세포 활동을 추진하고 있습니다. </li><li> 높은 이동성 그룹 B - 1 단백질 : monocytes에 핵 인자 카파 B 활성이 패혈증의 후반 단계에 전염증성 중재자의 석방을 활성화, 사전 glycation 엔드 제품 (분노)의 세포 수용체에 바인딩하는 것입니다. </li></ol></li><li> 호중구 침투의 조치로 장기 Myeloperoxidase 결정. Myeloperoxidase가 (MPO) 호중구 granulocytes에서 가장 다량으로 존재 퍼옥시데이즈 효소이다. 그것은 호중구의 azurophilic 과립에 저장된 lysosomal 단백질이다. MPO는 고름과 점액의 일부 형태로 neutrophils 풍부한 분비물에의 녹색 색상을 일으키는 헴 안료을 가지고 있습니다. </li><li> 박테리아는 밀리리터 당 단위를 형성 식민지의 숫자로, 기관 및 혈액 스트림에서 측정을로드합니다. </li></ol> 3. 대표 결과 CLP 절차는 처음 C57BL / 6 마​​우스 변형에서 수행되었다. 우리는 그림 1과 2와 같이 바늘의 결합과 두께의 길이를 변경하여 패혈증의 심각을 조절하는 몇 가지 매개 변수를 테스트했습니다. 이 두 요인 중 결합의 길이는 %의 생존을 변경하기 위해 바늘의 두께보다 더 효과적인 것 같습니다. 마찬가지로 ≤ 1cm의 결합을 가지고 생쥐에 비해 100 % 사망률의 증가 이상으로 내고 1cm의 길이를 증가, 그림 1에 전달 표시됩니다. 바늘의 두께를 늘리면도 두 구멍있는 55 % (19G 바늘을 사용) 100 % (22G 바늘을 사용)에서 %의 생존을 감소. 우리는 또한 다른 마우스 종자는 CLP - 유도된 패혈증 비슷하거나 별개의 자화율를 표시하는지 여부를 확인하기 위해 C57BL / 6 생쥐에 129SvJ CLP의 효과를 테스트. 그림 같은 조건 하에서 129SvJ 쥐가 증가 %의 사망률에 표시된 C57BL / 6보다 감염에 더 취약 있다고 3 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 동물 생존에이게 맹장의 결합 길이의 효과. CLP는 C57BL / cecal 내고 두 가지 길이를 사용하여 6 생쥐에서 수행되었다. 이 하나의 매개 변수는 크게 1cm 약의 결합 영역을 가지고 동물의 그룹과 비교할 때보다 3 일 안에 사망 1cm 이상 내고 면적 그룹에있는 동물의 모든 이후 동물의 생존에 영향을 미칩니다. (N = 8). <img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 생존에 바늘 두께의 영향. CLP는 C57BL / 두 개의 서로 다른 바늘 크기, 19G와 22G를 사용하여 6 생쥐에서 수행되었다. 19G 바늘을 사용하여 뇌를이게 맹장와 마우스는 55~60%의 생존을 보여주었다. 그들이 처음 3-4일 동안 염증의 전형적인 증상을 경험하지만 반대로, 22G 바늘을 사용하여 뇌를이게 맹장과 마우스는 100 % 생존을 보여주었다, 이것은 (n은 = 8) 4 일 후에 사라 졌어요. <img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 두 개의 다른 마우스 변종 사이의 패혈증의 자화율 비교. CLP 모델이 동일한 조건에서 129SvJ 및 C57BL / 6에서 수행되었다. 평가 기간의 끝에 129SvJ 변형의 %의 생존은 polymicrobial 감염에 의해 유발되는 염증에 대한 높은 자화율을 나타내는, C57BL / 6 변형율에서보다 25 % 적게되었습니다. (N = 6).

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	<li>Angus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+severe+sepsis+in+the+United+States:+analysis+of+incidence,+outcome,+and+associated+costs+of+care.">Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care.</a> Crit Care Med. 29, 1303-1310 (2001).</li><li>Riedemann, N. C., Guo, R. F., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigma+of+sepsis.">The enigma of sepsis.</a> J Clin Invest. 112, 460-467 (2003).</li><li>Eichacker, P. Q., Gerstenberger, E. P., Banks, S. M., Cui, X., Natanson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+acute+lung+injury+and+acute+respiratory+distress+syndrome+trials+testing+low+tidal+volumes.">Meta-analysis of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome trials testing low tidal volumes.</a> Am J Respir Crit Care Med. 166, 1510-1514 (2002).</li><li>Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis:+setting+the+stage.">Animal models of sepsis: setting the stage.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).</li><li>Doi, K., Leelahavanichkul, A., Yuen, P. S., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis+and+sepsis-induced+kidney+injury.">Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury.</a> J Clin Invest. 119, 2868-2878 (2009).</li><li>Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+determines+susceptibility+during+murine+septic+peritonitis.">Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis.</a> J Surg Res. 102, 45-49 (2002).</li><li>De Maio, A., Torres, M. B., Reeves, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+influencing+the+response+to+injury,+inflammation,+and+sepsis.">Genetic determinants influencing the response to injury, inflammation, and sepsis.</a> Shock. 23, 11-17 (2005).</li><li>Diodato, M. D., Knoferl, M. W., Schwacha, M. G., Bland, K. I., Chaudry, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+the+inflammatory+response+and+survival+following+haemorrhage+and+subsequent+sepsis.">Gender differences in the inflammatory response and survival following haemorrhage and subsequent sepsis.</a> Cytokine. 14, 162-169 (2001).</li><li>Turnbull, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+age+on+mortality+and+antibiotic+efficacy+in+cecal+ligation+and+puncture.">Effects of age on mortality and antibiotic efficacy in cecal ligation and puncture.</a> Shock. 19, 310-313 (2003).</li><li>Miyaji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethyl+pyruvate+decreases+sepsis-induced+acute+renal+failure+and+multiple+organ+damage+in+aged+mice.">Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice.</a> Kidney Int. 64, 1620-1631 (2003).</li><li>Torres, M. B., De Maio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exaggerated+inflammatory+response+after+CLP+correlates+with+a+negative+outcome.">An exaggerated inflammatory response after CLP correlates with a negative outcome.</a> J Surg Res. 125, 88-93 (2005).</li><li>Doi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP214,+an+analogue+of+alpha-melanocyte-stimulating+hormone,+ameliorates+sepsis-induced+acute+kidney+injury+and+mortality.">AP214, an analogue of alpha-melanocyte-stimulating hormone, ameliorates sepsis-induced acute kidney injury and mortality.</a> Kidney Int. 73, 1266-1274 (2008).</li><li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+resuscitation+attenuates+early+cytokine+mRNA+expression+after+peritonitis.">Fluid resuscitation attenuates early cytokine mRNA expression after peritonitis.</a> J Trauma. 41, 622-627 (1996).</li><li>Zanotti-Cavazzoni, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+resuscitation+influences+cardiovascular+performance+and+mortality+in+a+murine+model+of+sepsis.">Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis.</a> Intensive Care Med. 35, 748-754 (2009).</li><li>Hugunin, K. M., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tramadol+and+buprenorphine+on+select+immunologic+factors+in+a+cecal+ligation+and+puncture+model.">Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model.</a> Shock. 34, 250-260 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.<br /&gt; 동물 실험 관리 및 실험실 동물의 사용에 대한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행하고, 템플 대학에서 동물 보호 및 사용위원회의 승인되었습니다.

여기 우리는 생쥐에서 CLP 모델을 수행하는 방법을 자세히 표시하고 심각의 등급을 조절. 패혈증의 다른 동물 모델에 비해 CLP 서로 다른 연령과 성별의 마우스 변형에서 수행할 수 있습니다. 그것은 상대적으로 간편하고 저렴한 수술입니다. 이 모델에서는, 심각도의 등급 생존의 비율에 직접적인 영향을 미치고 있습니다. 결합의 길이는 바늘과 구멍의 개수의 두께는 심각 / CL...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 케타민을 </td><td> Ketaset </td><td> 0856-2013-01 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> AnaSed </td><td> 나다 # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> 인슐린 주사기 29G </td><td> Exel </td><td> 26,028 </td><td></td></tr><tr><td> 실크 봉합사, 6-0 PROLENE </td><td> Ethicon </td><td> 8680G </td><td></td></tr><tr><td> 19G와 25G 니들 </td><td> BD </td><td> 305186 </td><td></td></tr><tr><td> 고리 대금업자 </td><td> 일반 공급 </td><td> 일반 공급 </td><td></td></tr><tr><td> 적외선 난방 램프 </td><td> 일반 공급 </td><td> 일반 공급 </td><td></td></tr><tr><td> 미셸은 클립 7mm 상처 </td><td> Roboz 외과 Instr </td><td> RS - 9270 </td><td></td></tr><tr><td> 이어 루프 마스크 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 19-130-4181 </td><td></td></tr><tr><td> 해부 가위 </td><td> Roboz 외과 Instr </td><td> RS - 6702 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine 솔루션 </td><td> VWR </td><td> 63410-992 </td><td></td></tr><tr><td> 외과 포셉 </td><td> Roboz 외과 Instr </td><td> RS - 5135 </td><td></td></tr><tr><td> 70% 이소 프로필 알콜 패드 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 22-031-350 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphine </td><td> 베드 포드 연구소 </td><td> 55390-100-10 </td><td></td></tr><tr><td> Tramadol </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 42,965 </td><td></td></tr></tbody></table>

cecal ligation puncture procedure

인간 패혈증은 로컬 호스트에 의해 포함된 것으로 실패 집중적이고 대규모 감염에 대응 체계 반응의 집합이 특징입니다. 현재, 미국 집중 치료 단위 1 사망률의 10 대 원인 중 패혈증 순위. 패혈증 동안 중복 수 있습니다이 설립 haemodynamic 단계가 없습니다. 초기 단계는 (hyperdynamic) macrophages 및 혈관 투과성 (저혈압에 이르는), 심장 기능에 영향을 미치는 조직의 괴사 및 기관 고장에 culminating 대사 변화를 유도 neutrophils에 의해 전염증성 크린 시토킨 및 반응 산소 종의 대량 생산으로 정의됩니다. 따라서 사망의 가장 흔한 원인은 급성 신장 손상입니다. 두 번째 단계는 (hypodynamic) 변경 단핵구 항원 프레 젠 테이션과 관련된 방지 염증 과정입니다, 림프구 증식과 기능을 증가 apoptosis 감소. immunosuppression 또는 면역 우울증으로 알려진이 상태가 급격히 nocosomial 감염 궁극적으로, 죽음의 위험을 증가시킵니다. 이러한 pathophysiological 프로세스의 메커니즘을 잘 묘사되지 않습니다. 패혈증의 두 단계가 돌이킬하고 치유할 수없는 손상을 입힐 수 있기 때문에, 그것은 환자의 면역 및 생리 상태를 확인하는 것이 필수적입니다. 이것은 많은 치료 약물들이 실패한 주요 이유입니다. 패혈증의 다른 단계에 주어진 동일한 약물 치료하거나 유해하거나 영향을 2,3도가 없습니다. 다양한 수준에서 패혈증을 이해하기 위해서는 질병의 임상 과정을 재현한 적합하고 종합적인 동물 모델을 가지고 중요 수도 있습니다. 패혈증 동안 발생 pathophysiological 메커니즘을 특징하고 잠재적인 치료 대리인 테스트를위한 모델 조건을 제어하는​​ 것이 중요합니다. 인간 패혈증 연구의 병인을 연구하기 위해서는 다양한 동물 모델을 개발했습니다. 가장 널리 사용되는 임상 모델은 cecal 내고 주사 (CLP)입니다. CLP 모델은 복막 캐비티에 지저분한 소재의 출시 polymicrobial 감염에 의해 유발 악화 면역 반응을 생성하는 허용이게 맹장의 천공으로 구성되어 있습니다. 이 모델은 임상적으로 관련이 인간 조건을 실현. 인간에서와 마찬가지로, 액체 인공 호흡과 함께 CLP를 받아야 쥐가 시간에서 두 번째로 (후반) hypodynamic 단계로 진행되는 첫 번째 (초) hyperdynamic 단계를 보여줍니다. 또한, 시토킨 프로필 림프구 apoptosis를 (4,5에서 검토)가 증가 어디 인간 패혈증에서 본 것과 유사합니다. 패혈증에 관련된 여러과 중복 메커니즘으로 인해, 연구자들은 일관성과 재현성 결과를 얻기 위해서는 통제 심각 적합한 패혈증 모델이 필요합니다.

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Cecal Ligation Puncture Procedure

인간 패혈증 연구에 유용한 도구로 cecal 내고 주사의 마우스 모델입니다.

Cecal 내고의 찔린 절차

Human sepsis is characterized by a set of systemic reactions in response to intensive and massive infection that failed to be locally contained by the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

54.3K 조회수.  Temple University. 인간 패혈증 연구에 유용한 도구로 cecal 내고 주사의 마우스 모델입니다.

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Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

연구

의학

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

마우스의 관상 동맥 결합에 대한 수정 기술

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

마우스의 담관 결찰 : 폐쇄성 담즙에 의한 염증성 간 손상과 섬유화의 유도

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by reduced blood supply to the heart, resulting in the loss of oxygen to and the ensuing necrosis of the heart muscle. The MI model has gained popularity for its use as a short-term ischemia-reperfusion model and a long-term permanent ligation model. Below, we describe a reliable method for the permanent ligation of the LAD. With mouse genetic engineering technology becoming more advanced, and with an increasing availability of quality murine surgical instruments, the mouse has become a popular model for MI surgeries. Our surgical model incorporates the use of an easily reversible anesthetic for the rapid recovery of the mouse; a minimally invasive endotracheal intubation without involving a tracheotomy; and a thoracentesis through the original thoracotomy site without creating an additional incision in the chest, as is done in some other methods, to effectively remove excess blood and air from the chest cavity. This method is comparatively less invasive than other methods, which dramatically reduces surgical and post-surgical complications and mortality and improves reproducibility.

Murine Left Anterior Descending LAD Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

We provide a reliable method for left anterior descending artery (LAD) ligation in a mouse model. This method is comparatively less invasive than other methods, involving endotracheal intubation, a left-sided thoracotomy approach, and thoracentesis. This method can be used as a model for both acute and chronic myocardial infarction (MI).

쥐 왼쪽 앞쪽에 내림차순 (LAD) 관상 동맥 결찰 : 심근 경색에 대한 개선 및 단순화 된 모델

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by ...

Rat Model of the Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged Hepatectomy (ALPPS) Procedure

Recent clinical data support an aggressive surgical approach to both primary and metastatic liver tumors. For some indications, like colorectal liver metastases, the amount of liver tissue left behind after liver resection has become the main limiting factor of resectability of large or multiple liver tumors. A minimal amount of functional tissue is required to avoid the severe complication of post-hepatectomy liver failure, which has high morbidity and mortality. Inducing liver growth of the prospective remnant prior to resection has become more established in liver surgery, either in the form of portal vein embolization by interventional radiologists or in the form of portal vein ligation several weeks prior to resection. Recently, it was shown that liver regeneration is more extensive and rapid, when the parenchymal transection is added to portal vein ligation in a first stage and then, after only one week of waiting, resection performed in a second stage (Associating Liver Partition and Portal vein ligation for Staged hepatectomy = ALPPS). ALPPS has rapidly become popular across the world, but has been criticized for its high perioperative mortality. The mechanism of accelerated and extensive growth induced by this procedure has not been well understood. Animal models have been developed to explore both the physiological and molecular mechanisms of accelerated liver regeneration in ALPPS. This protocol presents a rat model that allows mechanistic exploration of accelerated regeneration.

Rat Model of the Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged Hepatectomy ALPPS Procedure

Inducing rapid liver hypertrophy using Associating Liver Partition and Portal vein ligation for a Staged hepatectomy (ALPPS) has been proposed for resection of borderline resectable liver tumors. This model may elucidate mechanisms involved in rapid hypertrophy and allows testing of drugs that promote or block the acceleration of regeneration.

연결 간 파티션과 무대 Hepatectomy (ALPPS) 절차에 대 한 포털 정 맥 결 찰의 쥐 모델

Recent clinical data support an aggressive surgical approach to both primary and metastatic liver tumors. For some indications, like colorectal liver ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

마우스 모델 Rubeosis Iridis의 아이리스 Neovascularization 펑크 유발

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful compared to other more aggressive methods such as retro-orbital plexus sample collection. However, this blood collection method is sometimes limited by an unsatisfactory success rate. Here, we introduce a method for blood collection through the subclavian vein puncture. The subclavian vein is located just under the clavicle and this vein is large enough to fulfill the volume requirements of blood collection. Our results show that this method is safe and applicable for blood collection sampling with the required blood volume. Blood collection through the subclavian vein puncture could serve as an alternative blood collection method in case of failed tail vein blood sampling in rats.

Here, we present a protocol to collect blood samples from the rat subclavian vein.

쥐에서 혈액 샘플 컬렉션의 대체 방법으로 빵 꾸 하 정 맥

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful ...

Blood Collection Through Subclavian Vein Puncture in Mice

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in research work. Tail blood collection is a popular method when a small amount of blood sample is needed. Orbital artery could be considered if a large amount of blood is needed but this blood collection method has ethical issues. Formerly, we demonstrated the feasibility and safety of blood sample collection through subclavian vein puncture in rats, and here we investigate whether this method could be used in mice. We report that this method is safe and practical for blood collection in mice. Blood collection through the subclavian vein puncture in mice can be a convenient method in daily research works.

Here, we present a protocol to take blood samples from the subclavian vein of mice.

생쥐의 쇄 골 정 맥 천자를 통한 혈액 채취

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in ...

Left Coronary Artery Ligation: A Surgical Murine Model of Myocardial Infarction

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In order to explore the pathophysiological changes after myocardial infarction and design future treatments, research models of MI are required. Permanent ligation of the left coronary artery (LCA) in mice is a popular model to investigate cardiac function and ventricular remodeling post MI. Here we describe a less invasive, reliable, and reproducible surgical murine MI model by permanent ligation of the LCA. Our surgical model comprises of an easily reversible general anesthesia, endotracheal intubation that does not require a tracheotomy, and a thoracotomy. Electrocardiography and troponin measurement should be performed to ensure MI. Echocardiography at day 28 after MI will discern heart function and heart failure parameters. The degree of cardiac fibrosis can be evaluated by Masson's trichrome staining and cardiac MRI. This MI model is useful for studying the pathophysiological and immunological alterations after MI.

Presented here is a surgical procedure for permanent ligation of the left coronary artery in mice. This model can be used to investigate the pathophysiology and associated inflammatory response after myocardial infarction.

좌측 관상동맥 결찰술: 심근경색의 외과적 쥐 모델

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In ...

Tail Vein Puncture Without Anesthesia

To begin, secure the rat in a plastic restraining cone, enclose the large end of the cone around the base of the tail. Ensure that the animal is comfortable and breathing is unrestricted throughout the procedure. Dip the tail in warm water for about one minute to dilate the vein, and dry the tail with a paper towel.In the restrainer, position the animal facing down with the tail lying on a heating pad. To select the appropriate tail vein for sampling, rotate the entire animal to the right or left side. Use the terminal third of the tail for blood vessel puncturing since the vessels become more superficial in this zone.Wipe the tail with 70%ethanol wipes at the puncture site and place it on the edge of the heating pad, creating an angle in the terminal third of the tail. This brings the vein to the surface and creates more space for taking the sample. For blood sampling, move the plunger back and forth in the syringe several times to smoothen the withdrawal and then pull on the plunger to create negative pressure in the syringe.Secure the tail flat on the heating pad using the non-dominant index and middle finger. Place the middle finger proximally and the index finger distally with the puncture site between these two fingers. Slide the insulin syringe against the index finger with the eye of the needle pointing upward until it is inserted into the vein.This creates an angle of 35 degrees between the needle and the tail. Once the needle has entered the vein, blood will flow into the syringe. Slowly withdraw the plunger of the syringe at a steady rate to collect the desired volume.Remove the syringe from the tail and allow a blood drop to form on the puncture side of the tail. Aspirate this blood to collect a few more microliters of blood, in case of a non-sterile procedure. Apply pressure to the puncture site to stop the bleeding and wipe the area with a new alcohol wipe.After removing the rat from the cone, return it to its cage. The success rates with the tail vein puncture methods were compared with the success rate of the penile vein puncture method under anesthesia. Interestingly, under anesthesia, the tail vein became very unreliable and had a success rate of only 25%The success rates showed almost similar results for the tail vein puncture in conscious rats and the penile vein puncture under anesthesia.The blood sampling was performed in less than six minutes in the tail vein puncture without anesthesia, and the penile vein puncture method under anesthesia, whereas the tail vein puncture method under anesthesia took more than eight minutes due to multiple failures.