패혈증은 미생물 침윤 또는 조직 손상에 대한 조절이 어려운 숙주 면역 반응으로, 감염 또는 손상으로부터 멀리 떨어진 부위에서 장기 손상을 유발한다. 일반 대중은 COVID-19 전염병 기간 동안이 장애를 더 잘 알게되었습니다. 2017 년에는 48.9 백만 패혈증 발생률이 있었으며 전 세계적으로 11 백만 명이 사망하여 전 세계 사망자의 거의 20 %를 차지합니다.
예상 할 수 있듯이 대부분의 경우는 병원에 있습니다. 사실, 한 연구에 따르면 패혈증이있는 ICU 환자로부터의 양성 격리물 중 거의 62 %가 그람 음성 유기체였습니다. 패혈증의 몇몇 모델이 있고, 일반적으로 사용되는 마우스 모델 중 일부는 LPS 유도 내독소혈증, 맹장 결찰 및 천자 모델, 및 단세균 감염 모델 시스템을 포함한다.
우리 실험실에서는 살모넬라 티피뮤리움을 사용하여 복막 패혈증을 유도하기 위해 마우스 모델 시스템을 표준화했습니다. 이 모델은 살모넬라 티피뮤리움이 그람 음성 패혈증의 임상적으로 관련된 상태를 모방하는 세포 내 병원체이기 때문에 다른 모델보다 유리합니다. 이 모델에서 복막염 패혈증의 결과는 감염 후 96 시간 이내에 100 % 사망률로 전신적입니다.
따라서이 모델은 염증 숙주 반응을 연구하는 데 도움이됩니다. 이 모델에서, 패혈증은 8-10주령의 C57BL/6 마우스에서 살모넬라 티피뮤리움의 0.5백만 CFU를 복강내 주사함으로써 유도된다. 전신 감염은 감염 후 약 16 시간 동안 장기 박테리아 부담을 평가함으로써 확인할 수 있습니다.
살모넬라 티피뮤리움을 이용한 실험은 BSL-2 시설과 BSL-2 가이드라인 준수가 필요합니다. 적절한 PPE를 사용하고 안전을 보장하고 표준 BSL-2 생물학적 위험 처리 방법을 따르기 위해주의를 기울여야합니다. 모든 실험은 기관 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
살모넬라 티피뮤리움의 문화 준비. 살모넬라 티피뮤리움 NCTC 12023 글리세롤 스톡 백 마이크로리터를 LB 국물 3mL에 넣습니다. 배양물을 분당 160회전, 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 배양한다.
LB 국물에서 밤새 성장한 배양물 50 마이크로리터를 줄무늬, 살모넬라 시겔라 한천 플레이트 상에, 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양한다. 마이크로팁을 사용하여 줄무늬가 있는 SS 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 선택합니다. 마이크로팁을 LB 배양액 3 mL에 넣고, 섭씨 37도에서 160 RPM에서 하룻밤 동안 배양하였다.
박테리아 배양물 0.1 mL를 LB 배양액 50 mL에 넣고, 섭씨 37도, 160 RPM의 진탕기 배양기에서, 3 내지 4시간 동안 배양하여, 대수 성장 단계에 도달한다. LB 국물을 사용하여 배양물을 두 배로 희석하십시오. 분광광도계에서 600 나노미터 파장의 광에서 배양물의 광학 밀도를 측정한다.
OD가 1에 도달하면, 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에서 배양물 1 mL의 분취량 두 개를 만든다. 튜브를 7, 750 G에서 15분 동안 원심분리한다. 이 상청액을 버리고, 펠렛을 1 mL의 1XPBS로 두 번 세척한다.
튜브를 7, 750 G에서 15분 동안 원심분리한다. 펠렛을 0.5 mL의 1XPBS에 재현탁시키고, 두 개의 상이한 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에 재현탁시킨다. 두 튜브의 현탁액을 하나의 1.5 mL 튜브에 결합하고, 현재 함유하고, 약 두 개에 10을 곱하여 mL 당 8 개의 콜로니 형성 유닛을 파워로 올립니다.
원액을 희석하여 10 파워 여섯 CFU/mL의 박테리아 세포 현탁액을 준비한다. 중요한 점은 실험을 시작하기 전에 실험실에서 OD에 해당하는 CFU를 최적화하여 OD에 대한 CFU를 결정합니다. 생쥐와 감염.
감염 당일에는 한 손으로 마우스를 잡고 70 % 에탄올로 복부 피부를 닦은 다음 뒷다리를 벌려 복벽의 접근성을 향상시킵니다. 1 mL 주사기의 도움으로 파워 여섯 CFU/mL 박테리아 현탁액에 올린 10 mL를 복강내 주사하십시오. 감염 후, 플레이트 배양물을 주입된 실제 CFU를 확인하기 위해, 이는 0.5 mL 당 0.2 내지 0.8 백만 CFU로 다양할 수 있다.
장기의 CFU 평가. 마우스를 이산화탄소 질식을 사용하여 희생시켰다. 감염된 마우스를 희생 한 후 복부를 면화 조각으로 닦아 내고 70 % 에탄올에 담근다.
복부 피부를 엽니 다. 복막 세척액을 수집하는 방법에 대한 비디오 프로토콜에 대해서는 Ray and Dittle의 기사를 참조하십시오. 복강을 열고 관심있는 기관을 수집하십시오.
이 비디오에서는 간에서 장기 CFU의 열거를 시연하고 있습니다. 간은 패혈증의이 모델에서 광범위한 조직 병리학 적 손상을 겪습니다. 간을 작은 조각으로 자르고 미세 퍼지 튜브에 넣으십시오.
이것은 다음 단계로 진행하기 전에 두세 시간 동안 얼음에 저장할 수 있습니다. 조각을 계량하여 마이크로 퍼지 튜브로 옮깁니다. 바람직하게는, 적절한 균질화를 위해 약 10 내지 15 mg의 무게의 조각을 절단한다.
튜브에 0.5mL의 1XPBS를 넣고 핸드 호모게나이저를 사용하여 장기를 균질화합니다. 장기가 완전히 균질화되어 있는지 확인하십시오. 0.5mL의 1XPBS를 첨가하여 부피를 1mL까지 구성하십시오.
튜브를 섭씨 네 도에서 다섯 분 동안 200G에서 원심분리한다. 상층액을 신선한 마이크로 퍼지 튜브에 모으십시오. 96 웰 플레이트에서 10을 빼고 10에서 두 번째를 뺀 힘으로 희석하십시오.
희석제 50 마이크로리터를 신선한 SS 한천 플레이트 상에 퍼뜨리고, 플레이트를 섭씨 37도에서 12시간 동안 인큐베이션한다. 각 조건에 나타나는 콜로니의 수를 계산하고 다음 공식을 사용하여 장기 무게로 데이터를 정규화하십시오. CFU / mg은 콜로니의 수와 같으며 20을 곱하고 희석 계수를 곱한 다음 전체를 mg 단위의 장기 무게로 나눕니다.
참고로, 숫자 20은 플레이트 당 콜로니를 CFU / mL로 변환하기 위해 수식에 사용됩니다. 이 숫자는 플레이팅된 배양물의 주어진 부피의 양의 1 mL를 나눔으로써 도달한다. 이 경우 50 마이크로 리터입니다.
예를 들어, SS 한천 플레이트에서 10 마이크로리터의 50 마이크로리터에서 균질화된 장기의 희석 10 개를 뺀 값, 무게 10 mg이 퍼지는 100 마이크로리터에 20을 곱하고 10을 곱한 다음 10을 곱한 값과 같으며 전체는 2000 CFU / mg과 같습니다. 복막 삼출물에서 다양한 면역 세포 집단의 유세포 분석. 앞서 기술한 바와 같이, Ray 및 Dittle에 의해 복막 세포를 수집한다.
복막 세척액에서 세포 펠릿을 10%FBS로 보충된 RPMI 1mL에 재현탁시킨다. 혈구계 분석기를 사용하여 복막 세척의 총 세포 수를 열거하십시오. 모든 튜브가 두 개에서 다섯 개에 10을 곱하여 다섯 개의 셀을 힘으로 올리는 방식으로 셀 번호를 조정하십시오.
세포를 섭씨 네 도에서 200G에서 10분 동안 회전시킨다. 상층액을 버리십시오. 세포를 1XPBS로 한 번 씻으십시오.
세포를 200 G에서 10분 동안 원심분리한다. FcR 차단제를 사용하여 Fc 수용체를 차단한다. 하나는 PBS 중의 5%FBS 및 0.02%sodium azide로 구성된 블로킹 완충액에서 제조되는 400개의 희석액이다.
얼음 위에서 15 분 동안 배양하십시오. 세포를 200 G에서 10분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
블로킹 완충액에 관심있는 플루오로크롬 컨쥬게이션된 항체를 희석한다. 여기서, 우리는 호중구를 염색하기 위해 항-마우스 Ly6G를 500 희석한 것을 사용한다. 참고로, B 세포에 대한 항-마우스 B220, T 세포에 대한 항-마우스 CD3, 대식세포에 대한 항-마우스 F4/80, 등등을 사용하여 다른 면역 세포 집단이 또한 도시될 수 있다.
약 0.2 백만 세포를 항체의 희석 용액 200 마이크로리터에 별도의 튜브에서 배양하십시오. 음성 대조군으로서, 염색되지 않은 대조군을 위해 각 플루오로크롬 타입에 하나의 튜브를 따로 두십시오. 이 튜브에서, 항체가 없는 200 마이크로리터의 블로킹 완충액으로 세포를 인큐베이션한다.
샘플을 얼음 위에서 45분 동안 인큐베이션하고, 15분마다 간헐적으로 두드리십시오. 세포를 섭씨 네 도에서 10분 동안 200 G에서 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
며칠 동안 보관해야하는 경우 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정하십시오. 세포를 200 마이크로리터의 FACS 염색 완충액, PBS 중의 2%FBS에 재현탁시킨다. 유세포 분석기에서 데이터를 획득한다.
여기에 표시된 SS 한천 플레이트의 이미지는 패혈성 마우스의 간 및 비장에서의 장기 CFU 부담을 나타냅니다. 균질화된 기관 Lys6을 10의 희석에서 마이너스 1로 확산시키고, 섭씨 37도에서 인큐베이션하였다. 흑색-착색된 S.Typhimurium 콜로니는 인큐베이션 후 약 12시간 후에 나타났다.
플레이트의 일부는 콜로니를 강조하기 위해 확대 된 인셋으로 여기에 표시됩니다. 이러한 결과는 병원체가 성공적으로 전신적으로 전파되고 내부 장기를 식민지화했음을 시사한다. 이 그림은 건강한 패혈성 마우스로부터 분리된 혈청을 보여준다.
패혈성 마우스에서 수집 가능한 혈액의 양은 건강한 대조군보다 적기 때문에 얻은 혈청은 적습니다. 이것은 패혈증의 응고가 높아지기 때문에 발생합니다. 또한 패혈성 마우스의 혈청은 뚜렷한 붉은 색채를 나타내며 광범위한 용혈의 발생을 나타냅니다.
그림은 항-Ly6G 항체로 염색된 건강한 패혈성 마우스로부터의 복막 세포의 세포측정 플롯을 보여준다. 이 이미지는 한 마리의 건강한 마우스와 두 마리의 감염된 마우스를 대표합니다. 패혈성 마우스는 복강으로의 호중구의 증가 된 침윤을 보았다.
이 비디오에서 우리는 살모넬라 티피뮤리움의 복강 내 주사를 통해 마우스에서 세균성 패혈증을 유도하는 방법을 보여주었습니다. 이것은 패혈증 감쇠에 대한 치료 개입의 효과를 연구하는 데 유용한 모델입니다. 이 모델 시스템에서, 복강의 세포 조성은 병원균과 싸우기 위해 극적으로 변화한다.
따라서, 패혈증 동안 면역 세포 조성물 및 기능의 동역학적 변화를 연구하는데 유용한 모델이다. 이 모델은 또한 세포간 반응성 산소 종, 전염증성 사이토카인 수준, 용혈 및 혈액 응고의 증가를 이해하는데 유용하며, 이들 모두는 패혈증 동안 일어난다.
