저자는 원고의 중요한 읽기 Dumenil 연구소의 모든 구성원, 특히 실케 실바에게 감사의 말씀을 전합니다. HOPITAL Europeen에서 조르쥬 퐁피두 (HEGP), 박사 데이비드 Maladry의 수술 부서. 마이클 Hivelin 박사 패트릭 Bruneval, HEGP에서 병리학 교실. 엘리자베스 HUC 이끄는 PARCC의 동물 시설. 이 작품은 다음과 부여 기관에 의해 지원되었다 : 마리 퀴리 IEF 교제 없음. 273223 (KM), INSERM에서 ATIP-Avenir에서 그랜트, CODDIM 장비 보조금 (일 드 프랑스 지역), FRM 장비 부여, 우수 컨소시엄의 IBEID 연구소 (매그 라 공들인 médicale을 부어), ANR 부여 &quot;(직원은 국립 라 공들인을 부어) 버그 인 흐름 &quot;. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고의 준비에 역할을했다.

1. 위험 및 권한 <ol><li> 지역 윤리위원회는 모든 동물 프로토콜을 승인해야합니다.이 프로토콜은 프랑스와 유럽 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 규정 (Décrets 87-848, 2001-464, 2001-486과 2001-131에 의해 설립 된 지침에 따라 실시되었다 유럽 ​​지침 2010/63/UE)과 지역 윤리위원회의 프랑스위원회 (CCT) D&#39; ETHIQUE EN MATIERE 디부 실험 ANIMALE, 대학교 파리 데카르트, 파리, 승인. 아니오 : CEEA34.GD.002.11 없습니다. </li><li> 인간의 피부를 위해, 기록 정보를 환자의 동의를 얻었다 모든 절차가 수행 된 프랑스 국립 지침에 따라 로컬 윤리위원회,위원회 (CCT) D&#39; 평가 ETHIQUE 드 난 INSERM IRB 00003888 FWA 00005881, 파리, 프랑스의 의견에 의해 승인 : 11-048 . </li><li> N.의 수막염은 잠재적으로 유해한 인간의 병원체이며, ORGA를 처리 할 때 필요한 모든 예방 조치를 수행해야합니다커니즘. 주의 사항은 예방 접종 및 바이오 안전성 수준이 조건에서 작업이 (가) 있습니다. </li></ol> 2. 피부 이식 <ol><li> 가능한 한 시간을 접목에 가까운 인간의 피부를 수집합니다. 이 작품의 피부의 대부분은 복부 영역을 포함하는 성형 수술 작업에서 비롯됩니다. 유방, 다리, 심지어 얼굴과 같은 다른 소스의 성공과 함께 사용되었다. </li><li> 70 % EtOH로 피부 표면을 청소하고, 바람직하게는 흐름 후드 아래, 잘 청소 표면에 평평하게 거짓말을하여 인간의 피부 샘플을 준비합니다. </li><li> 프리셋 두께 dermatome을 사용 피부 위에서 200-400 μm의 슬라이스 조각. </li><li> 단기 저장을위한 10 %의 혈청 (3-12 시간 즉시 또는 DMEM에서 4 ° C에 접목하면 무결성 피부 조각을 확인하고 2cm X 2cm 사각형으로 그들을 잘라, 다음 (가의 양이온없이) PBS에 배치 ). </li><li> 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏) 인제 6-8 주 이전 SCID.bg 마우스 (약 20 g)을 마취시키다cted의 IP </li><li> 쥐가 마취되면, 발가락 핀치, 고통의 반사를 설정하기위한 표준 방법을 수행하여 통증 반응을 확인합니다. 각막 건조를 방지하고 이식이 배치됩니다 어깨 뒤에 동물의 좌측 면도 눈에 젤을 적용합니다. 절차 전반에 걸쳐 열 패드에서 마우스를 따뜻하게 유지합니다. </li><li> 수술을 위해 마우스를 준비하고 후, 70 % EtOH로 면도 영역을 청소합니다. </li><li> 이식 사이트 (Tronothane)에 국소 국소 마취제를 적용하고 신중하게 곡선 가위와 마우스의 피부의 표면 층을 제거하여 이식 사이트를 준비하고 있습니다. 기본이되는 혈관을 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 인간의 피부 조각의 면적보다 약간 작은 면적의 피부를 제거합니다. </li><li> PBS (또는 DMEM)에서 피부 조각을 제거하고 이식 침대에 배치, 표피면이 위를 향 보장한다. 단계 2.8-2.10는 이식 침대가 건조하지 않는 보장, 가능한 한 빨리 수행되어야한다. </li><li> 한 모서리를 맞 춥니 다또는 조직 접착제로 가장자리와 수정. 조심스럽게 가장자리 주위 조직 접착제의 작은 금액을 배치, 이식 침대에 피부 조각의 나머지 부분을 맞습니다. 항상 크기로 인간의 피부 손질보다는 이식 침대가 더 큰합니다. </li><li> 마우스 피부가 매우 유연하기 때문에 이식 침대에 너무 꽉 피부를 잡아 당기지 마십시오. </li><li> 이식 각 모서리에있는 조직 접착제로 고정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 요오드 용액으로 영역을 청소합니다. </li><li> 이식에 쿠션 지역에 반창고를 적용합니다. 반창고는 회사 그러나 단단하고 동물의 호흡이 영향을받지되어 있는지 확인합니다. </li><li> 드레싱 테이프 반창고를 수정. </li><li> 동물이 따뜻한 표면에 복구 할 수 있습니다. </li><li> 일단 깨어, 그 케이지에 동물을 반환합니다. 동물은 2 ~ 3 당 케이지를 보관되어 있습니다. </li><li> 통증이나 고통의 징후를 복구하는 동안 정기적으로 쥐를 확인합니다. 10-14일 이식 후 이식을 방해하지 않도록주의하고, 반창고를 제거합니다. 우리의 경험에서 수술 후 통증은 미니입니다말. 그럼에도 불구하고 동물은 수술 후 몇 일에 특히 매일 모니터링해야합니다. 통증이나 고통에 대한 기준은 다음과 같다. <ul><li> 10 % 이상의 체중 감소 </li><li> 외모, 모피, 꼽추 위치, 눈 </li><li> 증가 된 호흡이나 심장 요금 </li><li> 감소 또는 비정상적인 움직임. </li><li> 체온 상승 </li><li> 경우에 고통의 흔적이 발견 paracetamole은 (300 ㎎ / ㎏, 매 4 시간) 경구 투여한다. 동물 애호 엔드 포인트는 엄격하게 통증이 지속되는 경우에 부착되어 있습니다. </li></ul></li><li> 수술이 부드러운 피부를 유지하기 위해 2-3 일마다 베이비 오일을 적용 건조 보인다면. </li><li> 이식은 실험 이십일일 포스트 이식을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 3. 감염 <ol><li> 감염 전날, 적절한 항생제 GCB의 한천 플레이트에 줄무늬에 의해 균주를 준비합니다. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 하룻밤 성장. </li><li> 박테리아 준비 <ol&gt; <li> Reinoculate의 OD 600 0.05 ~ 10 %의 혈청 인간의 내피 세포의 SFM 매체의 5 ㎖의 세균. </li><li> 약 OD 600 0.1 세균의 밀도까지 인큐베이터에서 2 시간 느슨한 뚜껑 (5 % CO 2에서 37 ℃), 진탕 동안 품어. </li><li> 3 분 15,000 RPM의 박테리아를 원심 분리기. </li><li> PBS에 뜨는에 resuspend을 제거한 다음 다시 원심 분리. </li><li> 두 번 세척 단계 (2.2.4-2.2.5)를 반복합니다. </li><li> PBS에서 박테리아 펠렛을 재현 탁. </li><li> OD 600을 측정합니다. </li><li> OD 600 0.1 (10 8 CFU / ㎖), 또는 OD 600 1.0 (10 9 CFU / ㎖) 하나의 문화를합니다. 이 알려진 농도에서 10 7 CFU / ml로 희석. 가능한 분사 시간에 가까운 박테리아를 준비하려고합니다. </li></ol></li><li> 마우스 <ol><li> 마우스의 무게를. </li><li> 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진과 쥐를 마취시키다 (10 ㎎ / ㎏)을 주입 IP </li><li> 일단 잠, C도대체 그 고통의 응답은 열 패드 따뜻한 마우스를 유지하고 건조를 방지하기 위해 눈에 연고를두고, 발가락 핀치에 의한 결석. </li><li> 각 마우스에게 식염수 또는 PBS에 인간 트랜스페린의 8 밀리그램을 제공, IP 주입 </li><li> 꼬리에서 혈액의 작은 방울을 타고 혈액 전에 감염에 대한 멸균 확인 한천 플레이트에 확산. </li><li> 정맥 복고풍 궤도 또는 꼬리 정맥을 통해 100 ㎕의 10 7 CFU / ㎖의 세균 배양 (10 6 CFU 총)을 주입한다. 5 분 후 주사를 촬영 CFU의 측정에 관계없이 주사 부위의 일치한다. </li><li> 몇 분 후, 꼬리 끝을 싹둑 즉시 감염 다음과 같은 혈액 CFU을 설정하는 하나의 10 배 희석으로 적절한 항생제로 한천 플레이트에 혈액 샘플을 확산. </li><li> 조직 접착제로 꼬리를 밀봉. </li><li> 주입 후, 세균 접종을 희석 CFU을 설정하는 적절한 항생제로 한천 플레이트에 확산. </li><li> 쥐에게 허용그들은 위로 이동 될 때까지 열 패드에 복구 할 수 </li><li> 6 시간 게시물 감염에서 6 시간에 CFU을 설정하는 희석 플레이트, 꼬리에서 소량의 혈액을 그립니다. </li><li> CO 2 밤새 5 %에서 37 ° C에서 모든 한천 번호판을 품어. </li></ol></li></ol> 4. 희생 <ol><li> 감염의 선택시, 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진과 쥐를 마취시키다 (10 ㎎ / ㎏)는 IP를 주입 </li><li> 자고 나면 열 패드로 마우스를 따뜻하게 유지합니다. </li><li> 고통의 반사 (발가락 핀치)를 간 경우, 꼬리의 끝을 싹둑과 혈액을 그립니다. </li><li> 적절한 항생제 한천 플레이트에 혈액을 확산, 5 ㎕를 직접 10 μL 배 희석는 CFU를 설정합니다. </li><li> 경추 탈구하여 마우스를 희생. </li><li> 모든 관련 기관과 윤리적 지침에 따라 마우스를 희생 한 후, 심장 박동의 부족으로 죽음을 확인합니다. 갈비뼈를 잘라 중간 선 절개를 확인하고, 듣고에 절개를t. </li><li> 멸균 튜브에 심장 / 흉강과 장소에서 가능한 한 많은 혈액을 수집합니다. </li><li> 멸균 플레이트에 장기 (예 : 간, 비장, 뇌)를 제거합니다. </li><li> 피부 이식 및 멸균 플레이트에 마우스 피부의 일부를 제거합니다. </li><li> 마우스 본체를 폐기하십시오. </li><li> 수집 된 혈액을 15 분 동안 응고하도록 허용 한 후, 3,000 rpm에서 15 분간 원심 분리 해. </li><li> ELISA 또는 FACS 기반의 방법에 의한 사이토 카인의 검출 예를 들어, 나중에 분석을 위해 -80 ° C에서 혈액과 매장에서 플라즈마를 분리합니다. </li></ol> 5. 기관 CFU 카운트 <ol><li> 각 사전 생검 샘플을 채취로 PBS 500 μl를 포함하는 튜브를 균질화 무게. </li><li> 멸균 생검 펀치를 사용하여 각 조직에서 4mm 생검 샘플을 채취. </li><li> 500 ㎕의 PBS를 포함 preweighed 균질화 튜브에 장소 생검. 다른 장기에 작은 구슬을 사용하여 2 ㎜의 비즈 피부 샘플을 균질화. </li><li> 나머지 t 배치현미경 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 및 저장의 문제는 (아래 참조). </li><li> (CFU / MG 조직의 이상 계산) 생검 무게를 설정하기 위해 조직 검사를 포함하는 튜브를 균질화 무게. </li><li> 샘플을 균질화. <ol><li> 30 초 동안 6,000 rpm으로, 간, 비장, 뇌를 균질화. </li><li> 30 초 동안 6,000 rpm에서 피부 샘플을 균질화하고 필요한 경우 반복합니다. </li></ol></li><li> 한천 플레이트에 각 균질화 튜브에서 희석 확산과 장기 CFU 수를 설정하는 5 % CO 2에서 37 ° C에서 하룻밤 성장. </li></ol> 6. 조직학 / 면역 조직 화학 <ol><li> 정착 <ol><li> 4 ℃에서 하룻밤 4 % PFA의 조직을 수정 고정 단계는 더 이상 할 수 있으며, 장기간 동안 저장이 0.25 % PFA의 조직을 배치합니다. </li><li> PBS에서 조직을 씻어 다음 20 % 자당 용액에 넣고 하룻밤 또는 조직이 솔루션에 침몰 할 때까지 4 ° C로 돌아갑니다. </li><li> (조직 형 또는베이스 보드에 부착 된 하나) 크기의 OCT 솔루션의 장소로 절단, PBS에서 조직을 씻으십시오. </li><li> 빨리 액체 질소에 떠있는 페트리 접시에 조직을 동결. </li><li> 냉동 한 후, 저장을위한 -80 ° C로 전송하기 전에 드라이 아이스에 조직을 넣어. </li></ol></li><li> 슬라이스 <ol><li> -80 ° C에서 조직을 제거하고 저온 ​​유지 장치에 -20 ° C에 평형 수 있습니다. </li><li> 슬라이스 약 10 ~ 15 ㎛의 두께로 조직 및 코팅 현미경 슬라이드에 배치합니다. </li><li> 필요할 때까지 상점은 -20 ° C에서 슬라이드. </li></ol></li><li> 염색 <ol><li> 슬라이드는 실온에 와서 수 있습니다. </li><li> 소수성 펜으로 슬라이드의 조각 주위에 그립니다. 5 ~ 10 분을 기다립니다. </li><li> 5 분 동안 PBS에서 / 세척 슬라이스를 재수, 두 번 반복합니다. </li><li> 10 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤의 투과 조각. </li><li> 5 분 동안 PBS 2 배에 씻으십시오. </li><li> PBS의 차단10-60 분 사이에 사용되는 항체 또는 얼룩에 따라서는 0.1 % 트리톤 1 % BSA. </li><li> 버퍼를 차단 제거하고 블록 버퍼에 필요한 희석 일차 항체를 추가합니다. 정해진 시간 동안 배양한다. (종종 실온에서 1 시간 또는 4 ° C에서 하룻밤). </li><li> 5 분 동안 PBS 2 배에 씻으십시오. </li><li> 복 버퍼에 적절한 희석 차 항체를 적용, DAPI는 일반적으로이 단계에 포함되어 있습니다. 어둠 속에서, 정해진 시간에, 종종 1 ~ 2 시간 실내 온도에 품어. </li><li> 5 분 동안 PBS 2 배에 씻으십시오. </li><li> 커버 유리로 설치 미디어를 보호 페이드 마운트 및 손톱 광택과 도장. </li><li> 이미지 스테인드 즉시 슬라이드 또는 4 ℃에서 보관 </li><li> 사용 된 형광 물질에 적합한 필터 / 레이저로 설정 공 초점 형광 현미경 이미징을 수행합니다. </li></ol></li><li> 조직학 <ol><li> 조직학은 실온에 와서하는 슬라이드를 사용할 수 있도록 허용합니다. </li><li> 로 사용하여 얼룩 슬라이드tandard의 헤 마톡 실린 / 에오신 염색 프로토콜입니다. <ol><li> 슬라이드 랙에 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 다음과 같은 순서로 솔루션 사이의 슬라이드와 랙을 이동 : </li><li> 흐르는 수돗물에 2 초. </li><li> 필터링 헤 마톡 실린 용액에서 3 분. </li><li> 흐르는 물에 10 초. </li><li> 증류수 10 초. </li><li> 에탄올 100 %로 10 초. </li><li> 필터링 에오신에 2 초. </li><li> 흐르는 물에 10 초. </li><li> 에탄올 100 %로 10 초 </li><li> 2 분 자일 렌 × 3에 (목욕 I, II, III). </li><li> 즉시 전송하고, 상단에 각 슬라이드, 장소 커버 슬립에 고정 접착제 몇 방울을 추가 기포를 제거, 몇 시간 동안 건조시켜주십시오. </li><li> 이미지는 표준 백색광 현미경 슬라이드. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
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C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+meningococcus+genome+by+gene+disruption:+resistance+to+complement-mediated+lysis.">Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis.</a> Genome Res. 13, 391-398 (2003).</li><li>Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Plasmodium+falciparum-endothelium+interactions+in+human+microvasculature:+mimicry+of+leukocyte+recruitment.">Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment.</a> J. Exp. Med. 192, 1205-1211 (2000).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

동물 모델은 세균성 병인 연구에 매우 중요하다. 그것은 완전히 세포 배양에서 생체 내 환경을 모방하는 것은 불가능하며 기주 - 많은 동적 요인에 좌우되고 있다는 것이 명백 해지고있다. 같은 N. 일부 임상 적으로 중요한 병원체의 인간의 특이성 수막염은, HIV, HCV, 열대열 원충 (Plasmodium falciparum), 리스테리아 균, 살모넬라 균이 감염에 대한 생체 내 모델의 사용을 제한하고있다. 우리는 전염성 단계 특이성에 관여하는 이해하기 시작 그러나, 인간 답게 모델이 개발되고있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 N.과 생체 내 감염의 광범위한 허용, 생쥐로 인간의 미세 혈관의 도입이의 데모입니다 수막염은 혈관 손상과 가끔 부르르 발진의 개발의 결과로. 이 모델을 사용하여,우리는 총요소 생산성의 접착 성이 세균의 돌연변이 체를 사용하여 혈관 손상이 접착 (18)의 부재에서 감소된다 의해 생체 내에서 혈관 식민지에 참여하는 것으로 정의 할 수 있었다. 이전에는 순환 세균 제품이 손상 연루되어있다 그러나 우리의 결과는 지역의 접착 및 혈관 식민지에 대한 결정적인 역할을하는 것이 좋습니다. 이 새로운 치료 표적 개발을위한 새로운 가능성을 엽니 다. 병원성 세균의 부착은 약학 적으로 차단 될 수 있다면 그것은 아마도 피부 병변의 발생을 예방하고 조직 괴사, 괴사 조직 제거 및 사지 ​​절단의 측면에서 수막 구균 생존자를위한 더 나은 결과로 이어질 수 있습니다. 작업은 또한 감염의 복잡성과 면역 반응과 응고 캐스케이드의 참여를 보여 주었다. 우리는 현재 인간의 내피 (18)의 상대적으로 작은 양에도 불구하고 감염된 생쥐의 혈청에서 인간의 사이토 카인 신호를 확인했다.이 영역에 마우스 면역 세포 집단의 침윤과 함께 중요한 시토 킨 반응을 나타냈다. 동물 모델은 물론 완벽하게 인간의 질병을 복제 할 수 없다 모든 결과를 염두에두고 고려되어야 그들로부터 얻고. 예를 들어,이 모델의 혈액 순환 세포를 마우스의 원산지이며, 우리는 그들이 인간의 세포에 다르게 동작 할 수 있음을 할인 할 수 없습니다. 이것의 장점은 그러나, 우리의 최근 간행물 (18)에서와 같이, 순환 마우스 세포와는 인간 내피로부터 발신 신호를 구별 할 수있는 능력이다. 이 모델에서 사용 된 마우스의 면역 배경 또한 상기 &#39;인간화&#39;양태를 추가, 인간 면역 세포 집단의 동종 전송을 허용한다. 쥐의 면역 배경 그러나 모든 부족하거나이 모델에서 결함이 NK, T 또는 B 세포의 역할을 마스크 할 수 있습니다. 상대적으로 짧이 모델에 사용되는 t의 기간 (24 시간)을 중심으로 타고난 반응을 우려하지만, 장기 감염과 면역 다른 옵션의 발전을 위해 탐구 할 필요가 있습니다. 피부는 N.을위한 중요한 감염 사이트입니다 수막염하지만 인간의 혈관은 비교적 적은 양을 갖는 또한 수많은 기관을 포함한 전신 감염에 데이터를 외삽하는 것은 어렵다는 것을 의미한다. 이 모델은 피부 병변 개발의 연구를 위해 수 있지만, 이러한 상피 및 뇌 혈관 횡단 등의 수막 구균 감염의 중요한 단계는 포함되어 있지 않습니다. 이러한 인간화 모델의 발전은 감염의 다른 측면을 해결하기 위해 필요하다. 그럼에도 불구하고이 모델은 수많은 사람의 특정 병원균, 혈관을 대상으로 특히 큰 잠재력을 제공합니다.

수막 구균 패혈증은 ​​세균 병원체 나이 세리아 수막염 기인 자주 심각한 혈액 태어난 감염이다. 수막 구균 패혈증 환자들은 이전에 순환 세균과 박테리아 제품 1에 의한 혈관 파괴와 관련되어 자신의 피부에 점상 또는 부르르 발진이 존재. 임상 환자의 피부 생검은 종종 선박 2를 작성, 미세 혈관과 관련된 박테리아를 보여줍니다. 떨어져 박테리아, 광범위한 혈전증, 혈액 응고, 혼잡과 혈관 누출로부터는 부르르 지역 3-5에서 볼 수있다. 이 혈관 손상은 수막 구균 생존자 변연 절제술, 심지어 절단의 결과로, 피부와 주위 조직의 광범위한 괴사로 이어질 수 있습니다. 감염이 혈관 손상을 일으키는 방법을 이해하면 예방 및 치료 전략을 최적화하는 것이 중요합니다. 수막 구균 패혈증에 대한 연구의 대부분은 체외에서 수행되었다N. 인간의 특이성에 의한 인간 세포주 수막염. 감염의 여러 측면 세균의 부착, 숙주 세포 반응뿐만 아니라 사이토 카인 반응 6-9 포함한 체외에서 연구되어왔다. 유형 IV의 필리 (TFP)은 N.의 주요 접착 세포 기관으로 연루되어있다 수막염은 상피 및 내피 세포 (10)에 모두. 또한 N.의 접착력을 보였다 세포를 호스트 수막염은 전단 응력에 따라 달라지며, 따라서 미세 혈관 (11) 내의 혈액 흐름 속도에 관련된 것으로 생각된다. 이 박테리아가 생체 내에서 직면하는 역동적 인 스트레스가 발병에 매우 중요합니다 제안합니다. 이는 시험관 내에서의 작은 혈관의 미세 환경을 모델링하지만 매우 어렵다. 나이 세리아 TFP 대한 밀착성 수용체는 아직 알 수 있고, 따라서 동물 모델에서 세균의 부착을 달성하기 위해 노크의 전략은이 시점에서 예상 할 수없는. CD46는 총요소 생산성 수용체 유전자 변형 동물 모델 마우스의 역할을하도록 제작 된 것으로 제안했다. 그러나 이러한 동물에 감염 광범위한 감염으로 이어질하지 않거나 개발 (12, 13)를 발진 할 수 있습니다. 나이 세리아 감염 균혈증 측면에 대해 기술 된 다른 동물 모델의 계정에 철 소스 (14, 15) 인간 트랜스페린의 세균 환경을. 인간 트랜스페린을 보완 또는 연장 기간 동안 혈류의 증가 세균 부하 트랜스 결과로부터 발현하지만,이 모델은 세균의 부착이나 습진 개발 16,17 보여주지 않는다 어느. 이 프로토콜에서는, 우리는 피부의 미세 혈관을 포함하여 인간의 피부, 면역 마우스 (18, 19)에 이식 된 인간 답게 된 마우스 모델에 대해 설명합니다. 이것은 마우스 순환 관류 기능적 인간 혈관 초래한다. 인간 트랜스페린의 보완과 결합,이 MODEL N.은 인간의 특정 측면의 적어도 두 개의 차지 수막염은 생체 내 환경에서, 인간의 내피 세포와 인간 트랜스페린 즉. N. 수막염은 혈관 손상과 부르르 발진 개발 (18)을 포함하여 임상 환자에서보고되는 것과 유사한 병리를 생산, 인간의 내피 세포에 특이 적으로 부착이 모델에 정맥 소개했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31885-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10010-056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ketamine 500</td>
			<td style="width:161px;">Virbac France&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">LOT N&#176;VAL4243</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylazine</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Bayer Healthcare</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">AMM N&#176; FR/8146715 2/1980</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">LOT N&#176; KPO809S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">(Rompun 2%)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:247px;">Optigel&#160;&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Europhta</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Medicament autoris&#233; N&#176;3400933521134</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lacrigel&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tronothane</td>
			<td style="width:161px;">Lisa Pharma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:247px;">GC agar Base</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Conda</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">1106</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human endothelium SFM media</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11111</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:161px;">P A A</td>
			<td style="width:119px;">A15-101</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human transferrin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">UEA lectin - rhodamine</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">RL-1062</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Eosin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4009&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylene</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">534056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Equiptment Name</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sober Hand Dermatome</td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Animal housing</td>
			<td style="width:161px;">Innovive</td>
			<td style="width:119px;">M-BTM-C8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Biopsy punch (4 mm)</td>
			<td style="width:161px;">Dominic Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">30737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fast-Prep lysing matrix M tubes</td>
			<td style="width:161px;">MP Bio</td>
			<td style="width:119px;">116923050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer Green Beads</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358941001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vectashield mounting media</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetbond</td>
			<td style="width:161px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1469SB</td>
			<td>Tissue Glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">OCT tissue tek</td>
			<td style="width:161px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature

그것은 인간의 혈액 스트림을 입력 할 때 나이 세리아 수막염은 심각한, 자주 치명적인 패혈증의 원인이됩니다. 감염이 혈관 누수, 부르르 발진 최종 조직 괴사의 발전의 결과로 혈관의 광범위한 손상에 이르게한다. 이 감염의 발병 기전을 연구하는 것은 이전에 생체 내 모델에서 어렵게 박테리아의 인간의 특이성에 의해 제한되었다. 이 프로토콜에서는, 우리는 인간의 피부, 피부의 미세 혈관을 포함하는이, 면역 쥐에 이식되는이 감염에 대한 인간화 모델을 설명합니다. 그 인간의 특성을 유지하면서 이러한 혈관 마우스 순환 anastomose. 일단이 모델 N.에 도입 수막염은 광범위한 혈관 손상, 염증과 부르르 발진의 경우에 개발의 결과로, 인간의 혈관에 독점적 준수합니다. 이 프로토콜은 콩트에서이 모델의 접목, 감염 및 평가 단계에 대해 설명합니다N.의 XT 수막염 감염. 기술은 혈류 감염 수많은 인간의 특정 병원균에 적용될 수있다.

CFU 카운트 N. 이러한 대표적인 결과에 사용 수막염 변형은 N입니다 , OPC는 - - PilC1 + / PilC2 + 20 수막염 8013 클론 (12), 혈청군 C 임상 분리, 나는 SB의 pilin, 오파 클래스를 표현. 변형 염색체 삽입 (18)로부터 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하기 위해 설계되었다. 세균 콜로니 형성 단위 카운트는 한천 플레이트에 콜로니의 수를 계산하고 혈액의 CFU / ㎖ 또는 도금 알려진 볼륨에서 조직의 CFU / MG 하나를 계산하여 설정됩니다. 혈액 수는 5 분 10 6 CFU의 세균의 정맥 주사 후 혈액 순환 1.5 × 10 5 CFU / ㎖의 평균 (그림 1A) 있다는 것을 보여 주었다. 6 시간 후에 수는 4.8 × 104 CFU / ml의 평균. 24 시간으로 평균 수는 4 CFU / ㎖ × 10 2.4했지만 10 생쥐의이 그룹에서 5했다이 탐지 다른 5가 상대적으로 높은 카운트 (그림 1A)를 가지고있는 동안 박테리아를 순환. 피부 샘플에서 가져온 CFU 수는 마우스가 2.1 × 104 CFU 6 시간에서 조직 / MG와 24 시간에서 조직의 4.4 × 10 2 CFU / MG (그림 1B)를 평균, 인간의 피부에 상당한 수를 갖는 대부분을 보여 . 반대측 마우스의 피부 샘플 N.에 대한 강한 선호를 보여, 24 시간 및 6 시간에 만 매우 낮은 수에서 더 박테리아 수 없었다 이식 피부 (그림 1B)에서 인간의 혈관 수막염. 일반적으로 세균의 수는 2 동물들이 높은 세균 수 (그림 1C)를 순환과 상관으로, 혈액에서 오염에 기인 할 수있다 쇼 수를 했더라도 샘플링 다른 장기에 nondetectable 매우 ​​낮았다. 모델은 타입 IV 파이에게 예를 들어, 생체 내에서 독성 인자의 역할을 결정하기 위하여 사용될 수있다리. 정의 TFP 결여 균주 결과 pilD 유전자 21의 돌연변이뿐만 아니라 제안 된 TFP &#39;히젼&#39;을 결여 pilC1 유전자 08 가진 균주가 모델에 도입 하였다. 이러한 돌연변이는 총요소 생산성은 생체 내 (그림 1D)에 접착에서 재생하는 중요한 역할을 확인하고, 인간의 피부 이식에없는 세균의 부착 결과. 면역 조직 화학 / 조직학 이 실험에서 우리는 N.을 사용 차 염색을위한 필요없이 형광 검출을 가능하게하는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현 수막염의 변종. 인간의 혈관, 인간의 내피 세포에 대한 마커를 사용하여 하나 CD31 (PECAM-1) 또는 렉틴 Ulex의 europaeus의 응집소 (UEA) 18, 22를 염색 하였다. UEA는 한 단계 염색법 (도 2A-C) 허용 로다 민에 접합시켰다. 세포 핵을 염색 할 수있다DAPI와 ED는 조직 구조 (그림 2A-B)를 식별하는 데 도움이. 조직학은 표준 헤 마톡 실린 / 에오신 염색을 사용하여 실시 하였다. 피부의 표피 / 피부 경계가 명확하게 식별했다. 염증, 혈전증과 혈관 누출은 감염 (그림 2D) 후이 국경을 24 시간에 가까운 선박에 집중했다. 혈전증은 종종 혼잡과 염증을 동반 여러 개의 작은 피부 혈관에서 볼 수 있었다. 조직으로 축소 적혈구의 누출은 혈관 손상의 광범위한 레벨을 나타내는 볼 수 있었다. 비감염 생쥐에 이식 피부의 조직 병리학없이 구별 염증 (18)와 정상 나타났다. 감염의 약 30 %가 피부에있는 박테리아 부착은 육안 검출 자반병 (도 2E 및 2F)의 개발에 이르게한다. <img alt="그림 1" fo:content-width=<html> SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot;/&gt; : FO &quot;5 인치&quot; 그림 1. CFU 카운트. (A) 5 분, 6 시간 및 24 시간 후 감염의 혈액 밀리리터 당 세균 CFU 카운트. (B) 박테리아 CFU은 6 시간과 24 시간 후 감염 모두에서 인간의 피부 (HS)와 마우스의 피부 (MS)를 비교하는 피부 샘플에서 계산합니다. (C) 세균 CFU는 다른 기관이 24 시간 후 감염을 촬영부터 계산합니다. 야생형 N.에 감염된 마우스에서 24 시간 후 감염에 찍은 인간과 쥐의 피부 샘플에서 박테리아 CFU 수를 비교 (D) 수막염 2C43 얼룩 (WT), pilD 유전자 (pilD) 또는 pilC1 유전자 (pilC1)의 돌연변이 균주의 돌연변이로 변형. 모든 그래프는 중간 원시 데이터로 표시됩니다. 그림은 Melican 등. 18에서 수정&quot;_blank&quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> 그림 2. 피부 (D) 표피 (E) 국경에 가까운 UEA 렉틴 (빨강)로 염색 인간의 미세 혈관을 보여주는 공 초점 스택의 현미경. (A) 투사. 용기 N. 감염된 수막염 (녹색) 2 시간 게시물 감염. (B) 광학 슬라이스와 N. 보여주는 슬라이스 돌기 (C) 수막염의 microcolonies (녹색) 감염 인간의 용기 (UEA - 빨간색) 피부 이식 2 시간 게시물 감염 내. 인간의 피부 이식의 (D) 헤 마톡 / 에오신 염색은 N. 24 시간 동안 감염 수막염. 표피 (E)는, 피부 (D) 경계는 명확하게 볼 수 광범위한 혈전증 및 microvess의 정체입니다ELS (화살표)는 진피에서 볼 수있다. 염증과 일부 혈관 누출 (화살촉)도 식별 될 수있다. (E) 전에 감염에 대한 인간의 피부 이식. (F) N.와 (E) 24 시간 후 감염과 동일한 피부 이식 부르르 지역 (화살표)를 표시하는 수막염은. 2B는, 2D, 2E, 그리고 2 층이 Melican 등. 18에서 수정은 그림 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

나이 세리아 수막염은 혈관을 감염시키는 인간의 특정 병원체이다. 이 프로토콜에서 인간의 미세 혈관은 면역 억제 쥐에 인간의 피부를 이식하여 마우스에 도입된다. 박테리아는 일반적으로 인간의 경우에 관찰 부르르 발진, 혈관 손상과 발전에 선도적 인, 인간의 혈관에 광범위하게 준수합니다.

인간 답게 된 마우스 모델은 미세 혈관을 대상으로 세균 감염을 연구하는

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K 조회수.  Paris Cardiovascular Research Centre.  나이 세리아 수막염은 혈관을 감염시키는 인간의 특정 병원체이다. 이 프로토콜에서 인간의 미세 혈관은 면역 억제 쥐에 인간의 피부를 이식하여 마우스에 도입된다. 박테리아는 일반적으로 인간의 경우에 관찰 부르르 발진, 혈관 손상과 발전에 선도적 인, 인간의 혈관에 광범위하게 준수합니다. 

비디오: Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Small animal models such as mice have been extensively used to study human disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of information gained from these studies, the unique characteristics of mouse immunity as well as the species specificity of viral diseases such as human immunodeficiency virus (HIV) infection led to the development of humanized mouse models. The earlier models involved the use of C. B 17 scid/scid mice and the transplantation of human fetal thymus and fetal liver termed thy/liv (SCID-hu) 1, 2 or the adoptive transfer of human peripheral blood leukocytes (SCID-huPBL) 3. Both models were mainly utilized for the study of HIV infection.
One of the main limitations of both of these models was the lack of stable reconstitution of human immune cells in the periphery to make them a more physiologically relevant model to study HIV disease. To this end, the BLT humanized mouse model was developed. BLT stands for bone marrow/liver/thymus. In this model, 6 to 8 week old NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) immunocompromised mice receive the thy/liv implant as in the SCID-hu mouse model only to be followed by a second human hematopoietic stem cell transplant 4. The advantage of this system is the full reconstitution of the human immune system in the periphery. This model has been used to study HIV infection and latency 5-8.
We have generated a modified version of this model in which we use genetically modified human hematopoietic stem cells (hHSC) to construct the thy/liv implant followed by injection of transduced autologous hHSC 7, 9. This approach results in the generation of genetically modified lineages. More importantly, we adapted this system to examine the potential of generating functional cytotoxic T cells (CTL) expressing a melanoma specific T cell receptor. Using this model we were able to assess the functionality of our transgenic CTL utilizing live positron emission tomography (PET) imaging to determine tumor regression (9).
The goal of this protocol is to describe the process of generating these transgenic mice and assessing in vivo efficacy using live PET imaging. As a note, since we use human tissues and lentiviral vectors, our facilities conform to CDC NIH guidelines for Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+). In addition, the NSG mice are severely immunocompromised thus, their housing and maintenance must conform to the highest health standards (<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a>).

The generation and characterization of tumor specific T cells using humanized mice is described here. Human thymic tissue and genetically modified human hematopoietic stem cells are transplanted into immunocompromised mice. This results in the reconstitution of an engineered human immune system allowing for in vivo examination of anti-tumor immune responses.

줄기 세포 기반 유전자 치료 종양 모델로 BLT 인간화 마우스를 사용하여

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

곤충<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 세균 Pathogenesis를 조사 할 수있는 강력한 감염 모델로

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

자연의 전송에 결핵 말라리아 동시 감염을 연구하는 실험 모델 결핵균와 변형체 berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...