엑스트라 간에서 HBV 바이러스 복제는 외형 증후군의 병인에 중요한 역할을한다. 현재, 엑스트라간 HBV 감염을 시작하기 위한 세포 배양 모델은 제한적이다. 우리는 HBV 복제에 영향을 미치는 새로운 호스트 요인을 확인하고 HBV 관련 신장 질병을 조사하는 것을 돕기 위하여 체외 비 간 감염 모형을 제시합니다.
전통적인 HBV 감염 모델에 비해, 우리는 293T 세포주, 293T-NE-3NR을 채택하고 설계하고 HepG2.2.15와 공동 배양했습니다. HBV 감염은 생물 안전 수준 2 또는 생물 안전 수준 3 실험실에서 수행되어야 합니다. 실험실 안전 관행은 실험실 직원의 안전을 보장하기 위해 따라야하며 모든 연구자들은 HBV 실험을 수행하기 전에 HBS 항체 양성 예방 접종을 하고 감지해야합니다.
HepG2.2.15 세포는 HepG2.2.15와 접촉하는 모든 팁, 플라스크, 플레이트 및 튜브뿐만 아니라 세포 상수뿐만 아니라 처리 전에 하룻밤 사이에 2 %의 비리에 담가야한다는 것을 명심하여 HepG2.2.15 세포를 배양함으로써 시작합니다. 액체 질소에서 HepG2.2.15 세포를 포함하는 유리병을 제거하고 섭씨 37도의 수조에서 부드러운 소용돌이로 해동하십시오. 25센티미터 정사각형 조직 배양 플라스크로 세포를 옮기고 완전한 배양 배지의 4밀리리터를 추가한다.
HepG2.2.15 세포를 섭씨 37도, 가습된 인큐베이터에서 이산화탄소 5%를 배양합니다. 3일마다 매체를 변경합니다. 준비가 되면 50 밀리리터 원심분리기 튜브에서 셀 상수체를 수집합니다.
뚜껑을 단단히 닫고 파라핀 필름으로 감쌉니다. 세포 조각을 제거하려면 0.45 마이크로미터 멤브레인으로 HepG2.2.15 초대형 체판을 새로운 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 필터링합니다. 그런 다음 바이러스 농축기 컬럼에 여과 된 상체 14 밀리리터를 추가하고 뚜껑을 닫습니다.
수평 회전 원심분리기에서 35분 동안 3, 200배 g의 원심분리기를 원심분리하고 HepG2.2.15 상피 농축물을 1.5 밀리리터 튜브로 수집합니다. HepG2.2.15 상수 농축액에서 HBV DNA가 표준 곡선 범위 내에 있는지 확인하기 위해 실시간 PCR을 실행합니다. 1.5 밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에 10 마이크로리터를 DMEM 190 마이크로리터에 추가하여 농축액을 20배 희석시.
상체 농축액과 함께 양적 기준의 음수 제어, 긍정적 제어 및 4개의 희석을 준비한다. 각 샘플에 HBV DNA 추출 버퍼 450마이크로리터를 추가하고 실온에서 5분 동안 12, 000배 g의 원심분리기를 추가합니다. PCR 마스터 믹스 27마이크로리터와 샘플당 Taq 폴리머라제 효소 3개소를 얼음 위에 올려놓은 PCR 튜브를 결합합니다.
그런 다음 각 튜브에 원심 분리 된 샘플의 20 마이크로 리터를 추가합니다. 원고 방향에 따라 실시간 PCR을 수행하고 CT 값을 내보내 표준 곡선을 얻습니다. HepG2.2.15 상체 농축액을 알리쿼트에 나누고 사용할 준비가 될 때까지 영하 80도에 보관하십시오.
원고 의 지시에 따라 감염 매체를 준비합니다. 그런 다음 두 개의 우물에서 HepG2-NE, 2개의 우물에서 293T-NE-3NR 세포, 그리고 293T-NE를 하나의 우물에서 시드하였다. 가습인 인큐베이터에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 세포를 24시간 동안 배양합니다.
잠복 후, 세포를 관찰하고 건강하다면 감염을 진행하십시오. 감염 복합체 500마이크로리터를 각 우물에 추가하고 세포를 24시간 동안 배양합니다. PBS의 500 마이크로 리터로 두 번 세포를 씻어.
그런 다음 각 웰에 1 밀리리터의 매체를 추가합니다. 2일마다 배지를 부드럽게 바꿉니다. 11일, PBS 500 마이크로리터로 세포를 부드럽게 씻고 면역형광을 위해 얼음 차가운 메탄올로 세포를 고정시합니다.
종자 100, 000 HepG-NE의 우물 당 세포는 두 개의 우물로, 293T-NE-3NRs는 두 개의 우물로, 플레이트의 하나의 우물에 293T-NE. 종자 100, 000 혈중 의 웰 당 000 세포 는 별도의 6 웰 플레이트에 다섯 멤브레인 삽입으로 HepG2.2.15. 세포를 24시간 동안 배양합니다.
인큐베이션 후 세포가 모두 부착되고 상태가 양호한지 확인하십시오. 6웰 플레이트및 세포막 인서츠에 배지를 폐기하십시오. 그런 다음 HepG-NE, 293T-NE-3NRs 및 293T-NE로 시드된 6웰 플레이트에 HepG2.2.15를 가진 멤브레인을 배치합니다.
가습된 인큐베이터에서 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양하여 3~4일마다 배지를 변경합니다. 10 일 후, 멤브레인 삽입을 제거하고 PBS로 세포를 부드럽게 두 번 씻고 면역 형광을 위해 얼음 차가운 메탄올로 세포를 고정하십시오. HBcAg 1차 항체 및 DAPI를 가진 배양은 형광 반전 현미경에 10X 목표로 관찰될 때 뚜렷한 염색귀 귀착되었습니다.
핵국소화는 DAPI와 NTCP-EGFP 발현을 녹색 형광으로 확인함으로써 확인되었다. HBcAg의 발현 부위는 적색 형광으로 위치했다. DAPI, NTCP 및 HBcAg가 동일한 세포에 있을 때, 세포는 HBV에 성공적으로 감염되었습니다.
사이클로스포린 A 군은 HBV가 NTCP를 차단하여 세포에 유입되는 것을 막기 때문에 음의 대조군이었다. HBcAg는 293T-NE-3NR에서 검출되었지만 NTCP를 나타내는 293T-NE 세포에서는 293T에서 HBV 감염에 필수적인 유일한 요인이 아닙니다. 좋은 세포 상태와 효율적인 작동은 성공적인 감염 결과를 얻기위한 핵심 포인트입니다.
감염 후 부드러운 세척 및 미디어 변경도 중요합니다. 대안으로, HEpG2-NE 세포를 이용한 HBV 감염 방법은 이 방법보다 감염 효율이 높고 안티 HBV 약물 스크리닝에 적합하다. 293T-NE-3NR에서 HBV 감염을 모델링하는 것은 이들 세포의 비간 배경으로 인한 전통적인 세포 모델에 유용한 칭찬이다.
이 방법은 비 간 세포에 있는 HBV 감염의 연구 결과 뿐만 아니라 HBV의 간을 위해 요구되는 호스트 요인의 연구를 촉진할 것입니다.
