이 작품은 R01 DC013339, R03 DC011373, 루스 L. 키르 국가 연구 서비스 상 T32 DC000014에 의해 지원되었다. 작품의 일부는 NIH-NIDCD 코어 부여 P30의 DC011735 자금에 의해 부분적으로 지원되는 모넬 화학 감각 수용체 신호 코어를 사용하여 수행 하였다. 저자는 데이터 수집에 대한 도움 C. Sezille 감사합니다.

Hana3A 세포의 1. 문화 <ol><li> 10 % (v / v) FBS가 최소 필수 배지 (MEM)를 보완하여 M10 미디어를 준비합니다. </li><li> 문화 유지 <ol><li> M10 미디어의 세포를 유지한다. 참고 : RTP1L, RTP2, REEP1, 및 G의 발현 벡터는 Hana3A 세포에 퓨로 마이신 내성을 부여 αolf하지만,이 항생제와 세포를 유지하는 것이 상당히 분석 결과에 영향을주지 않습니다. </li><li> 1시 8분 10 CM 요리 2-3 일마다의 비율로 서브 컬쳐. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol></li></ol> 형질 2. 도금 세포 <ol><li> Hana3A 세포의 100 % 합류 10cm 접시에서 대기음 매체. </li><li> 10 ㎖의 PBS를 추가 접시를 소용돌이, 그리고 PBS를 흡입하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 3 ㎖를 추가하고 세포가 (약 1 분) 해리까지 기다립니다. </li><li> 5 ㎖ M10를 추가하여 트립신을 비활성화하고 약 10 배 &amp;를 triturating에 의해 세포 대단히 짧은 시간을 휴식# 160; 10 ㎖ 피펫. 피펫은 조심스럽게 미디어에 공기 방울을 도입 방지 할 수 있습니다. </li><li> 각 96 - 웰 플레이트, 15 ML 원뿔 관, 5 분 200 XG에 원심 분리기로 전송 세포의 1 ㎖를, 그리고 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음하십시오. </li><li> 단계 2.5에서 전송 세포의 1 ㎖ 당 6 ㎖의 M10의 세포를 Resuspend. </li><li> 피펫 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 세포의 50 μL와 5 % CO 2와 37 ° C에서 밤새 품어. </li></ol> 후각 수용체의 3. 형질 <ol><li> 플라스미드 DNA의 준비 <ol><li> 독소가없는 프로토콜을 통해 플라스미드 DNA를 준비합니다. 참고 : 사용 플라스미드 DNA 준비 키트 지정 &quot;독소가없는&quot;또는 플라스미드 DNA 준비 프로토콜 페놀 - 클로로포름 추출 단계를 추가합니다. </li><li> TE 버퍼에 100 NG / μL의 농도로 DNA를 희석. </li></ol></li><li> 근사치의 적절한 자랄 수 있도록 도금 셀 (단계 2.7) 관찰tely 30 ~ 50도 당 % 및 인큐베이터로 돌아갑니다. 참고 :이 포화 상태가 지질 형질 전환 시약 최적은 아니지만,이 단계에서 30 % ~ 50 %의 포화 상태가 형질 전환 후 루시 페라 제 활동 24 시간을 측정하기에 최적입니다. </li><li> 형질 믹스의 제조 <ol><li> 플라스미드 혼합하기 위해 표 1에 설명 된 볼륨 당 MEM 매체에 피펫 RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE - 루크, 그리고 pSV40-RL 플라스미드 (표시된 볼륨은 96 - 웰 플레이트 일 기준). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> 플라스미드 믹스 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 물론 당 </td><td> 96 - 웰 플레이트 당 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500 μL </td></tr><tr높이 = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S-PCI </td><td> 5 NG </td><td> 480 NG </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-PCI </td><td> 2.5 NG </td><td> 240 NG </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> PCRE 뤽 </td><td> 10 NG </td><td> 960 NG </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> pSV40-RL </td><td> 5 NG </td><td> 480 NG </td></tr></tbody></table> 표 1. 플라스미드 믹스의 구성 요소. 당 잘 RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE - 루크, 그리고 pSV40-RL 및 MEM의 96 - 웰 플레이트 볼륨 당. </li><li> 각각의 96 - 웰 플레이트, 450 μL의 MEM 배지에서 18 μL의 지질 형질 감염 시약을 희석. </li><li> 피펫 플라스미드 믹스 (단계 3.3.1에서), PCI 플라스미드 (RHO-OR-PCI)에있는 로돕신 - 태그 후각 수용체와의 복잡한 상세한 수 있도록 (단계 3.3.2에서) 지질 형질 믹스 <strong&gt; 표 2. 저작하여 용액을 혼합하고 실온에서 15 분간 배양한다. 표 2에 따라 M10를 추가하여 반응을 중지 참고 :.이 반응 시간에 민감한하고 30 분 동안 계속 허용 할 수 없습니다. 잘 + 10 % 계산은 후속 단계에 충분한 양을 확보하는 것이 중요하다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> 복잡한 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> 물론 당 </td><td> 잘 + 10 % 당 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 플라스미드 믹스 </td><td> 4.2 ㎕의 </td><td> 4.58 μL </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> RHO-OR-PCI </td><td> 0.05 NG </td><td> 0.06 NG </td></tr><tr높이 = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> 지질 형질 믹스 </td><td> 4.2 ㎕의 </td><td> 4.58 μL </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41.7 μL </td><td> 45.83 μL </td></tr></tbody></table> 표 2. 복잡한 구성 요소. 당 잘 플라스미드 믹스 (표 1)도 + 10 % 볼륨 당, 후각 수용체 플라스미드 (RHO-OR-PCI) 및 지질 형질 혼합. M10을 실온에서 15 분간 인큐베이션 다음 가하여 반응을 급냉된다. </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> 셀 플레이트에서 미디어를 누르십시오. </li><li> 피펫 50 개 각 단지의 μL와 5 % CO 2와 37 ° C에서 밤새 품어. </li></ol> 4. 냄새 자극 <ol><li> 물론 당 50~80%의 적절한 자랄을 보장하고 인큐베이터로 돌아 형질 전환 세포를 관찰합니다. 참고 : 세포는 50 미만 경우% 합류, 반딧불 루시 페라 제와 레 닐라 루시퍼 라 아제 수치는 수용체 활성화의 측정에 너무 낮을 수 있습니다. 플레이트를 폐기하는 것이 좋습니다. </li><li> DMSO의 각 냄새의 1 M 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> CD293 매체의 냄새 자극 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 심사 실험을 위해, 100 μM로 냄새의 원액을 희석. 또한 (만 CD293) 또는 배경의 활성화를 위해 제어하기 위해 노 악취 제어를 준비합니다. 주 : 검사 실험의 경우, 각 OR / 냄새 쌍은 실험에 한 번 테스트됩니다. 우물에서 약간의 냄새 확산이 가능하기 때문에, 각 플레이트에 대해 하나의 악취 물질과 자극하는 것이 좋습니다. </li><li> 용량 반응 실험을 위해, 세중의 각 수용체에 1 ㎜부터 시작하여 냄새 원액의 7-10 배 희석으로 준비하고 있습니다. 또한 냄새 배경 활성화를 위해 제어하기 위해 빈 벡터 형질 세포에 대한 세중 같은 악취 희석을 준비합니다. NOTE : 용량 반응 실험을 위해, 각각의 ODOR 농도 처리 중으로 실시해야한다. </li></ol></li><li> 셀 플레이트에서 미디어를 누르십시오. </li><li> 피펫 (25)도 각각 냄새 자극 솔루션의 μL하고 4 시간 동안 배양한다. </li></ol> 루시 페라 제 분석을 통해 5. 측정 또는 활동 <ol><li> -80 ° C에서 제조업체의 지침과 상점 당을 Resuspend 반딧불 루시 페라 제 기판 </li><li> 96 - 웰 플레이트 당 반딧불 루시퍼 기판의 1 ml에 녹여. </li><li> 끄는 신선한 반딧불 루시 페라 제 반응을 준비하고 레 닐라 루시퍼 기판 시약 (버퍼 1 ㎖ 당 5 μL 루시퍼가 끄는 / 레 닐라 루시퍼 기판). 참고 : 시약의 약 1 ㎖를 96 - 웰 플레이트 당 필요합니다. </li><li> 발광 마이크로 플레이트 리더를 준비합니다. 마이크로 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니 다. 시스템 아이콘 내 : <ol><li> &quot;예열&quot;탭에서 &quot;ON&quot;에 대한 확인란을 선택하고 25 °에 기계의 온도를 설정; C. </li><li> &quot;분배기&quot;탭에서, 70 % 에탄올 1,000 μL 프라임 각각의 디스펜서 증류수 1,000 μL 하였다. 참고 : 각 디스펜서 알코올과 물을 분리 분취를 사용합니다. 에탄올은 디스펜서를 살균하는 데 사용하고, 물을 잔류 에탄올을 제거한다. </li><li> 프라임 공기의 1,500 μL 각 디스펜서 (액체에서 디스펜서를 제거). 참고 : 공기로 프라이밍은 루시 페라 제 기판을 잔류 물에 희석되지 않도록합니다. </li><li> (단계 5.2) 반딧불 루시 페라 제 기판의 1,080 μL 프라임 디스펜서 1. (단계 5.3에서) 레 닐라 루시퍼 기판 프라임 디스펜서 2. 참고 : 교차 오염 루시 페라 제의 기판에주의하십시오. 루시 페라 제 기판과 프라이밍 시약 디스펜서의 죽은 공간을 채 웁니다. </li></ol></li><li> 모두 개똥 벌레와 레 닐라 루시퍼 라제 발광을 읽을 수있는 다음과 같은 프로토콜을 설정합니다. 마이크로 플레이트 리더, UN과 관련된 소프트웨어 내&quot;파일&quot;메뉴를 데르, &quot;새 작업&quot;을 클릭합니다. &quot;프로토콜&quot;을 선택하고 &quot;새로 만들기&quot;를 클릭합니다. 다음 창에서, 다음 &quot;표준 프로토콜&quot;에 원을 선택해야합니다. &quot;OK&quot;를 클릭하십시오. 화면의 왼쪽에 &quot;절차&quot;를 두 번 클릭합니다. <ol><li> 디스펜서를 사용하여 모든 우물에 반딧불 루시 페라 제 기판의 10 μl를 분배합니다. &quot;작업&quot;메뉴에서 &quot;분배&quot;를 클릭합니다. &quot;분배 단계&quot;창에서 설정 : 없음, 10 μL에 &quot;분배 량&quot;225 μL / 초 &quot;속도&quot;에 &quot;마중물&quot; &quot;분배기&quot;1. &quot;OK&quot;를 클릭합니다. </li><li> 30 초 동안 판을 흔들어. &quot;작업&quot;메뉴에서 &quot;떨림&quot;을 클릭합니다. SS : &quot;흔들어 단계&quot;창에서, 중간 및 0시 반 MM에 &quot;시간&quot;을 &quot;강도&quot;로 설정합니다. &quot;OK&quot;를 클릭합니다. </li><li> 물론 당 0.5 초에 대한 모든 우물의 발광을 읽어보십시오. &quot;작업&quot;메뉴에서 &quot;보기&quot;를 클릭합니다;. &quot;읽기 단계&quot;창에서 설정 : 발광에 &quot;검출 방법&quot;, 0시 0분 50초 MM에, 엔드 포인트에 &quot;통합 시간&quot;을 &quot;유형을 읽기&quot;: SS : 초, &quot;필터 세트&quot;1, &quot;방출&quot; 홀에, Top 호텔 &quot;광학의 위치&quot;, 135 &quot;이득&quot;및 1.00 mm로 &quot;높이 읽기&quot;. &quot;OK&quot;를 클릭합니다. </li><li> 디스펜서 2를 사용하는 모든 우물에 레 닐라 루시퍼 기판의 10 μl를 분배합니다. 세트 &quot;분배기&quot;2를 제외하고, 단계 5.6.1에서와 같이 조건을 설정합니다. </li><li> 30 초 동안 판을 흔들어. 5.6.2 단계에있는 등의 조건을 설정합니다. </li><li> 0.5 초에 대한 모든 우물의 발광을 읽고 잘 당. 5.6.3 단계에있는 등의 조건을 설정합니다. </li></ol></li><li> 96 - 웰 플레이트에서 뚜껑을 제거하고 마이크로 플레이트 리더에 접시를 놓습니다. 플레이트 발광을 읽는 단계 5.5에서 설정 프로그램을 시작합니다. </li><li> 시약 디스펜서 펌프를 청소합니다. &quot;분배기&quot;탭에서 시스템 아이콘에서 : <ol><li> F 1000 μl를 제거복구 튜브에 반딧불 루시 페라 디스펜서에서 irefly 루시 페라 제의 기판. 참고 : 반딧불 루시 페라 제는 -80 ° C에서 저장 및 재사용 할 수 있습니다. </li><li> 프라임은 70 % 에탄올 1,000 μL에 증류수 1,000 μL,, 그리고 마지막으로 공기의 1,500 μL 각 디스펜서 (액체에서 디스펜서를 제거). 참고 : 물이 시약 펌프, 에탄올 소독, 공기가 잔류 에탄올 건조에서 루시 페라 제의 기판을 제거합니다. </li></ol></li></ol> 6. 데이터 분석 <ol><li> 데이터 내보내기 <ol><li> 마이크로 플레이트 리더 소프트웨어, 화면의 왼쪽에있는 &quot;보고서 / 내보내기 건축&quot;을 두 번 클릭합니다. </li><li> 버튼 &quot;Excel로 새로운 수출&quot;을 클릭하고 &quot;확인&quot;을 클릭합니다. </li><li> EXPORT1을 선택하고 &quot;편집&quot;을 클릭합니다. <ol><li> &quot;콘텐츠&quot;의 &quot;시스템 설명&quot;확인 &quot;절차&quot;, &quot;플레이트 설명&quot;및 &quot;플레이트 레이아웃 매트릭스&quot;에서. &quot;원시 데이터&quot;를 포함ND &quot;데이터를 계산&quot;. </li><li> &quot;워크 플로&quot;에서 &quot;절차의 완료시 자동 실행&quot;을 확인합니다. 수출 모드에서, &quot;모두 같은 통합 문서에있는 판&quot;과 &quot;새 워크 시트로&quot;를 확인합니다. </li><li> &quot;파일&quot;파일 이름 형식 및 파일 위치를 선택하고 &quot;확인&quot;을 클릭에서. </li><li> &quot;보고서 / 내보내기 빌더&quot;창을 닫습니다. </li></ol></li></ol></li><li> 정규화 루시 페라 제 값을 얻으려면, 각 웰의 레 닐라 발광 읽기 (단계 5.6.6)에 의해 각 웰의 반딧불 루시 페라 제 발광 읽기 (단계 5.6.3)를 나눕니다. </li></ol>

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R., Hughes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Ligands+for+Olfactory+Receptors.">Identification of Ligands for Olfactory Receptors.</a> Cell. 95, 917-926 (1998).</li><li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling.">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Science signaling. 4 (155), (2011).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells.">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li><li>Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metric+for+odorant+comparison.">A metric for odorant comparison.</a> Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).</li><li>Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Receptors:+From+basic+science+to+applications+in+flavors+and+fragrances.">Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances.</a> Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).</li><li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system.">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li><li>Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptor+map+in+the+mouse+olfactory+bulb:+in+vivo+sensitivity+and+specificity+of+receptor-defined+glomeruli.">Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli.</a> Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).</li><li>Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor.">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li><li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons.">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors.">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li><li>McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+odorant+receptor+OR2J3+is+associated+with+the+ability+to+detect+the+&amp;#34;grassy&amp;#34;+smelling+odor,+cis-3-hexen-1-ol.">Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the &amp;#34;grassy&amp;#34; smelling odor, cis-3-hexen-1-ol.</a> Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).</li><li>Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evolution+of+mammalian+odorant+receptors.">Functional evolution of mammalian odorant receptors.</a> PLoS genetics. 8 (7), (2012).</li><li>Zhuang, H., Chien, M. -. S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+functional+evolution+of+an+odorant+receptor+for+sex-steroid-derived+odors+in+primates.">Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).</li><li>Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+odorant+derivative+as+an+antagonist+for+an+olfactory+receptor.">An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor.</a> Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).</li><li>Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+receptor+antagonism+between+odorants.">Olfactory receptor antagonism between odorants.</a> The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).</li><li>Fawcett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+ROC+analysis.">An introduction to ROC analysis.</a> Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).</li><li>Baghaei, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Receptors.">Olfactory Receptors.</a> Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).</li><li>Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+surface+expression+of+chemosensory+receptors+in+heterologous+cells.">Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).</li></ol>

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악취 물질 ID는 후각 수용체 활성화 패턴에 의해 인코딩되어 있지만 수용체가 활성화되고 어느 정도에하는 등의 수용체 활성화 패턴은, 인간의 후각 수용체 1-11 미만 6 % 알려져있다. 후각 수용체를 특성화하기위한 노력이 후각 수용체 가족 17,23,24,33,34의 서브 세트 만에 자신의 노동 집약적 인 방법이나 적용에 의해 제한되었다. Hana3A 이종 발현 시스템은 시험 후각 수용체의 대부분...

포유 동물의 후각 시스템은 탐지 및 취기 수천 차별을 허용 악취 자극의 광대 한 수에 응답 할 수있는 능력을 갖는다. 후각 (논리합)는 후각 상피 (12)에서 후각 감각 뉴런에 의해 표현 분자 센서이다. 포유 동물의 냄새를 인식 취기에 의한 관찰 보고서의 차등 활성화를 통해 발생하고 또는 유전자 가족은 대략 1,000 쥐 400 인간의 수용체 12-16으로 광범위하다. 후각 신경 세포 및 이종 세포에서 관찰 보고서의 이전 기능 분석은 다른 냄새 물질은 고유 한 인식하는 것으로 나타났습니다하지만, 관찰 보고서 10,17-20의 앙상블을 겹쳐있다. 관찰 보고서에 리간드를 매칭 후각 코드와 후각의 실행 가능한 모델을 구축하기위한 핵심을 이해하는 것이 중요합니다. 인해 취기 및 논리합 모두의 다수뿐만 아니라 이종 시스템에서 논리합을 표현하는 어려움이 데이터는 F에서 큰폭 결석왔다ield; 참으로, 인간의 관찰 보고서 미만 6 % 게시 된 리간드 1-11있다. 이 프로토콜은 취제 / OR 상호 작용을 특성화하는 루시페라아제 분석의 사용을 설명한다. 이 분석은 논리합의 높은 처리량 특성화 취제 / OR 상호 작용을 이해뿐만 아니라 악취 코딩 모델을 개발에 필수적인 작업을 가능하게한다. 관찰 보고서의 높은 처리량 연구는 세 가지 주요 과제에 직면하고 있습니다. 첫째, 이종 세포에서 발현 관찰 보고서는 ER에 유지하고, 이후 분석 시스템 23-25에서 냄새 물질과 상호 작용에서 관찰 보고서 방지, 프로 테아 솜 (21, 22)에서 분해. 이 문제는 논리합 19,26,27 광범위한 안정된 세포 표면 발현을 촉진 소품 단백질의 발견에 의해 해결되었다. 수용체 - 수송 - 단백질 1과 2 (RTP1 2) 쇼핑 후각 자극 (19)에 대한 응답으로 세포 표면 발현 및 활성화. 본 작업에 기초하여, HEK293T 세포되었습니다안정적으로 Hana3A 세포주 19,27 결과 RTP1 긴 (RTP1L) 및 RTP2, 수용체 발현을 향상시키는 단백질 1, 및 G의 αolf을 표현하기 위해 수정. 또, 분류 3 무스 카린 성 아세틸 콜린 수용체 (M3-R)는 세포 표면에서 관찰 보고서와 상호 작용 및 취기 제 (26)에 응답하여 활성화를 향상시킨다. 세포 표면 27에서 관찰 보고서의 넓은 범위의 강력한 일관성 및 기능 식 Hana3A 세포 결과에 RTP1S와 M3-R와 OR의 공동 형질. 둘째, 포유 동물 또는 레퍼토리는 매우 크다. 인간에서는, 예를 들면, OR 레퍼토리는 미각 수용체 레퍼토리보다 다양한 크기의 순서이며, 시각 수용체 레퍼토리보다 다양한 크기의이 순서. 하나의 복제 또는 것은 비교적 간단한 프로토콜이지만, 중요한 선행 노력이 포괄적 인 라이브러리를 생성하기 위해 필요합니다. 우리는 비전을 알고 있지만, 셋째, 파장은 색상으로 변환하고오디션 주파수 피치로 변환에, 냄새의 조직은 가난 어려운 연구자의 냄새 물질의 대표 샘플에서 보간하기 위해 만드는 이해된다. 일부 진전이 전면 10,28에 만들어진 있지만, 후각 풍경의지도가 불완전 남아있다. 관찰 보고서의 수백에 수십 분자의 수천을 상영하는 것은 어려운 작업입니다; 이 도메인의 높은 처리량 화면을주의 깊게 정의 캠페인을 필요로한다. 주요 남은 문제는 오히려 기술에 내재 된 문제보다 물류 비용의 사람입니다. 이종 스크리닝 폭넓게 학술기로 리간드를 식별하는 데 사용되지 않았지만, 개인 회사 100 인간 논리합 29 대한 리간드를 식별하는 동일한 기술을 사용하고있다. 불행하게도, 이러한 데이터 독점 남아있다. 여기에 설명 높은 처리량 루시 페라 제 분석은 평가 또는 활성화하는 데 사용되는 다른 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 비록 respon기본 후각 감각 뉴런의 SES는 전기 생리학과 칼슘 이미징을 사용하여 측정 된이 기술은 어려움으로 인해 후각 신경 세포에 대한 응답 특성의 중첩에 신경 세포의 반응에 이르게 또는 떨어져 괴롭 히고있다. , GFP - 라벨 수용체 타입 (30, 31)에서 노킹 (32, 33) 후각 신경 세포를 생쥐에 아데노 바이러스를 통해 특정 수용체를 제공, 또는 17,24,33 단일 수용체의 종류에 녹음을 링크 할 수 있습니다 녹음 한 후 RT-PCR을 수행,이 방법은 있지만 낮은 처리량과 대형 화면에 적합하지 않습니다. 이종 검사 시스템은 확장 성, 그리고 두 가지 주요 형태는 문헌에서 찾을 수 있습니다 : 캠프 통로 기자 이노시톨 인산염 (IP3) 통로 기자. 냄새 자극에, 관찰 보고서는 고리 AMP (캠프) 12의 생산 결과 G의 αolf 전달 신호 폭포를 활성화합니다. AC의 제어 하에서 반딧불 루시퍼 라제 리포터 유전자를 공동 형질 작성자AMP 반응 요소 (CRE), 루시퍼 라제 생산 부량 OR 활성화를 허용 악취 응답의 함수로서 측정 될 수있다. 또는 활성화 또한 G α15/16 또는 G의 α15-OLF 키메라 24,25,34 등의 G-단백질을 공동으로 표현하여 IP3 경로에 연결할 수 있습니다. 우리는 세 가지 요인에 따라 여기에 제시된 분석을 선택했습니다 : RHO-태그 후각 수용체와 RTP1 (1) 공동 발현 세포 표면 19,27의 후각 수용체의 발현을 향상을; (2) 캠프 응답 리포터 유전자의 사용은 측정 또는 정규 두 번째 메신저 경로를 통해 활성화 할 수 있습니다; (3) 분석은 높은 처리량 스크린에 매우 적합하다. 이것은 높은 처리량 루시퍼 라제 분석은 후각의 분야에 유용한 다양한 연구에 적용 할 수있다. 우선, 관찰 보고서의 다수의 SP에 대한 수용체 활성화 패턴을 결정하기 위해 단일 ​​취제에 대해 스크리닝 할 수있다ecific 악취 물질. 이런 종류의 연구는 스테로이드 악취 물질 androstenone 8에 응답 또는 책임으로 OR7D4을 확인했다. 반대로, 하나의 OR은 수용체 응답 프로파일 (10)을 결정하기 위해 방향제의 패널에 대해 스크리닝 할 수있다. 후보 후각의 취제 / OR 쌍이 이러한 화면을 통해 확인 될 때​​, 상호 작용의 증가 취제 농도 OR의 응답을 검사하는 투여 량 반응 실험을 수행함으로써 확인 될 수있다. 용량 반응 곡선은 OR에있는 유전 변이가 체외 후각 응답 8,9,11,35에 미치는 영향을 평가할 수 있으며, 이러한 연구는 진화의 종류 및 원인 돌연변이를 통해 수용체 진화의 시험을 허용, 종간 또는 변화에 확장 될 수있다 36, 37는, 마지막으로,이 분석은 길항 할 수 또는 알려진 후각 / 수용체 쌍 (38, 39)에 대한 특정 악취 물질에 대한 응답이다 냄새 길항제에 대한 화면으로 사용할 수 있습니다. 요약하면, 이러한 높은처리량 루시페라아제 분석법 특성화 OR 활성화 패턴 및 후각 시스템에서 악취 코딩의 더 나은 이해를 제공 할 것이다 연구의 범위에 적용 가능하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:685px;" width="685">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Hana3A cells</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">RTP1S-pCI</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">M3-R-pCI</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">pCRE-luc</td>
			<td style="width:135px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">219076</td>
			<td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">pSV40-RL</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2231</td>
			<td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Media, Eagle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4655</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp;region=US">MEM</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-16000044">FBS</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td><a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin (0.05% Trypsin EDTA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product">Trypsin</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">CD293</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11913-019</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019?ICID=search-11913019">CD293</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">96 well PDL white/clear plate</td>
			<td style="width:135px;">BD BioCoat</td>
			<td style="width:119px;">356693</td>
			<td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">plates</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019?ICID=search-11668019">Lipofectamine</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2980</td>
			<td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&amp;__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&amp;__utmx=-&amp;__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy S2&#160;</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SLAD</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Gen5</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIOSTACK</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">BIOSTACK2WR</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Multiflo</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">MFP</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">300ul GripTips</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">4433</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">12.5ul GripTips</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">4414</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">300ul GripTips ViaFlo96</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">6433</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">12.5ul GripTips 384 XYZ</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">6403</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384ViaFlo</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td>6030</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740797.1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp;region=US">DMSO</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-CN100-0010</td>
			<td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity

취기 약 1,000 쥐 400 인간의 수용체의 가족이 냄새 물질의 수천을 인식 할 수 있도록, 후각 수용체 활성화의 독특하고 중복 패턴을 만들 수 있습니다. 악취 물질 리간드는 인간의 수용체 1-11 미만 6 %에 발표되었다. 데이터의 부족은 일부 기능 이종 시스템에서이 수용체를 발현하는 어려움 때문이다. 여기서, 우리는 루시퍼 라제 리포터 분석을 이용하여 후각 수용체 활성화의 높은 처리량 평가 하였다 Hana3A 세포 후각 수용체 패밀리의 대부분을 표현하기위한 방법을 설명한다. 이 분석은 후각 수용체의 패널에 대하여 취기 (1)의 화면 패널에 사용될 수있다; (2) 용량 반응 곡선을 통해 취제 / 수용체 상호 작용을 확인; (3) 수용체 변이체 구비 수용체 활성화 수준을 비교한다. 우리의 샘플 데이터에서 328 후각 수용체 (26)의 냄새 물질에 상영되었다. 다양한 응답 점수 후각 / 수용체 쌍 SELEC했다테드 및 용량 반응 시험. 이 데이터는 화면이, 악취 물질에 대한 선의의 진실 반응이, 즉 수용체를 용량 반응 실험을 통과 할 후각 / 수용체 쌍에 대해 풍부하게 할 수있는 효과적인 방법임을 나타냅니다. 따라서, 이러한 높은 처리량 루시페라아제 분석법은 포유 동물의 후각 시스템 악취 코딩 모델 향해 후각 수용체-필수적인 단계를 특성화하는 효과적인 방법이다.

기본 화면이 100 μM의 농도에서 26 냄새에 328 관찰 보고서를 테스트했다. 이 냄새의 농도를 효과적으로 알려진 리간드 (10)와 관찰 보고서의 큰 비율을 활성화하기 위해 입증되었습니다. 먼저 정규화 루시퍼 라제 활성은 레 닐라 루시퍼 라제 판독함으로써 반딧불 루시페라아제 판독 나누어 계산 하였다. 다음으로,베이스 라인 값은 각 웰 (그림 1)에 대한 표준화 된 루시 페...

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High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

후각 수용체 활성화 패턴 악취 ID를 인코딩하지만, 포유 동물의 후각 수용체 리간드 취제를 식별 발행 데이터의 부족은 악취 코딩의 광범위한 정보 모델의 개발을 방해한다. 이 프로토콜은 후각 수용체 리간드 및 수용체 활성화의 정량 높은 처리량의 식별을 용이하게하는 방법을 설명한다.

루시 페라 제 활동을 통해 수용체 활성화의 측정 : 포유류의 후각 수용체의 높은 처리량 분석

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

high-throughput-analysis-mammalian-olfactory-receptors-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.3K 조회수.  Monell Chemical Senses Center.  후각 수용체 활성화 패턴 악취 ID를 인코딩하지만, 포유 동물의 후각 수용체 리간드 취제를 식별 발행 데이터의 부족은 악취 코딩의 광범위한 정보 모델의 개발을 방해한다. 이 프로토콜은 후각 수용체 리간드 및 수용체 활성화의 정량 높은 처리량의 식별을 용이하게하는 방법을 설명한다. 

비디오: High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

슬라이스 준비, Organotypic 조직 Culturing과 Suprachiasmatic 핵의 시계 유전자 활동의 루시페라제 녹음

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

연구

신경과학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

초점 방사선 억제와 성인 시상 하부의 신경 발생의 기능 심문

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM 이미징 및 FIMtrack : 높은 처리량 및 비용 효율적인 로코 분석을 허용하는 두 가지 새로운 도구

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to perform receptor autoradiographic mapping.
Tissue specimens are harvested and stored at -80 &#176;C. A cryostat is used to coronally section the tissue (brain) and thaw-mount the sections onto charged slides. The slide-mounted tissue sections are incubated in 125I-SI-Ang II to radiolabel Ang II receptors. Adjacent slides are separated into two sets: &#39;non-specific binding&#39; (NSP) in the presence of a receptor saturating concentration of non-radiolabeled Ang II, or an AT1 Ang II receptor subtype (AT1R) selective Ang II receptor antagonist, and &#39;total binding&#39; with no AT1R antagonist. A saturating concentration of AT2 Ang II receptor subtype (AT2R) antagonist (PD123319, 10 &#181;M) is also present in the incubation buffer to limit 125I-SI-Ang II binding to the AT1R subtype. During a 30 min pre-incubation at ~22 &#176;C, NSP slides are exposed to 10 &#181;M PD123319 and losartan, while &#39;total binding&#39; slides are exposed to 10 &#181;M PD123319. Slides are then incubated with 125I-SI-Ang II in the presence of PD123319 for &#39;total binding&#39;, and PD123319 and losartan for NSP in assay buffer, followed by several &#39;washes&#39; in buffer, and water to remove salt and non-specifically bound radioligand. The slides are dried using blow-dryers, then exposed to autoradiography film using a specialized film and cassette. The film is developed and the images are scanned into a computer for visual and quantitative densitometry using a proprietary imaging system and a spreadsheet. An additional set of slides are thionin-stained for histological comparisons.
The advantage of using receptor autoradiography is the ability to visualize Ang II receptors in situ, within a section of a tissue specimen, and anatomically identify the region of the tissue by comparing it to an adjacent histological reference section.

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

안지오텐신 II 수용체의 현지화 시각화에 대한 수용체자가 방사선 프로토콜

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.