이 작품은 다음에서 RAW로 자금에 의해 지원되었다 : 건강의 국립 연구소는 K01 DK083512, DP2 OD008470 및 R01 DK100237을 부여; 십센트 바 오코너 초보 학술 보조금 수상 # 5 - FY12-75 년 3 월; 과학 및 생물 과학학과의 노트르담 대학의 대학에서 기금을 시작; 그리고 갤러거 가족을 대신하여 엘리자베스와 마이클 갤러거에서 노트르담 대학에 관대 한 선물은 줄기 세포 연구를 촉진한다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비에서 어떤 역할을 없었다. 우리는 그들의 지원을 위해 생명 과학의 부서의 직원을 감사하고, 우리의 제브라 피쉬 식민지의 보호 및 복지에 뛰어난 헌신 노트르담 Zebrafish의 연구 센터. 마지막으로, 우리는이 작품에 대한 자신의 의견, 토론과 통찰력에 대한 우리의 연구 실험실의 구성원을 감사드립니다.

저자가 공개하는 게 없다.

여기서는 성인 지브라 피쉬의 네프론 세그먼트 성분의 시각화를 가능하게 방법을 설명 하였다. 형광 덱스 트란 복합체의 주입이 근위 세뇨관 세포 30,38의 세포 내 이입 특성으로 인해 특혜 PCT 라벨링을 할 수 있습니다. 이 방법 때문에 다른 형광 결합체 떼 얻을 수있다 덱스 트란의 존재를 매우 유연 수행 될 수있다. 보조 라벨 절차가 요구되지 않기 때문에 또한, 라이신 정착 덱스 트란의 사용은, PCT 세그먼트에 레이블 특히 편리하다. 이것은 비교적 간단한 신호 검출을 가능하게하고 많은 다른 형광 라벨, immunolabeling 및 트랜스 제닉 리포터 라인의 사용과 호환 가능하다. 알카라인 포스파타제는 또한 PST에서 PCT 강한 반응성이 약간 약한 반응성, 근위 세뇨관을 표시합니다. 마지막으로, DBA 염색 채널을 표시 원위 세뇨관 세그먼트의 표시를 할 수 있습니다aracteristic는 형태를 분기. 면역성 원산지 설탕 결합 단백질 아르 다양한 렉틴 분자, 포유 동물 네프론 세그먼트 47을 구별하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 그것은이 포유 동물의 신장 47에서 수집 덕트를 표시하는 데 사용되는 것과 제브라 피쉬의 DBA는 원위 세뇨관 세그먼트와 관련이 있다는 흥미로운 일이다. 종합적으로, 이들 방법은 조성물 및 신장 기능을 문서화하는 다양한 조합으로 사용될 수있다. 이들 방법 모두는 전체 신장 제제에 사용될 수 있기 때문에, 이들은 전적으로 더 시간 소모적 인 지루한 방법, 예를 들면, 동결 절단 (Cryosections) 작업과 immunolabeling의 사용에 의존하지 않고도 장기에 걸쳐 네프론의 구조와 기능을 평가하는 툴을 제공한다. 그러나,이 방법 문서에서 설명 얼룩을 동결 절단 (Cryosections)에서 실행 가능하다. 동결 절단 (Cryosections) 분석은 면역 조직 화학 특정 pepti을 감지하기에 더 적합합니다 (전체 마운트에 비해) 샘플을 생성DES는 물론 비록 이러한 유형의 분석은 적절한 일차 항체의 가용성을 필요로한다. 불행하게도 제브라 피쉬 동물 모델 작업에서 하나의 주요 제한은 항체의 가난한 가용성 남아있다. 따라서 WISH는, 즉, 가장 널리 사용되는 유지 &#39;고우에&#39;유전자 발현 분석을위한 절차. 보라색 ​​또는 적색 침전물을 생성 BCIP, NBT, 및 / 또는 기판 INT 반응을 이용하면 WISH 저온부에 형광 염색법과 호환되지. 하나의 옵션은 형광 검출 WISH, 제브라 피쉬 배아 샘플을 위해 최적화되었으며 성인 신장 함께 사용하도록 맞추어 질 수있는 절차의 사용을 호출하는 것이다. 이 비디오 문서의 방법에 대한 설명은 각각의 세그먼트가 같은 eGFP는 또는 mCherry 등의 기자로 표지 된 형질 전환 제브라 피쉬 라인과 함께 형광 WISH 같은 기술을 추가 실험을 허용해야합니다. 대안 적으로, 방법은 여기에 기재된 coul다른 중요한 염료, 예를 들어, 다른 렉틴와 함께 테스트를 할 거라고. 따라서, 상기 적응 및 여기에 기술 된 방법의 확장은 전체의 마운트 신장 준비 및 분석을위한 연구자의 필요에 따라 호출 될 수있다. 따라서,이 방법은 지속적인 재생 연구 제브라 피쉬 모델 구현 및 유전 적 질병 모델링 광범위한 잠재력을 가지고있다. 신장 고통 혁신적인 연구 및 치료에 대한 필요성이 높아지고있다. 수백만 명의 사람들이, 선천성 급성 및 / 또는 만성 원인의 결과 매년 신장 질환의 일부 양식에서 고통 받고 있습니다. 또한, 신장 질환의 유병률은 이러한 질병 글로벌 공중 보건 문제 (14, 15)을 전 세계적으로 증가하고 있습니다. 외부 투석 기계가 자신의 신장이이 역할을 수행 할 수없는 경우 신진 대사 폐기물의 환자의 혈액을 제거하는 역할을함으로써 이러한 혈액 투석 등의 치료를 사용할 수 있습니다. 불행하게도지속적인 치료가 생존을 위해 필요하므로이 개입, 제한 사항이 있습니다. 또한, 환자는 결국 환자가 대기자 명단에 배치되면받을 수 년이 걸릴 수있는 신장 이식을 필요로 할 것이다. 심지어 신장 이식을 획득 한 후, 많은 환자는 프로 시저의 결과로 부작용을 고통과 그들의 삶의 나머지 부분에 대한 이러한 효과를 전투해야합니다. 이러한 어려움은 신장 질환을 예방 혹은 조직 재생 8,16,52,53을 확대하는 데 도움이 중 하나를 새로운 치료법의 개발에 대한 심각한 필요성을 보여줍니다. 생물 의학 실험실에서 인간 피험자의 사용의 명백한 윤리적 한계를 감안하면, 동물 모델은 인간 질병의 발병 기전 연구를위한 새로운 치료법의 테스트를 위해 필수적이다. 그 해부학 적 유사성 진화 근접성 결과, 마우스는 인간의 질병 (45)의 모델에 가장 널리 사용되고있다. 그러나이 동물과 특정 제한 includ,가무능력을 보내고 것은 생체 내 및 대규모 유전자 스크린을 완성 실용성 장기 개발을 시각화한다. 제브라 피쉬는 인간의 질병 45, 46의 장기 개발 및 모델링 연구를위한 적절하고 유용한 모델 생물이다. 인간의 질병에 관해서는, 제브라 피쉬의 기능 동족체는 인간의 모든 유전자 (54, 55)의 약 70 % 존재한다. 최근 연구는 신장 연구 31,37,56 여러 지역의 제브라 피쉬의 유용성을 강조하고있다. AKI 후 제브라 피쉬의 재생 및 수리의 연구는 세관 상피 재생 및 neonephrogenesis가 발생 30,37 timecourse 재생에 걸쳐 중복이 프로세스가 있음을 시사한다. 아미노 글리코 사이드 항생제라는 겐타 마이신의 사용은 성인 제브라 피쉬 29,30,37에서 AKI의 결과를 연구를 통해 부상 패러다임으로 활용되고있다. 겐타 마이신에서 약 2 주간의 기간에 다음과 같은 부상에 걸쳐, 근위부 tubul에스 다시 생성하고, 그 사이에 새로운 네프론은 장기 29,30,37에 걸쳐 형성한다. 일반적으로, 상피 재생을 조절하는 메커니즘이 매우 논란 남아있다. 복구 프로세스의 일 제안 된기구에서, 루멘으로 사균의 벗기이어서 초기 급성 부상 이벤트가있다. 다음으로, 새로운 세포가 분화 한 후, 역 분화, 증식 및 마이그레이션 일련의 이벤트, 부상 기저막을 다시 채우기 및 부상 사이트에 기능을 복원을있다. 또한, 다른 연구는 대체 세포가 네프론의 세관 내에 상주 줄기 / 전구 세포에서 발생하는 것을 제안했다. 제브라 피쉬에 neonephrogenesis의 프로세스에 관해서는, 세포 응집체 29,30 겐타 마이신 주입하여 다음 AKI 관찰되었다. 이 집계는 나중에 기존 세관 (29, 30)에 연결 (plumb) 새로운 네프론에 성숙. 네프론 상피 재생 및 neonephr을 통합하는 공통점ogenesis는 깎아 지른듯한 미스터리 요소 : 현재이 재생 업적을 사용할 수 통찰력이보다 발생 방법에 대한 기하 급수적으로 더 많은 질문이 있습니다. 그러나 현재까지의 증거 몇 가지 흥미로운 라인은 제브라 피쉬를 사용하여 신 재생 조사 사실도 직접 번역 잠재적 인 56-58가있을 수 있습니다 인간의 AKI에 관련 비교 통찰력을 제공 할 수있는 개념을 지원합니다. 화학적 스크리닝 최근 히스톤 데 아세틸 라제 억제제 메틸 4 - (페닐 티오) -butanoate (m4PTB) 56,57 식별되었다 제브라 피쉬 배아 신장 전구 세포의 증식을 증가 작은 분자의 동정을 행 하였다. 겐타 마이신에 의한 AKI와 제브라 피쉬의 유충이 화합물의 관리 애벌레의 생존이 증가하고 신 세뇨관 증식 (56, 58)를 향상되었습니다 것으로 나타났습니다. 중간 허혈 유발 AKI와 마우스가 m4PTB로 처리되었을 때, 자신의 회복 ASSOC 가속화되었다세뇨관 세포 증식 (58)의 양쪽 관상 위축 및 세포주기 정지에 감소 iation. 이러한 연구 결과는 정상적인 제브라 피쉬의 신장 개발 및 / 또는 AKI에 회생 응답에 책임이있는 경로는 포유류 56과 보존된다는 것을 시사한다. 따라서, 더 많은 연구가 관여하는 신호 전달 경로를 확인하고 상호 작용 - 제브라 피쉬는 신장학 분야에서 중요한 목표를 추구하는 하나의 약속 수단을 제공 이해하는 재생 - 즉의 메커니즘을 떨어져 애타게하는 데 필요한있다. 이와 프로토콜에 설명 네프론 셀 라벨 같은 도구 AKI 모델에서 신장 조성물 및 기능성을 평가하기 위해 이용 될 수 분석법 중 하나기를 나타낸다. 또한, 이들은 신장 질환의 트랜스 제닉 모델을 특성화하기 위해 적용 할 수있는 신장 네프론 후 댐 구조의 복원을 촉진 할 수있는 화학 치료제를 식별하는 방법을 제공 할 수있다연령.

신장은 체내에서 생리 기능의 다수를 만족 복잡한 기관이다. 신장의 가장 중요한 기능은 신진 대사 폐기물 배출하고,이 작업은 밀접하게 유체 항상성의 유지와 얽혀있다. 신장 병용 혈압, 전해질 수준, 산 - 염기 평형을 조절하면서, 혈액을 여과하고 소변을 형성하여 이러한 작업을 수행한다. 네프론이라는 고도의 전문 상피 세관은 신장 1, 2의 기본 기능 단위의 역할을한다. 성인 척추 동물에서 네프론은 일반적으로 많은 세관은 매우 작은 장기로 포장하는, 따라서 수 있도록 중앙 집중식 배수 시스템을 둘러싼 단단히 코일 배열로 구성됩니다. 예를 들어, 각 인간의 신장 이상 1,000,000 네프론 세를 포함 할 수 있습니다. 마우스와 같은 다른 포유류 신장 4 당 8-10000 네프론의 순서에 가지고있다. 신장 복잡성의 정도는이 포유류와 다른 높이 요 사이에 차이가전체 네프론의 수가 변형 및 신장 내에서의 구조적 배치로 인한 ebrates. pronephros, mesonephros 및 metanephros : 척추 동물의 종은 최대 3 개의 연속 개발하는 동안 신장의 구조 및 네프론 자질 및 배치와 관련하여 복잡성을 증가 각 양식에 표시를 형성한다. 유지하는 구조는 최종 신장 성인 신장 장기 전형적 mesonephros 또는 metanephros이 역할을한다. 각 신장 형태는, 그러나, 네프론 계 조성물이있다. 네프론은 신​​장의 주력이고 대사 분비 및 재 흡수와 함께 혈액 여과를 담당합니다. 네프론은 상피 세포로 구성된 간단한 관상 구조입니다 차별화 된 상피 세포의 분리, 고도의 전문 도메인이 특정 작업을 수행하는 분절 조직을 보유하고 있습니다. 네프론을 통한 여과 유량 위하여, 일반적으로 3 주요 부를 compris 그 존재각 전자 장치 (1) 신장 소체, 기단, 중간 및 원위 세그먼트 (2) 세뇨관, 및 (3) 집합관 1. 근위 세뇨관 유기 용질, 특히 포도당과 아미노산을 하나의 재 흡수에 대한 책임이있다. 중간 가느 다란 관 (또는 헨레 루프)는 소금과 물 규제가 하나의 주요 사이트입니다. 마지막으로, 소금과 다른 이온의 미세 조정은 원위 세뇨관과 집합관에서 발생하는 높은 내분비 시스템 (1)에 의해 조절된다. 거기에서, 여액은 궁극적 노폐물 한 바와 같이 본체를 종료, 및 방광 요관을 통해 여행. 신장 기능의 감소는 정상적인 활동 네프론을 방지 원인 다수 유래 할 수있다. 이러한 원인은 신장 개발, 예를 들면, 부상의 다른 유형에서 네프론 5, 또는 원인의 기형을 초래할 선천성 결함 (유전 및 environme 모두에 따른 중에 발생할 수ntal 기원). 획득 부상은 크게 급성 신장 손상 (AKI) 또는 만성 신장 손상 (CKD)으로 분류됩니다. AKI는 종종 허혈이나 독소에 노출 6,7로 인한 신장 기능의 급격한 손실을 포함한다. 포유 동물에서 상피 수리 네프론은 부상 후 8 가능하고, 많은 사람들은 AKI 후 신장 기능의 완전한 회복을 나타낸다. 70 %의 발생 범위 6,7 - 그러나, AKI는 넓은 (30)를 통해보고 된 높은 이환율과 사망률과 관련이 있습니다. CKD는 대조적으로, 일반적으로 섬유화 8,9과 관련된 장기 손상의 년의 결과 신장 기능의 점진적인 감소와 연관되어 있습니다. 어느 하나가 다른 10 ~ 12에 개인을 걸리기 수 또한, 상호 작용은 AKI와 CKD 사이에 존재합니다. 예를 들어, AKI에서 고통을 사람들은 CKD와 죽음 (13)에 더 민감하다. 신장 질환의 발생률은 미국 및 전 세계적으로 모두 epide에 도달했습니다마이크 비율과는 세 인구는 신장 (14, 15)에 대한 재생 의학의 개입을 식별 할 필요성이있다 - 따라서 확장으로 증가 할 것으로 예상된다. AKI 환자가 회복 할 수있는 지식에도 불구하고, 긴 신장이 선천적 인 재생 능력이없는 기관이라고 생각하고있다. 이 전통적인보기는 극적으로 최근 16 년에 개정되었다. AKI 후 마우스 및 쥐에서 신장 손상을 조사하는 연구는 네프론의 세뇨관 상피 세포 증식 및 기능 네프론 17-20를 재 구축 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 포유 동물은 네프론을 다시 생성이 적응 능력을 가지고 있지만, 신장 섬유증 및 CKD 21로 이어질 트리거 할 수 있습니다 주목할만한 한계와 부적응 반응이있다. 예를 들어, 최근의 연구는 쥐의 네프론에서 반복 상피 세포의 박리가 감소 된 재생 및 근래 신장 섬유증 - 제안 네프론와 관련이 있음을 증명EA는 재생 임계 값 (22)을 제한했다. 성인 포유 동물의 신장, 분실 또는 손상된 것들을 대체 할 새로운 네프론을 형성하여 자신의 파괴는 영구적 인 네프론 적자 8,9 리드 있다는 증거는 없습니다. 흥미롭게도, 어떤 척추 동물은 콩팥의 상피를 재생하여도 새로운 네프론을 생산하여 AKI에 응답 마십시오 과정은 neonephrogenesis 또는 네프론 신생 (23)라고 함. Neonephrogenesis 독소에 노출 또는 부분 절제술 후 물고기에서 발생, 부상 모델은 역사적으로 최근에는 금붕어 24, 25, 틸라피아 (26), 스케이트 (27), 송사리 (28), 그리고 제브라 피쉬 (29, 30)을 포함했다. 이들 중, 제브라 피쉬 신장 재생에 책임 세포 및 분자 경로를 발견하도록 가능한 유전자 연구 모델을 제공한다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 성인 제브라 피쉬에서 네프론 세그먼트 레이블을하는 방법을 보여줍니다. 네프론의 해부학, 분자 기능에 대한 지식,기능적인 특성은 제브라 피쉬를 사용하여 성공적인 미래 신장 연구에 필수적이다. 성인 zebrafish의 신장은 mesonephros 구조입니다 성인 포유류, avians, 파충류 31에있는 metanephros 구조보다 네프론의 수와 조직의 관점에서 본질적으로 덜 복잡하다. 그러나, 제브라 피쉬 네프론 세그먼트는 포유 동물 조직과 유사하며, 제 유전자 발현 연구에 기초하여 31-35 배아 신장에서 설명 하였다. 제브라 피쉬 배아 네프론은 근위 세뇨관 (PCT)를 포함 선형 세관 세그먼트, 근위 곧은 세관 (PST), 말초 초기 (DE) 및 말초 말 (DL) 31 ~ 35 (그림 1)이 포함되어 있습니다. Zebrafish의 성인 네프론 유사한 관 세그먼트에게 30,31,36,37 (그림 1)를 가지고있다. PCT 또한 기능적 표현형에 의해 식별 될 수있다 : PCT 상피 세포에 존재하는 형광 표지 덱스 트란 화합물 (10-70 kDa의 크기)를 포함한다배아 및 성인 지브라 피쉬 신장 모두에서 사용되어왔다 순환 이러한 근위 세뇨관 세포 38-41 (도 1)에 의해 세포 내 이입 흡수를 평가한다. 제브라 피쉬와 포유류 사이의 네프론 분야에서 한 가지 차이점은 제브라 피쉬는 중간 세관 또는 헨레 30-37의 루프 부족이다; 포유 동물에서이 세그먼트 기능은 물을 절약하고, 제브라 피쉬는 소변을 집중 긴급없는 담수 종 때문에, 제브라 피쉬는이 세그먼트 (32, 33)이 부족한 것은 놀라운 일이 아니다. 따라서, 전체적인 네프론 조성물은 크게 제브라 피쉬 및 포유류 신장 32,33간에 보존된다. 이러한 유사성은 발달 nephrogenesis 32-35,42 중에 신장 발현 유전자의 기능을 조사함으로써, 인간 일 수 조건의 실질적인리스트에 추가하는, 수많은 신장병 43, 44를 모델링하기 위해 효과적인 연구 도구로 지브라 피쉬를 활성화 사용하여 조사제브라 피쉬의 45, 46. 오늘날, 성인 zebrafish의 신장으로 인해 유전 온순함이 종의 유전자 기능과 신호 전달 경로를 심문 할 수 기술 자원의 확대 입맛에 신 재생의 비교 연구를위한 매력적인 모델입니다. 여러 연구 AKI 29,30,37 후 재생의 메커니즘을 조사하기 위해 제브라 피쉬 mesonephros을 사용했다. 성인 zebrafish의 신장을 계속 사용 AKI 연구의 경우, 네프론의 기능을 조사하기 위해 다른 네프론 지역과 방법에 레이블 절묘한 방법이 필수적이다. 성인 신장의 분석을위한 여러 가지 방법이 배아 신장 프로토콜에서 적응하고있다. 성인 제브라 피쉬의 형광 표지 덱스 트란의 복강 내 주사는 제브라 피쉬 배아 38-41 (그림 1)에서와 같이, 엔도 시토 시스 (30)를 통해 mesonephros의 네프론의 PCT 상피 레이블. 이 방법은 visualiz하는 데 사용되었습니다근위 세뇨관 복원 생리 기능 30 (그림 1)의 한 평가를 할 수 AKI을, 다음 자신의 재 흡수 특성을 회복 전자. 네프론 근위 세뇨관의 또 다른 특징은이 분야에서 상피 세포가 내인성 알칼리 포스파타제 활성의 높은 수준을 나타내고 브러시 테두리 (37)를 갖고 있다는 점이다. 따라서, 근위 상피 ELF- (효소 형광 표지)로 알려진 형광 기반 기술 -97 (47)를 사용하여 성인 제브라 신장 시각적 지역화 될 수있다. 여기서는 근위 세뇨관의 기능 평가를 획득하고이 세뇨관 세그먼트의 크기 및 형상을 매핑하도록, 제브라 피쉬 신장 성인 형광 덱스 트란 흡수 분석법 30,48보기를 수행하는 방법을 설명한다. 다음으로는 형광 라벨 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)와 성인 네프론의 근위 세뇨관 영역을 레이블 기술을 설명합니다. 셋째, 우리는 처음으로로드 &#39;게재아민 태그 렉틴 Dolichos는 포유류 낭 (49)에 포집 관의 일반적인 마커로 사용되었다 응집소 (DBA) biflorus, 제브라 피쉬 성인 신장의 원위 세관을 표시한다. DBA는 알칼리성 포스 파타 아제 염색에 상호 배타적이기 때문에,이 라벨은 크게 성인 zebrafish의 네프론의 팬 원심 뻗어 대 팬 근위을 구별 할 수있는 방법을 제공합니다. 전체 마운트 및 저온 유지 조직 학적 섹션 모두에서 이러한 형광 얼룩의 구현을 통해, 우리는 고유 각 네프론 세그먼트를 식별 용질 수송 유전자의 발현 도메인과이 라벨의 상관 관계. 따라서이 프로토콜은 또한 우리의 배아 WISH 프로토콜 50을 기반으로 현장 하이브리드 (WISH) 분석에서 성인 조직 전체 마운트에 대한 수정 된 조직 처리 절차에 대한 안내가 포함되어 있습니다. 이러한 절차는 O 형태 학적 및 기능적 특성을 문서화하는 다양한 조합으로 (그림 2)을 사용할 수 있습니다F 성인 zebrafish의 신장 네프론. 따라서,이 프로토콜은 재생 연구, 다른 신장 질환 모델의 표현형 특성에 적용 할 수 있으며, 심지어 신장 성인의 형성을 연구하는 데 사용.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

제브라 피쉬 모델은 신장 개발, 재생과 질병을 연구하는 중요한 시스템으로 떠오르고있다. 모두 배아와 성인 zebrafish의 신장이 높은 포유 동물을 포함한 다른 척추 동물에 보존되어 네프론로 알려진 기능 단위로 구성되어있다. 제브라 피쉬의 연구는 최근 성인 네프론 손상이 발생 후 2 독특한 현상이 발산 것을 증명하고있다 : 첫째, 파괴 세관 상피 세포를 대체 기존의 네프론 내에서 강력한 재생이; 둘째, 완전히 새로운 네프론은 neonephrogenesis으로 알려진 과정에서 신장 전구 세포로부터 생성된다. 대조적으로, 인간과 다른 포유류 네프론 상피 재생을위한 제한된 능력을 가지고있는 것처럼 보인다. 현재까지, 이러한 신장 재생 현상에 대한 책임이 메커니즘은 제대로 이해 남아있다. 성인 zebrafish의 신장이 모두 네프론 상피 재생 및 neonephrogenesis를 받아야하기 때문에, 그들은 뛰어난 실험 항을 제공이러한 이벤트를 공부 다임. 또한, 신 재생을 조절 세포와 분자 메커니즘을 서술하기 위해 사용될 수있다 제브라 피쉬 모델에서 사용할 수있는 약리학 적 및 유전 적 다양한 도구가있다. 이러한 연구의 한 중요한 양태는 네프론의 구조와 기능의 평가이다. 이 프로토콜은 성인 zebrafish의 신장에 신장 조성물 및 테스트 네프론 기능을 측정하는 데 사용할 수있는 표시 기술의 집합을 설명한다. 따라서, 이들 방법은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 성인 지브라 피쉬 신장 손상 패러다임, nephrotoxicant 노광 체제 또는 nitroreductase 매개 세포 어블 레이션 기술로서 표적 세포 사멸 유전자 방법 미래 표현형 특성에 널리 적용 할 수있다. 또한, 이들 방법은 성인의 신장 형성 유전 섭동을 연구하는데 사용될 수 있으며, 만성 질환 모델링시 신장 상태를 평가하기 위해 적용될 수있다.

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

제브라 피쉬의 성인 신장은 신장 재생과 질병 연구를위한 훌륭한 시스템입니다. 이러한 연구의 중요한 양태는 네프론의 구조와 기능의 평가이다. 이 프로토콜은 네프론의 세뇨관 조성물을 평가하기 위해 신장 재 흡수를 평가하도록 구현 될 수있는 몇 가지 방법론을 설명한다.

성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

43.7K 조회수.  University of Notre Dame.  제브라 피쉬의 성인 신장은 신장 재생과 질병 연구를위한 훌륭한 시스템입니다. 이러한 연구의 중요한 양태는 네프론의 구조와 기능의 평가이다. 이 프로토콜은 네프론의 세뇨관 조성물을 평가하기 위해 신장 재 흡수를 평가하도록 구현 될 수있는 몇 가지 방법론을 설명한다. 

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

연구

생물학

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

성인 Zebrafish에서 기관의 해부

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

성인 Zebrafish에 Intraperitoneal 사출

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

직접 성인 Zebrafish의 신장에 세포의 이식

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

성인 Zebrafish의 신장의 해부

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

성인 Zebrafish의 생물 화학 분석을위한 혈액 수집

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

성인 Zebrafish의를 Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...