점차적으로 지난 10 년간 성인 zebrafish이 절개 기법을 모양이 전략을 개발하기 위해 도움이 그들의 수많은 공헌을위한 Zon 및 데이비슨 연구 실험실의 구성원에게 감사 RAW 기원합니다. 또한, 우리는 zebrafish 콜로니 우수한 지속적인 축산 관리를 제공하는 Zebrafish 연구 노틀담 센터의 직원에게 우리의 감사를 표현하고 싶습니다. RAW는 NIH - NIDDK 부여 보너스 DK083512에서 연구 자금을 얻고, 그리고 노트르담 대학에서 관대한 실험실 시작 자금.

1. 고정되지 않은 동물의 샘플에서 성인 zebrafish의 신장의 해부 <ol><li> 해부에 대한 시대에 3-6개월 사이의 성인 zebrafish를 선택합니다. </li><li> 아가미가 이동하고 심장 박동 중지 중지 있는지주의 깊게 관찰, 약 4~5분에 대한 0.2 % Tricaine 산도 7.0 그릇에 그것을 배치하여 물고기를 안락사. </li><li> 스푼을 사용하여, 솔루션의 소량의 Tricaine 욕조에서 물고기를 리프트 솔루션을 가만히 따르다 부드럽게 종이 타월에 동물을 놓으십시오. </li><li> 그냥 길 operculum (그림 1, 경로) 뒤에 상처를 만들고, 동물의 머리를 제거하는 해부 가위의 날카로운 쌍을 사용합니다. 생물 학적 폐기물 용기에 머리를 삭제. </li><li> 머리부터 꼬리 지느러미와 (그림 1, 경로 B)의 기본에 꼬리를 종료, 긴 복부 절개를하여, 동물의 시체를 엽니다 해부 가위를 사용합니다. </li><li> 해부의 핀셋 / 포셉 한 켤레를 사용하여 동물의 내장을 제거하고, 생물 학적 폐기물에서 그들을 놓으십시오. 이것은 신장의 위치 (그림 2)와 같이, 등의 신체 벽 브러시하지 않도록주의하십시오. 당신이 여성 물고기를 선택한 경우, 당신은 가장 쉽게 집게 또는 핀셋의 직각 쌍을 사용 할 수 뱃속의 개발 달걀을 푸다해야합니다. </li><li> 절개 트레이에 몸을 벽을 열고 핀, 그리고 신장이 시각 수 있도록 핀을 각도 절개의 바늘을 사용합니다. 신장은 특징적인 모양 (머리, 트렁크 / 안장, 꼬리)와 색상을 가지게 되리라 블랙 hued 착색 (그림 2)와 interspersed되고. 당신은 또한 장기 구조의 정중선을 실행 말초혈, 가득 대동맥를 볼 수 있습니다. </li><li> 당신이 그것을 기초 결합 조직에서 오르간을 별도로 신장을 리프트로 포셉 중 한 쌍을 사용 등의 신체 벽에서 신장을 분리하기 위해 미세 집게를 사용하십시오. </li><li> 부드럽게 같은 외과 준비에 대한 1X PBS를 포함하는 microcentrifuge 관으로 더 라이브 세포 연구에 대한 원하는 차량에 신장을 놓으십시오. </li></ol> 2. 고정 동물의 샘플에서 성인 zebrafish의 신장의 준비 및 해부 <ol><li> 4퍼센트 paraformaldehyde/1X의 PBST의 솔루션을 준비합니다. 솔루션에 PFA를 해산하기 위해 솔루션을 삶아 다음 ° C 4 혼합물을 냉각하고 0.1 % dimethylsulfoxide를 추가합니다. 우리는 냉동 aliquots 반대로 갓 만든 PFA 솔루션을 사용하여 조직 보존과 함께 가장 성공을 있었다. 잠수함 해부 동안 성인 zebrafish를 충분히 솔루션을 확인하십시오. </li><li> 잠수함 해부 동안 성인 zebrafish를 충분히 고정 솔루션으로 절개 트레이를 채우십시오. 우리는 고정 냄새에 노출을 최소화하기 위해 화학 후드에 놓일 수있는 현미경이 위치 트레이와 후속 단계를 수행합니다. </li><li> 해부에 대한 시대에 3-6개월 사이의 성인 zebrafish를 선택합니다. </li><li> 보고 신중하게 지켜보고, 약 5 분 동안 0.2 % Tricaine 산도 7.0 그릇에 그것을 배치하여 물고기를 안락사되는 아가미와 심장 박동 정지. </li><li> 스푼을 사용하여, 솔루션의 소량의 Tricaine 욕조에서 물고기를 리프트 솔루션을 가만히 따르다 부드럽게 종이 타월에 동물을 놓으십시오. </li><li> 그냥 길 operculum (그림 1, 경로) 뒤에 상처를 만들고, 동물의 머리를 제거하는 해부 가위의 날카로운 쌍을 사용합니다. 생물 학적 폐기물 용기에 머리를 삭제하고, 즉시 PFA 함유 절개 트레이에 동물을 놓으십시오. </li><li> 머리부터와 꼬리 지느러미 (그림 1, 경로 B)의 기본에 꼬리를 종료, 긴 복부 절개를하여, 동물의 시체를 엽니다 해부 가위를 사용하여 부분적으로 동안 잠수 신체를 유지 절차. </li><li> 해부의 핀셋 / 포셉 한 켤레를 사용하여 동물의 내장을 제거하고, 생물 학적 폐기물에서 그들을 놓으십시오. 이것은 신장의 위치 (그림 2)와 같이, 등의 신체 벽 브러시하지 않도록주의하십시오. </li><li> 신체 벽면을 열고 핀, 그리고 신장이 시각 수 있도록 핀을 각도 절개의 바늘을 사용합니다. 신장은 검은색 hued 착색 (그림 2)와 interspersed되는 특성 모양 (머리, 안장, 꼬리)와 색상을 가지고 있습니다. 당신은 또한 장기 구조의 정중선을 실행 말초혈, 가득 대동맥를 볼 수 있습니다. </li><li> 4 트레이를 배치, 야간 샘플을 수정 ° 당신이 원하는 샘플을 꺼리 완료되면 C. </li><li> 다음날, 트레이에서 PFA 솔루션을 제거하고 1X PBST로 바꿉니다. </li><li> 주의깊게 당신이 그것을 기초 결합 조직에서 오르간을 별도로 신장을 리프트로 포셉 중 한 쌍을 사용 등의 신체 벽에서 신장을 분리하기 위해 미세 집게를 사용하십시오. 신장 조직은 가능한 한 조각의 전체 신장 장기를 해부하다 수 있도록, 정착액 솔루션 DMSO에서 부드러운 고분 고 분한 것입니다. </li><li> 사용 넓은​​을microcentrifuge 관에 신장을 배치 보어 전송 pipet. </li><li> 신장 이제 원하는 연구를 기반으로 현장 유전자 발현 연구에 histological 또는 전체 마운트를 수행하기 위해 추가로 처리할 수 있습니다. </li></ol> 3. 대표 결과 : 그림 1 diagrammed하는 단계는 절개 절차를 나타냅니다. 그림 2에서와 같이 신장은 그 특성 모양과 착색, 그리고 동물의 뱃속의 지느러미 벽에 해부 위치에 따라 확인할 수 있습니다. 현장 하이브리드화에 고정 신장 샘플, 전체 마운트의 절개 후 그림 3과 같이, 관심 유전자의 표현을 집중하는 데 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1 : zebrafish 성인 신장을 해부에 대한 직접 액세스를 가능하게 절차. (A) Euthanized zebrafish는 연구자에게 완전한 신장 기관에 대한 쉬운 액세스를 제공하기 위해 (번호와 화살표로 표시) stepwise 방식으로 해부하는 것입니다. 복강의 이미지 이전 (B) 및 이후 (C) 복부 장기의 제거. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2 :. 떼어낸 샘플에 zebrafish 신장의 시각화 뱃속에있는 장기에 따라 제거, 신장은 결합 조직 (A)를 통해 지느러미 몸 벽에 자기편이라고 하나, 평평 기관으로 나타나며, schematized되었습니다 (B)의 해부 학적 모양을 표시합니다. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3 : 전체 성인의 신장 기관에서 수행 현장 hybridizations에서 전체 탑재합니다. (A) cadherin17 성적은 (A &#39;)의 확대, 성인 신장 nephrons의 가느다란 관에 감지됩니다. (B) mafba의 성적표가 성인 신장 (패널의 전체 가느다란 관과 비교할 때)의 근위 nephron 세포 유형화된 있습니다. (B&#39; ) mafba 표현의 확대는 성적이 특히 혈액 필터 (glomerulus)와 근위 뒤얽힌 가느다란 관 (PCT)의 podocyte (P) 세포화된 아르 보여줍니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

성인 줄기 세포는 성인 신체 양식 1 유지 역동적이고 필수 구성 요소입니다. 성인 줄기 세포는 질병 상태 동안 신체 incurs 및 성인 줄기 세포의 기능 장애 또는 손실이 장기 기능의 감소로 이어질 수 있으며, 암 malignancies를 드라이브 및 노화에 기여하는 연루되어있다는 손상을 중화하는 역할을 수 있습니다. 성인 줄기 세포는 차별화된 세포 유형에서 그들을 구별 세포 특성을 나타냅니다. 세포 분열시, 성인 줄기 세포 자기 갱신과 차례로 뚜렷한 차별 자손에게 상승을 줄 수 전구 세포의 생산이 가능합니다. 때문에 조직의 항상성 1 그들의 중요한 역할의 세포 운명 결정과 성인 줄기 세포의 힘 조절 경로를 이해하는 큰 관심이있다. 예를 들어, 많은 과학자들은 현재 자신의 틈새 시장에서 다양한 성인 줄기 세포의 집단, 또는 전문 microenvironment, 그리고 어떻게 틈새는 체액성 요인에 의해 영향을이다를 유지 신호를 식별을 추구합니다. 성인 조혈 줄기 세포 (HSCs)는 연료 동물 8 혈액 세포의 지속적인 도로 젊어짐 pluripotent 세포 수 있습니다. 조혈은 성숙 차별화된 혈액 세포 유형은 수명이 짧은되며 따라서 정기적으로 보충함해야하기 때문에 척추 유기체의 수명 동안 지속적으로 진행되는 역동적인 과정이다. 그들이 분열로 HSCs 자기 갱신과 erythroid, megakaryocyte 림프 및 골수양 lineages을 일으키다 progenitors 일련의 생산하여이 중요한 요구를 제공합니다. 이러한 혈액 세포 유형의 각각은 조직 응고 형성의 수단, 또는 병원균에 침해에 대한 방어 메커니즘에 의해 혈관에 부상을 막기위한 방법을 가스 교환을 제공 포함한 유통에서 고유 기능을 수행합니다. HSCs가 수년 동안 인정을 받고있는 반면, 매혹적인 질문의 과다이 놀라운 세포에 대해서 답이 남아 있습니다. 최근 연구는 다른 장기 자기 갱신 등록 및 틈새 구성 요소 및 HSC 행동 8 변조 신호의 해설과 함께 HSCs의 서브 클래스를 확인합니다. zebrafish는이 동물 모델 8 유전자와 분자 특성에 따라 조혈 연구 패러다임의 기초 중 지금이다. zebrafish를 이용 연구는 물고기 혈액 조사 8 의생명 관련성을 강조, 포유류와 같은 고등 척추 동물과 보존 아르 HSC 생물학에 대한 통찰력 소설되었다. 역사적으로, HSCs에 대한 지식은 다른 신체 기관은 성인 줄기 세포가 관리하는 경우 발견하고자 원정을 위해 포장하는 방법이 있습니다. 많은 성인 줄기 세포 집단은 이제 두뇌에서 창자, 피부 및 골격 근육에 다양한 구조를 통해 이르기까지 존재 감사합니다. 줄기 세포 분야의 지속적인 노력은 성인 줄기 세포, 심지어 다른 차별화된 세포 유형은 다양한 설정에서 향상된 힘을 표시할 수있는 방법을 파악을 추구합니다. 신장과 관련하여, 신장 줄기 세포 16 존재 여부를 nephrologists 사이에 큰 논쟁이있었습니다. 독립적인 연구 결과는 재생 가능성의 학위를 가지고 다양한 포유류의 신장 세포의 인구를 문서화 있지만, 이러한 리포트의 응집 이해 얻을 아​​직있다. 흥미롭게도, 많은 물고기 종 (种)은 견고하게 손상 nephrons의 재생을 연료뿐만 아니라 성인 9 동안 완전히 새로운 nephrons을 성장할 수 세포를 가지고있는 개념을 지원하는 강력한 증거가있다. 최근 작품은 zebrafish 10,11의 성인 신장 줄기 세포의 분자 특징을 파악하고, 이러한 소위 신장 줄기 / 전구 세포 (RPC를) 11의 자기 갱신 힘을 보여주었다. 미래 연구는 유사한 신장 세포가 포유류에 존재 여부를 확인할 필요가있다. 그럼에도 불구하고, 생선 RPC를 조절 세포와 분자 메커니즘에 대한 지속적인 조사가 재생 업적은 포유류의 신장에 자극 수 방법에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것은 많은 RPC를 대한 이해에 그대로 남아 있으며, zebrafish 연구원 사용할 이제 다양한 도구가 이러한 흥미로운 질문을 해결하기 위해 구현할 수 있는지 분명하다. 이 프로토콜에서는, 우리는 성인 zebrafish의 신장의 해부 식별 및 해부를위한 방법을 설명합니다. 다른 단계는 이러한 해부 가위를 사용하여 복부 절개로 복강을 여는 등 신장을 해부하다하는 데 사용할 수 있지만, 우리는 복벽을 열고 고정된하고 머리가 제거되면 전체 신장 액세스에서 가장 성공가 발생했습니다. 이러한 세포 유형 분리 및 작업하고자하는 모두 혈액 및 신장 연구자 절개 방법 중 하나를 사용할 수 있습니다. 그것은 지적되어야한다는 것을 분리하고 노력을 위해 우리가 설명하는 방법zebrafish 성인 신장과 g는 확실히이 장기의 해부은 생리학에서 노화에 이르기까지 다양한 주제에 대한 조사를 추구하는 이들 연구자에 대한 연구를 촉진 수, 성인 줄기 세포 생물학의 질문을 추구하고자하는 과학자에 국한되지 않습니다. 또한,이 방법은 molecularly 라벨 후 wildtype 또는 유전자 돌연변이 zebrafish 11 혈액이나 신장 세포의 이산 subpopulations 정화 공부을 줄 수있는만큼, 이러한 트렌스 제닉와 같은 다른 기술과 결합 수 있습니다. 줄기 및 전구 세포 유형 등 세부적인 정화 절차는 앞으로 자신의 행동을 규제하는 방법에 대해 얻는 지식에 필수적인 요소입니다 찾는 등 이식이나 전구 culturing으로 운영 테스트의 기초를 구성으로하는 이러한 세포의 힘과 정체성이 정의됩니다. 조혈 전구 문화 방식의 최근 발전 연구를위한 많은 새로운 아베를 열고 신장 인구 17 culturing 적응 수 있습니다. Zebrafish 화학 유전학이 HSCs 다양한 문맥 18-20에서 신장 progenitors을 조절하고, 위의 세포 생물학 기법와 함께 테스트를 유용한 수단으로 계속 경로의 식별에 성공했습니다. 함께 촬영이 zebrafish 모델을 이용하여 혈액 및 신장학 분야에 혁신적인 기여의 숫자를 해왔으며이 무대에서 연구를 계속은 오는 년 휘두르다 추가 transformative 통찰력을 약속드립니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 해부 가위 </td><td> Roboz </td><td> RS - 5882 </td></tr><tr><td> 해부의 포셉 </td><td> Roboz </td><td> RS - 5010 </td></tr><tr><td> 해부 직각 포셉 </td><td> Roboz </td><td> RS - 5058 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> 시그마 </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 전자 현미경 서비스 </td><td> 19,210 </td></tr></tbody></table>

dissection of the adult zebrafish kidney

성인 줄기 세포 생물학의 급성장 분야에서 일하는 연구자는 정상적인 항상성 및 질병 상태 동안 줄기 세포의 동작과 기능을 조절 신호를 이해하기 위해 추구합니다. 성인 줄기 세포의 이해는 재생 의료 1의 미래에 대한 광범위한 도달 의미가 있습니다. 예를 들어, 성인 줄기 세포 생물학에 대한 더 나은 지식은 장기가 스스로 또는 인간 하나에 이식 수있는 체외에서 성장하는 기관에 대한 방법도 생성을 치유하기 위해 실행하는 치료 전략의 디자인을 용이하게하실 수 있습니다. zebrafish는 척추 세포 생물학 2의 학습을위한 강력한 동물 모델이되었다. zebrafish 3 배아 발달의 광범위한 문서 및 분석하고있다. 최근 성인 연구이 연구 유기체의 응용 프로그램을 확대하기 위해 zebrafish 지역 사회 내에서 진보 운동이 존재한 이래로, 성인 해부학, 외과 절개 기법 4 문서 모색 과학자 있습니다. 예를 들어, 성인 줄기 세포 집단의 생물 학적 조사와 같은 암 5 질병의 정교한 성인 모델을 만들기 위해 zebrafish를 사용하여 관심이 확대됩니다. 역사적으로, zebrafish 성인 신장의 분리는 신장 물고기 6,7에서 혈액 세포 생산의 해부 학적 위치이므로, 조혈 공부를위한 수단되었습니다. 신장은 개입 공간에 걸쳐 흩어져 있기 때문에 조혈 조직으로 둘러싸여 arborized 준비에있는 nephron 기능 단위로 구성되어 있습니다. 조혈 구성 요소들은 말기 8 차별 때까지 신장 서식 조혈 줄기 세포 (HSCs)와 그들의 자손으로 구성되어 있습니다. 또한, 그것은 지금과 같은 다른 어종 9-11에서 관찰, 신장 줄기 / 전구 세포의 그룹 (RPC를)이 또한 zebrafish 신장 기관이 서식하고 신장의 재생과 성장을 모두 사용하는 것이 감사합니다. 이 새로운 발견에 비추어, zebrafish 신장은 성인 줄기 세포 생물학 연구의 두 가지 흥미로운 기회의 위치를​​ 주택 장기 하나입니다. 그것은 많은 훌륭한 질문이 잘이 실험 시스템을 제공 될 수 있다고 분명하다. 이 분야의 확장을 촉진하기 위해서는 시각화에 대한 자세한 방법을 문서화하고 다음 성인 zebrafish의 신장 기관을 분리하기 위해 유용합니다. 이 프로토콜은 수정되지 않은 및 고정 모두 동물의 성인 신장의 해부에 대한 세부 절차를. 신장 기관의 해부는 이러한 조직학, 형광 활성 세포 분류 (외과) 11,12, 표현 파일링 13,14, 및 이식 11,15 설립 기술을 사용하여 조혈 및 신장 줄기 세포와 그 자손을 분리하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜의 보급이 궁극적으로 인간의 응용 프로그램에 대한 번역될 수 zebrafish 연구의 광범위한 사용을 구현할 수있는 지식과 연구자를 제공하기를 바랍니다.

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Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

zebrafish의 신장은 모두 신장과 조혈 성인 줄기 / 전구 세포의 고향이며, 척추 모델 생물에서 이러한 세포 유형과 그들의 자손을 공부하기 위해 우수한 기회를 나타냅니다. 여기, 우리는 세포 분리, 이식 및 신장 및 / 또는 혈액 세포 집단의 표현 연구와 같은 애플 리케이션에 사용할 수있는 성인 zebrafish의 신장을 확인하고 수술 제거하는 연구자 수 있도록 상세한 해부 절차를 보여줍니다.

성인 Zebrafish의 신장의 해부

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

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JoVE Journal

Biology

36.5K 조회수.  University of Notre Dame. zebrafish의 신장은 모두 신장과 조혈 성인 줄기 / 전구 세포의 고향이며, 척추 모델 생물에서 이러한 세포 유형과 그들의 자손을 공부하기 위해 우수한 기회를 나타냅니다. 여기, 우리는 세포 분리, 이식 및 신장 및 / 또는 혈액 세포 집단의 표현 연구와 같은 애플 리케이션에 사용할 수있는 성인 zebrafish의 신장을 확인하고 수술 제거하는 연구자 수 있도록 상세한...

비디오: Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

연구

생물학

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

성인 Zebrafish에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 총과 파인 해부 ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

성인 Zebrafish에서 기관의 해부

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

성인 Zebrafish에 Intraperitoneal 사출

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

직접 성인 Zebrafish의 신장에 세포의 이식

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

애벌레의 심장 해부, 소년과 성인 Zebrafish, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

성인 Zebrafish의를 Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...