이 프로토콜은 변형 도중 더 오래된 제브라피시 애벌레 및 청소년에 있는 유전자 발현의 결정을 허용하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 장점은 여러 단계가 신장의 프로브 침투 및 시각화에 최적화되었다는 것입니다. 우선, 마지막 식사 후 늦은 오후에 짝짓기 탱크에 남성 1 마리와 암컷 물고기 1 마리를 추가하여 짝짓기 성인 얼룩말 물고기를 설정합니다.
다음 날, E3 배지를 포함하는 페트리 플레이트에서 배아를 수집합니다. 5일 후 수정, 2.8리터 탱크에 400 마이크로미터 스크린을 배치하고 2센티미터의 시스템 워터로 채웁니다. 그런 다음 페트리 접시 한 개에서 애벌레를 추가합니다.
애벌레를 고치려면 원하는 시점에서 애벌레 탱크를 제거한 다음 팁이 잘린 그물 및 이송 파이펫을 사용하여 애벌레를 페트리 플레이트로 옮습니다. 다음으로, 애벌레를 고정시키기 위해 2%의 트리카인 2밀리리터를 추가합니다. 고정 후 트리카인을 20 밀리리터의 고정 용액으로 교체하십시오.
30분 후, 애벌레를 신선한 고정 용액 25밀리리터가 들어있는 50밀리리터 튜브로 옮킨다. 그런 다음 캡이 단단하도록 2 일 동안 섭씨 4도에서 천천히 튜브를 흔들십시오. 셋째 날에는 고정 용액을 PBST20 밀리리터로 교체한 다음 유충을 페트리 플레이트로 옮킨다.
애벌레를 측정하려면 페트리 플레이트를 해부 현미경 으로 평평한 눈금자 위에 놓고 속눈썹 조작기를 사용하여 각 애벌레를 통치자에게 이동하여 총 길이를 측정합니다. 모든 애벌레를 측정한 후 비슷한 길이의 여러 애벌레를 5.5 밀리리터 유리 바이알에 PBST와 결합합니다. 탈수의 경우 유리 유리병의 PBST를 100% 메탄올의 4밀리리터로 교체한 다음 2일 동안 영하 20도의 유리병을 보관하십시오.
재수화를 위해 100% 메탄올을 75%의 메탄올과 25%PBST 용액의 4밀리리터로 대체하고 5분 동안 바이알을 흔들어 주세요. 그런 다음 메탄올 및 PBST 용액을 4 밀리리터의 신선한 PBST로 대체하고 10 분 동안 다시 유리병을 흔들어보냅니다. Proteinase K 소화의 경우 PBST를 Proteinase K 용액 2밀리리터로 교체하고 실온에서 바이알을 30분 동안 흔들어 보냅니다.
다음으로, 표백을 위해 애벌레를 6웰 플레이트로 옮기고 PBST를 3밀리리터의 신선한 표백 용액으로 대체합니다. 메소네프로스를 따라 색소 침착이 완전히 사라진 후, 애벌레를 유리 유리 병으로 다시 옮기고, 표백 용액을 4밀리리터의 PBST로 대체하고, 10분 동안 유리병을 흔들어 넣습니다. 사전 혼성화를 위해 고정 솔루션을 4밀리리터의 PBST로 교체하고 10분 동안 유리병을 흔들어 10분 동안 PBST를 4밀리리터의 Hyb-solution및 rock로 교체하십시오.
Hyb 솔루션에서 두 개의 추가 인큐베이션 을 추가한 후 솔루션을 Hyb+솔루션의 4밀리리터로 교체합니다. 동시에 EGFP 형광 프로브를 하이브리드화 플러스 용액 500 마이크로리터에서 1~100마이크로리터를 희석하고, 밤새 70°C에서 바이알과 프로브를 배양한다. 다음 날, 프로브를 혼성화하기 위해 유리병의 Hyb+용액을 예열된 프로브로 대체하고 하룻밤 사이에 섭씨 70도에서 배양합니다.
다음 날, 50 밀리리터의 예열된 0.2배 SSCT를 50밀리리터 튜브에 넣습니다. 이어서, 100마이크로미터 세포 스트레이너를 튜브 의 상단에 삽입하고, 유리 유리병에서 유충을 세포 스트레이너로 옮기고, 애벌레가 완충제에 침수되도록 하고, 2시간 동안 70°C에서 바이알을 배양한다. 인큐베이션 후, 세포 스트레이너를 SSCT 0.2배 예열된 새로운 튜브로 옮기고 2시간 동안 섭씨 70도에서 다시 배양합니다.
다음으로, 차단을 위해 애벌레를 새로운 유리 유리 병으로 옮기고 실온으로 냉각할 수 있도록 합니다. 그런 다음 0.2배 SSCT 용액을 SSCT 67.2배, MABT 용액 33%의 4밀리리터로 교체하고 실온에서 10분 동안 유리병을 흔들어 보냅니다. 다음으로 SSCTT MABT 솔루션을 4밀리리터의 신선한 MABT로 대체하고 로커에 바이알을 10분 동안 배양합니다.
그런 다음 MABT를 블로킹 솔루션 4밀리리터로 교체하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도를 배양합니다. 다음 날, 차단 용액을 항체 용액으로 대체하고 2 일 동안 섭씨 4도에서 배양하십시오. 항체 세척의 경우 애벌레를 50 밀리리터 튜브로 옮은 다음 PBST2의 40 밀리리터를 추가하고 튜브를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 잠식할 수 있도록 옆으로 눕힙습니다.
12일, 용암을 6웰 플레이트로 옮김한 후 PBST2를 스테인딩 버퍼 3밀리리터로 교체합니다. 로커에서 5분 간 인큐베이션한 후 염색 버퍼를 스테닝 용액의 3밀리리터로 교체합니다. 원하는 염색 강도에 도달하면 염색 용액을 정지 용액의 3밀리리터로 교체하고 30분 동안 바위를 흔들어 보시기 를 기다립니다.
그런 다음, 애벌레를 새로운 유리 유리 병으로 옮기고, 정지 용액을 4밀리리터의 신선한 고정 용액으로 대체하고, 실온에서 1시간 동안 배양한다. 이미징의 경우 고정 솔루션을 4밀리리터의 신선한 PBST로 대체하십시오. 로커에서 10분 간 인큐베이션을 한 후 애벌레를 6웰 플레이트로 옮은 다음 PBST를 4밀리리터의 신선한 PBST로 교체하고 10분 동안 다시 접시를 흔들어 보입니다.
다음으로, PBST에 50%의 글리세롤 3밀리리터를 넣고 10분 동안 바위를 흔들고, 해부 현미경을 사용하여 6웰 플레이트에서 직접 애벌레를 이미지시합니다. 이 시상 혼성화 프로토콜에서 효과적으로 메소네프로스 개발을 사용하여 신장 전구 세포 및 다양한 nephron 구조를 라벨. 초기 메소네프릭 네프론은 약 5.2밀리미터 의 구름소에 형성됩니다.
전구 세포의 클러스터는 단일 전구 세포 이외에 메소네프로스 발달 중에 존재한다. 더 큰 청소년에서는, 배경 얼룩은 소미에서 생길 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 해부 성인 장기 뿐만 아니라 변형 중에 형성되는 다른 조직을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
