The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

1. 양육 애. aegypti 성인 <ol><li> 얕은 트레이에 약 ¾ 인치 물에 해치 계란. 과밀 수용은 성인의 크기를 줄일 수 있습니다. </li><li> 후면 유충 25 ° C (12 헥토 리터 : 12-HD)에 지상 물고기 음식으로 공급. 주 : 과잉 사료가 생존율을 감소시킬 수있다. </li><li> 매일 파스퇴르 피펫에 의해 개별적으로 번데기를 제거하고, 따라서 24 시간 연령 그룹을 설립, 미세 메쉬 뚜껑 플라스틱 접시에 작은 봉쇄 버킷 내부 (5.5 cm × 9cm)를 전송합니다. </li><li> 케이지 하우징의 화면 벽에 배치면 공에 의해 피드 성인 모기의 10 % 자당 용액 애벌레와 같은 광주에서 27 ° C 및 70 % 상대 습도 환경 챔버의 모기. </li><li> 전기 생리학의 경우 5 ~ 10 일 이전 동물을 사용합니다. 일반적으로, 더 큰 동물 나은 결과를 산출 할 것이다. RNA 분리의 경우, 5-10 일 이전 범위의 단일 24 시간 연령 그룹 내에있는 동물을 사용합니다. </li></ol><ol><li> 선택된 감각 뉴런에서 최소한의 활동을 이끌어 전해질 (예 : 1 ~ 10 mM의)의 적절한 농도를 결정합니다. 10 mM의 염화나트륨 또는를 1mM의 KCl 실험을 시작할 때 기본 활동을 테스트하기 위해 합리적인 전해질 수 있습니다. </li><li> 혼자 전해질에 비해 스파이크 활동에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 각 실험 적당한 용매 화학 (그렇지 않으면 물 사용 에탄올 또는 DMSO)에 용해. 10 % 에탄올, 1 % DMSO의 최종 농도는 적당한 출발 농도이다. </li><li> 곤충의 먹이 방어벽이나 자극을 잘 설명되어 제어 화학 물질 (달콤한에 대한 쓴 또는 자당에 대한 예를 들어, 말라리아) 적절한를 선택합니다. </li></ol> 3. 전기 생리학 (8 팁 기록 1 그림) <ol><li> 기계적으로 유리 모세관을 당겨 양식 유리 전극. 열을 최적화하고 적절하게 모양 recordi를 형성하기 위해 유리를 끌어 설정을 당겨NG 전극. 조심스럽게 그 대상을 sensillum 봉투 좁아서하지만 인접 구조물과의 접촉을 피하기 위해 충분히 작은 개구 전극 팁을 만들 해부 현미경 집게를 사용하여 유리 전극의 단부를 끊는. </li><li> 현미경 하에서 시각적 형태에 의해 식별 및 팁 기록 반복성을 보장하기 위해 목표 sensilla / sensillum 위치. 준비 동물 전극 항목의 각도에서 sensilla에 무료로 액세스를 허용합니다. </li><li> -20 ° C에서 냉동실에 콜드 마취 성인 곤충. 차가운 온도에 과다 노출에 의해 주변 신경 세포의 손상을 방지. 유리 슬라이드에 면도날 셀로판 테이프의 좁은 스트립을 잘라. 좁은 스트립을 사용하여 유리 슬라이드에 고정시킨다 전체 곤충. </li><li> 무관심 (접지) 전극 역할을하는 등의 흉부 또는 눈에 화학적으로 날카롭게 텅스텐 와이어를 삽입합니다. </li><li> 관심의 자극 솔루션 단계 3.1에서 만든 유리 전극을 입력합니다. 삽입 된 주사기를 사용하여 캡을 채우기뽑아 끝에서 illary는 끝을 무디게합니다. 헐 끝을 잡고, 모든 공기 방울을 쓸어 넘기. 기록 및 자극 전극 역할을하는 단계 3.1에서 만든 유리 전극에 실버 와이어 (chloriding 옵션)를 삽입합니다. </li><li> 곤충에 연락처 chemoreceptive의 sensilla에서 녹음 용으로 설계된 프리 앰프에 전극을 연결합니다. 이 프리 앰프 (300 HZ-3 kHz의 대역 통과 필터)는 가능한 한 도입 자극에 가까운 신경 세포의 활동을 캡처 안정 시간을 줄일 수 있습니다. 수집, 저장 및 스파이크 기록 소프트웨어를 구비 한 마이크로 컴퓨터를 이용하여 전기 신호를 분석한다. 주 : 대폭 신호 대 잡음비를 개선 할 수있다 적절히 녹화 설정을 접지. </li><li> 기능성을 보장하기 위해 제어 용액 (전해질 만)으로 sensilla을 자극한다. 모든 준비에 대한 자극 이슈 다음 200 밀리 초를 시작 스파이크를 계산합니다. </li><li> 용량 - 반응 연구를 제외하고, 모든 실험에 대해 테스트 약품의 순서를 랜덤 화,편견을 제거합니다. 용량 - 반응 연구를위한, 실험 화학 물질의 농도를 증가시키는 sensilla 노출. 적절한 복구를 보장하는 자극 사이의 3 분의 최소 허용. 참고 :이 요구 사항은 곤충과 sensilla에 따라 다를 수 있습니다. 임계치는 표준 오차가 시험 된 최소 농도의 표준 오차와 중복되지 않는 것을위한 농도로 정의된다. </li></ol> 4. RNA의 분리 및 시퀀싱 (그림 2) <ol><li> 단단히 스냅 캡 튜브에 맞게 조직 disruption.Prepare 동반 된 RNase없는 방앗 전에 드라이 아이스에 그들을 냉각하여 밀착 RNAse가없는 방앗를 준비합니다. 적극적으로 초과 응축을 방지하기 위해 해부하지 않는 폐쇄 수집 튜브를 유지합니다. </li><li> 필터링 흡입기를 사용하여, 30 ~ 40 냉간 마취 모기 (° C의 냉동고 -20에서 15 초) 감기 무대와 종류의 성별을 배치합니다. 장소 동물 맛 부속을 손상하지 않도록 날개를 잡고, 아래 쪽 지느러미.</li><li> 미세 두 쌍의 집게를 사용하여 해부 현미경 수컷 또는 암컷에서, 페어링 라벨라 또는 tarsi 해부 및 인접 조직의 포함을 제한한다. 참고 : 500 쌍 라벨라 총 mRNA의 약 800 ~ 1,000 나노 그램을 얻을 수 있습니다. (400) 개인 tarsi (5 세그먼트 각) 총 mRNA를 1,200-1,800 나노 그램을 얻을 수 있습니다. </li><li> 허걱 - 포셉 한 쌍, 가볍게 내부 stylets 노출 라벨라에 바로 인접 모기 코를 잡고. 컬렉션 포셉의 다른 쌍을 사용하여, 라벨라를 제거하고 차가운 수집 관의 측면에 조직을 추가합니다. </li><li> 포셉 한 쌍, 가볍게 경골 먼저 눈꺼풀 세그먼트의 교차점에 모기 다리를 잡고. 포셉의 다른 쌍을 사용하여, tarsi를 제거하고 차가운 수집 관의 측면에 조직을 추가합니다. 참고 : 원 원치 않는 조직의 인터페이스에서 계정에 세포 유형을 가져 가라. 조직은 이웃의 포함을 제한하는 것이 중요하지만, 그것은 조직의 원하는 부분을 생략하지 않는 것도 중요하다. Fi를최종 샘플은 정확하게 관심의 전체 기관을 대표해야합니다. 수집 집게 정확하게 벗기거나 만 원하는 조직을 잡아 해방 할 수 있도록 쥐고 집게로 정확한 경계를 만듭니다. </li><li> 주기적으로 튜브의 맨 아래에있는 조직을 유지하기 위해 9,000 XG에서 간단히 0 ° C 원심 분리기 컬렉션 튜브를 스핀 다운. 수분이 해부하는 동안 수집 튜브에 축적되면, 수집 된 조직을 충당하기 위해 추운 트리 졸 시약 50 ㎕를 추가합니다. </li><li> 오염 방지 실험실 마커를 사용하여 명확하게 하나의 RNase가없는 1.5 ml의 수집을위한 각 조직 유형에 대한 캡 튜브 스냅 레이블을 붙입니다. (트리 졸의 경우 미세 조각) 1.5 ML 튜브 랙 및 액체 질소를 사용하여 한 미세 분말로 조직을 분쇄 동결. 한 번 반복합니다. 1 ml의 트리 졸의 전체 볼륨을 가져와 와동에 의해 지상 조직을 재현 탁. </li><li> 클로로포름 200 ㎕ 씩 첨가하고 잘 혼합한다. 실온에서 5 분 후, 12 ° C에서 15 분 동안 11,000 XG에서 원심 분리기에서 스핀 다운. 주의하여게놈 DNA 필터 컬럼에 직접 수성 층을 추가합니다. 5 분 동안 11,000 X g에서 스핀 다운. 통해 흐름과 피펫으로 섞어의 RNase없는 70 % 에탄올의 동일한 볼륨을 추가합니다. RNA 수집 컬럼에 액체를 전송하고 제공된 지침에 따라 RNA 추출을 계속합니다. </li><li> 정량화 및 정밀 분광 광도계에 총 RNA의 순도를 평가하고 표준 RNA 시퀀싱 방법으로 진행합니다. </li></ol> 5. 정량적 RT-PCR RNA 시퀀싱의 검증 (그림 3) <ol><li> 예측 된 시퀀스 추정 화학 감각 풍부하고 유전자 기능 모두에서의 동적 범위에 걸쳐 상대적인 유전자 발현 수준을 비교하기 위해 가능한 한 많은 유전자를 선택한다. </li><li> 각각의 표적 유전자에 대한 디자인 프라이머 쌍은 특정 100-180 염기쌍 PCR 생성물을 증폭한다. 세트 당 적어도 하나의 프라이머를 확인하여 비특이적 gDNA를 증폭을 제외하면 인트론 경계에 걸쳐있다. 대안 적으로, 게놈 오염을 줄이기 위해 DNase의 처리를 사용한다. </li><li> 수집이전 섹션에 설명 된대로 곤충 조직. 모든 QRT-PCR 반응을 완료하는 데 충분한 RNA를 제공 할 필요가 얼마나 많은 조직 계산한다. 참고 : 생물 세중 및 기술 세중의 반응은 결과에서 최대의 확신을 제공 할 것입니다. </li><li> 생물학적 기술을 모두 각 각 대상 유전자와 평균에 대한 (CT [대상] -ct [참조]) 복제 - X 대상으로 상대 유전자 정량을 계산합니다. 생물학적 복제물 사이 코네티컷 값을 정상화 하우스 키핑 유전자 (들)을 사용하여 상대 표현의 비교에서 Y 축 스케일을 뿌리. </li><li> RNA-SEQ와 회귀 - 기반, 부트 스트랩 절차 등가 구 반복적 각 조직으로부터 데이터에 적용을 사용 QRT-PCR 데이터 세트의 유사도를 평가한다. 주 :이 절차는 관측 된 RNA-SEQ와 QRT-PCR 데이터들로 생성 될 수있는 최소 &quot;유사성의 영역&quot;을 식별하고, qRT- 의해 측정 된 상대적 유전자 발현을 허용PCR-RNA는 서열 번호 상대적 유전자 발현의 측정에 통계적으로 동일하게 간주한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellent+and+deterrent+effects+of+SS220,+picaridin,+and+DEET+suppress+human+blood+feeding+by+Aedes+aegypti,+Anopheles+stephensi,+and+Phlebotomus+papatasi.">Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi.</a> J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).</li><li>Dickens, J. C., Bohbot, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+Mode+of+action+of+mosquito+repellents.Pestic.">Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic.</a> Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).</li><li>Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. 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The authors have nothing to disclose.

미각 sensilla에서 녹음 활동 전위의 가장 어려운 측면이있는 응답을 결정하는 것입니다 &quot;정상적인.&quot;주어진 곤충 종, 총 수 및 미각 수용체 뉴런의 감도 (GRNs)에 대한 첫 번째 시간을 기록하는 하나의 미각 sensillum 팁을 사용하면됩니다 가능성이 알 수 없습니다. 많은 예비 녹음을 먼저 범위 및 테스트하는 화학 물질의 농도를 결정해야합니다. 이 경우에, 우리는 단일 GRN DEET (도 1)의</strong...

DEET, 피카, 시트로 넬랄 및 IR3535 등의 화합물을 효과적으로 1,2 aegypti 중요한 질병 벡터 Aedes을 포함하여 모기를 격퇴하는 것으로 나타났다. 우리는 모기 반발과 관련된 세포를 결정하기 위해 특정 미각 sensilla과 관련된 감각 뉴런에서 활동 전위를 기록한다. 이러한 조직에서 발현 유전자의 하류 서열과 결합, 우리는 개선 발수 기능에 대한 새로운 화합물을 스크리닝하기 위해 가장 가능성이 세포의 반응을 매개하는 유전자를 식별 할 수있다. RNA-SEQ 신속 유전자 발현에 시간적, 공간적 변화를 추적하기위한 표준이되고, 강력한 도구입니다. RNA-서열은 곤충 화학 감각 부속 분석과 기관은 크게 유전자 (6)에 의해 기존의 PCR 기반 검색 유전자에 개선, 여러 종의 곤충 3-5 분자 수용체를 발견하는 데 사용되었다. 곤충은 가장 다양한 동물 클래스를 나타냅니다, 사전많은 기회를 공무 원은 유전자와 독특한 표현형 사이의 연결을 공부한다. RNA-서열 기술은 살아있는 곤충 조직에 이용 될 수있다. 마찬가지로, 미각 uniporous sensilla 감각 세포 내에서 전기 생리 학적 기록은 다양한 곤충 종으로 달성 될 수있다. 이 두 기술의 페어링은 연구자가 관찰 화학 감각 표현형에 포함 된 세트 유전자를 좁힐 수 있습니다. 다른 종은 특정 과제를 제시하지만, 화학 감각 수용체 유전자와 화학 감각 적응 사이의 연결을 알릴 수있다. 크기와 화학 감각 sensilla의 형태는 가변적이며 노이즈를 줄이고 반복 신호를 식별하는 활동 전위를 기록 할 때 광범위한 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 화학 감각 기관의 해부는 사소한 또는 섬세하고 시간이 곤충의 형태와 크기에 따라 소비 할 수있다. 고품질 RNA의 이러한 복구 중에 특정의 안료를 피로서뿐만 아니라, 약간의 문제가 필요할 수조직 수집. 행동 시험을 통해 발수 화합물의 효과를 입증하는 직접적이고 유익한 반면,이 방법은 시간의 동작 메커니즘에 대해서 집중적 넓다. RNA-서열과 결합 전기 생리학은 곤충 회피 행동을 원동력의보다 구체적인 분석이 가능합니다. 화학 차별 &quot;툴킷&quot;곤충 종 식별되면,보다 구체적인 시도는 알려진 방충제이 가능에 향상시킬 수 있습니다. 이러한 행동에 대한 책임을 감각 세포의 수용체와 관련된 단백질은 직접 화학적 스크리닝을 위해 이종 표현 될 수있다. 또한, 분자 모델링 화학 물질이 수용체 7에서 강한 반응을 이끌어내는 것이다 예측할 수있다. 화학 감각 조직의 좁은 세트의 모든 활성 유전자의 스냅 샷은 다른 종에서 비슷한 유전자를 식별하는 데 유용 할 수있다. 서열 상 동성 및 표현시 사용milarities, 연구자들은 대부분 곤충에 광범위하게 효과가 기피제에 대한 응답을 매개 분자 수용체의 세트를 형성 할 수있다. 우리는 곤충 화학 감각 경로를 해체 연구자를 돕기 위해 비 모델과 경제적으로 중요한 곤충의 neuroethology으로 탐구하는 것이 더 설득하기 위해 다음과 같은 프로토콜을 제시한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1272">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:367px;">Company</td>
			<td style="width:189px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:467px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:367px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:189px;">628000</td>
			<td>Standard, 1.5mm X 0.86mm, 4&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Silver wire</td>
			<td style="width:367px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:189px;">7875</td>
			<td>.015&#34; bare</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tungsten wire</td>
			<td style="width:367px;">Alfa Products</td>
			<td style="width:189px;">369</td>
			<td>0.127mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:367px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:189px;">11252</td>
			<td>#5SF Inox</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Refridgerated stage</td>
			<td style="width:367px;">BioQuip Products</td>
			<td style="width:189px;">1429</td>
			<td>Chill Table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Preamplifier</td>
			<td style="width:367px;">Syntech</td>
			<td style="width:189px;">Taste Probe</td>
			<td style="width:467px;">preamplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Software for electrophysiology</td>
			<td style="width:367px;">Syntech</td>
			<td style="width:189px;">Autospike</td>
			<td style="width:467px;">software for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">TetraMin fish food</td>
			<td style="width:367px;">Tetra</td>
			<td style="width:189px;">Tropical fish food granules</td>
			<td>fish food ground to fine powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596-026</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:189px;">74136</td>
			<td style="width:467px;">includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Nano Drop Products</td>
			<td style="width:189px;">ND-1000</td>
			<td>tabletop spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:251px;">R statistics</td>
			<td style="width:367px;">freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)</td>
			<td>www.r-project.org</td>
			<td>Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1.5ml tube rack</td>
			<td style="width:367px;">Evergreen</td>
			<td style="width:189px;">240-6388-030</td>
			<td>Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1.5mL collection tubes with pestle</td>
			<td style="width:367px;">Grainger</td>
			<td style="width:189px;">6HAX6</td>
			<td>RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11178160</td>
			<td>Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 mL tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primer-BLAST Primer Designing tool</td>
			<td style="width:367px;">NCBI</td>
			<td style="width:189px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

애에서 활동 전위의 추적 기록. aegypti 미각 sensilla (도 1) 화학 약품의 범위와 직접 자극의 효과를 입증한다. 이 기술은 합리적인 시간 범위 (일반적으로 적은 500 ms보다)를 통해 주어진 진폭과 지속 시간의 스파이크를 계산하여 어떤 자극하는 화학 물질에 대한 응답을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 추적 기록은 실험 조건 주어진 조건에서 쉽게 재현 할 수 있어야합니...

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Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

전기 생리 학적 시험에 의해 측정 Aedes aegypti의 주요 부속 미각 유전자 발현을 추정하기 위해 두 가지 방법을 사용하여, 우리는, 추정되는 쓴맛 반발 화합물 신경 반응을 기본 유전자 세트를 확인했다.

생리 녹음 및 황열병 모기의 미각 부속 기관의 RNA 시퀀싱<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

8.0K 조회수.  United States Department of Agriculture.  전기 생리 학적 시험에 의해 측정 Aedes aegypti의 주요 부속 미각 유전자 발현을 추정하기 위해 두 가지 방법을 사용하여, 우리는, 추정되는 쓴맛 반발 화합물 신경 반응을 기본 유전자 세트를 확인했다. 

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Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

더 나은 모스키토 구축 : A. gambiae 및 A. aegypti 모기에 말라리아와 뎅그열 발열 저항을 사용 유전자를 확인

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

연구

생물학

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

모기 내장 Metagenomic RNA-seq에 대한 Ribosomal RNA의 고갈

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

아시아 타이거 모기에 Photoperiodic 휴면의 RNA-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

지방 기관 문화 시스템 Aedes Aegypti, Zika 바이러스 벡터에

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Aedes aegypti 모기 감염 Wolbachia 유지

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 Aedes aegypti에 대한 개선 된 Fecundity 및 불임 분석 (EAgaL 플레이트)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...