Name: physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti
Uploaded: 2014-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
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The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

1. 양육 애. aegypti 성인 <ol><li> 얕은 트레이에 약 ¾ 인치 물에 해치 계란. 과밀 수용은 성인의 크기를 줄일 수 있습니다. </li><li> 후면 유충 25 ° C (12 헥토 리터 : 12-HD)에 지상 물고기 음식으로 공급. 주 : 과잉 사료가 생존율을 감소시킬 수있다. </li><li> 매일 파스퇴르 피펫에 의해 개별적으로 번데기를 제거하고, 따라서 24 시간 연령 그룹을 설립, 미세 메쉬 뚜껑 플라스틱 접시에 작은 봉쇄 버킷 내부 (5.5 cm × 9cm)를 전송합니다. </li><li> 케이지 하우징의 화면 벽에 배치면 공에 의해 피드 성인 모기의 10 % 자당 용액 애벌레와 같은 광주에서 27 ° C 및 70 % 상대 습도 환경 챔버의 모기. </li><li> 전기 생리학의 경우 5 ~ 10 일 이전 동물을 사용합니다. 일반적으로, 더 큰 동물 나은 결과를 산출 할 것이다. RNA 분리의 경우, 5-10 일 이전 범위의 단일 24 시간 연령 그룹 내에있는 동물을 사용합니다. </li></ol><ol><li> 선택된 감각 뉴런에서 최소한의 활동을 이끌어 전해질 (예 : 1 ~ 10 mM의)의 적절한 농도를 결정합니다. 10 mM의 염화나트륨 또는를 1mM의 KCl 실험을 시작할 때 기본 활동을 테스트하기 위해 합리적인 전해질 수 있습니다. </li><li> 혼자 전해질에 비해 스파이크 활동에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 각 실험 적당한 용매 화학 (그렇지 않으면 물 사용 에탄올 또는 DMSO)에 용해. 10 % 에탄올, 1 % DMSO의 최종 농도는 적당한 출발 농도이다. </li><li> 곤충의 먹이 방어벽이나 자극을 잘 설명되어 제어 화학 물질 (달콤한에 대한 쓴 또는 자당에 대한 예를 들어, 말라리아) 적절한를 선택합니다. </li></ol> 3. 전기 생리학 (8 팁 기록 1 그림) <ol><li> 기계적으로 유리 모세관을 당겨 양식 유리 전극. 열을 최적화하고 적절하게 모양 recordi를 형성하기 위해 유리를 끌어 설정을 당겨NG 전극. 조심스럽게 그 대상을 sensillum 봉투 좁아서하지만 인접 구조물과의 접촉을 피하기 위해 충분히 작은 개구 전극 팁을 만들 해부 현미경 집게를 사용하여 유리 전극의 단부를 끊는. </li><li> 현미경 하에서 시각적 형태에 의해 식별 및 팁 기록 반복성을 보장하기 위해 목표 sensilla / sensillum 위치. 준비 동물 전극 항목의 각도에서 sensilla에 무료로 액세스를 허용합니다. </li><li> -20 ° C에서 냉동실에 콜드 마취 성인 곤충. 차가운 온도에 과다 노출에 의해 주변 신경 세포의 손상을 방지. 유리 슬라이드에 면도날 셀로판 테이프의 좁은 스트립을 잘라. 좁은 스트립을 사용하여 유리 슬라이드에 고정시킨다 전체 곤충. </li><li> 무관심 (접지) 전극 역할을하는 등의 흉부 또는 눈에 화학적으로 날카롭게 텅스텐 와이어를 삽입합니다. </li><li> 관심의 자극 솔루션 단계 3.1에서 만든 유리 전극을 입력합니다. 삽입 된 주사기를 사용하여 캡을 채우기뽑아 끝에서 illary는 끝을 무디게합니다. 헐 끝을 잡고, 모든 공기 방울을 쓸어 넘기. 기록 및 자극 전극 역할을하는 단계 3.1에서 만든 유리 전극에 실버 와이어 (chloriding 옵션)를 삽입합니다. </li><li> 곤충에 연락처 chemoreceptive의 sensilla에서 녹음 용으로 설계된 프리 앰프에 전극을 연결합니다. 이 프리 앰프 (300 HZ-3 kHz의 대역 통과 필터)는 가능한 한 도입 자극에 가까운 신경 세포의 활동을 캡처 안정 시간을 줄일 수 있습니다. 수집, 저장 및 스파이크 기록 소프트웨어를 구비 한 마이크로 컴퓨터를 이용하여 전기 신호를 분석한다. 주 : 대폭 신호 대 잡음비를 개선 할 수있다 적절히 녹화 설정을 접지. </li><li> 기능성을 보장하기 위해 제어 용액 (전해질 만)으로 sensilla을 자극한다. 모든 준비에 대한 자극 이슈 다음 200 밀리 초를 시작 스파이크를 계산합니다. </li><li> 용량 - 반응 연구를 제외하고, 모든 실험에 대해 테스트 약품의 순서를 랜덤 화,편견을 제거합니다. 용량 - 반응 연구를위한, 실험 화학 물질의 농도를 증가시키는 sensilla 노출. 적절한 복구를 보장하는 자극 사이의 3 분의 최소 허용. 참고 :이 요구 사항은 곤충과 sensilla에 따라 다를 수 있습니다. 임계치는 표준 오차가 시험 된 최소 농도의 표준 오차와 중복되지 않는 것을위한 농도로 정의된다. </li></ol> 4. RNA의 분리 및 시퀀싱 (그림 2) <ol><li> 단단히 스냅 캡 튜브에 맞게 조직 disruption.Prepare 동반 된 RNase없는 방앗 전에 드라이 아이스에 그들을 냉각하여 밀착 RNAse가없는 방앗를 준비합니다. 적극적으로 초과 응축을 방지하기 위해 해부하지 않는 폐쇄 수집 튜브를 유지합니다. </li><li> 필터링 흡입기를 사용하여, 30 ~ 40 냉간 마취 모기 (° C의 냉동고 -20에서 15 초) 감기 무대와 종류의 성별을 배치합니다. 장소 동물 맛 부속을 손상하지 않도록 날개를 잡고, 아래 쪽 지느러미.</li><li> 미세 두 쌍의 집게를 사용하여 해부 현미경 수컷 또는 암컷에서, 페어링 라벨라 또는 tarsi 해부 및 인접 조직의 포함을 제한한다. 참고 : 500 쌍 라벨라 총 mRNA의 약 800 ~ 1,000 나노 그램을 얻을 수 있습니다. (400) 개인 tarsi (5 세그먼트 각) 총 mRNA를 1,200-1,800 나노 그램을 얻을 수 있습니다. </li><li> 허걱 - 포셉 한 쌍, 가볍게 내부 stylets 노출 라벨라에 바로 인접 모기 코를 잡고. 컬렉션 포셉의 다른 쌍을 사용하여, 라벨라를 제거하고 차가운 수집 관의 측면에 조직을 추가합니다. </li><li> 포셉 한 쌍, 가볍게 경골 먼저 눈꺼풀 세그먼트의 교차점에 모기 다리를 잡고. 포셉의 다른 쌍을 사용하여, tarsi를 제거하고 차가운 수집 관의 측면에 조직을 추가합니다. 참고 : 원 원치 않는 조직의 인터페이스에서 계정에 세포 유형을 가져 가라. 조직은 이웃의 포함을 제한하는 것이 중요하지만, 그것은 조직의 원하는 부분을 생략하지 않는 것도 중요하다. Fi를최종 샘플은 정확하게 관심의 전체 기관을 대표해야합니다. 수집 집게 정확하게 벗기거나 만 원하는 조직을 잡아 해방 할 수 있도록 쥐고 집게로 정확한 경계를 만듭니다. </li><li> 주기적으로 튜브의 맨 아래에있는 조직을 유지하기 위해 9,000 XG에서 간단히 0 ° C 원심 분리기 컬렉션 튜브를 스핀 다운. 수분이 해부하는 동안 수집 튜브에 축적되면, 수집 된 조직을 충당하기 위해 추운 트리 졸 시약 50 ㎕를 추가합니다. </li><li> 오염 방지 실험실 마커를 사용하여 명확하게 하나의 RNase가없는 1.5 ml의 수집을위한 각 조직 유형에 대한 캡 튜브 스냅 레이블을 붙입니다. (트리 졸의 경우 미세 조각) 1.5 ML 튜브 랙 및 액체 질소를 사용하여 한 미세 분말로 조직을 분쇄 동결. 한 번 반복합니다. 1 ml의 트리 졸의 전체 볼륨을 가져와 와동에 의해 지상 조직을 재현 탁. </li><li> 클로로포름 200 ㎕ 씩 첨가하고 잘 혼합한다. 실온에서 5 분 후, 12 ° C에서 15 분 동안 11,000 XG에서 원심 분리기에서 스핀 다운. 주의하여게놈 DNA 필터 컬럼에 직접 수성 층을 추가합니다. 5 분 동안 11,000 X g에서 스핀 다운. 통해 흐름과 피펫으로 섞어의 RNase없는 70 % 에탄올의 동일한 볼륨을 추가합니다. RNA 수집 컬럼에 액체를 전송하고 제공된 지침에 따라 RNA 추출을 계속합니다. </li><li> 정량화 및 정밀 분광 광도계에 총 RNA의 순도를 평가하고 표준 RNA 시퀀싱 방법으로 진행합니다. </li></ol> 5. 정량적 RT-PCR RNA 시퀀싱의 검증 (그림 3) <ol><li> 예측 된 시퀀스 추정 화학 감각 풍부하고 유전자 기능 모두에서의 동적 범위에 걸쳐 상대적인 유전자 발현 수준을 비교하기 위해 가능한 한 많은 유전자를 선택한다. </li><li> 각각의 표적 유전자에 대한 디자인 프라이머 쌍은 특정 100-180 염기쌍 PCR 생성물을 증폭한다. 세트 당 적어도 하나의 프라이머를 확인하여 비특이적 gDNA를 증폭을 제외하면 인트론 경계에 걸쳐있다. 대안 적으로, 게놈 오염을 줄이기 위해 DNase의 처리를 사용한다. </li><li> 수집이전 섹션에 설명 된대로 곤충 조직. 모든 QRT-PCR 반응을 완료하는 데 충분한 RNA를 제공 할 필요가 얼마나 많은 조직 계산한다. 참고 : 생물 세중 및 기술 세중의 반응은 결과에서 최대의 확신을 제공 할 것입니다. </li><li> 생물학적 기술을 모두 각 각 대상 유전자와 평균에 대한 (CT [대상] -ct [참조]) 복제 - X 대상으로 상대 유전자 정량을 계산합니다. 생물학적 복제물 사이 코네티컷 값을 정상화 하우스 키핑 유전자 (들)을 사용하여 상대 표현의 비교에서 Y 축 스케일을 뿌리. </li><li> RNA-SEQ와 회귀 - 기반, 부트 스트랩 절차 등가 구 반복적 각 조직으로부터 데이터에 적용을 사용 QRT-PCR 데이터 세트의 유사도를 평가한다. 주 :이 절차는 관측 된 RNA-SEQ와 QRT-PCR 데이터들로 생성 될 수있는 최소 &quot;유사성의 영역&quot;을 식별하고, qRT- 의해 측정 된 상대적 유전자 발현을 허용PCR-RNA는 서열 번호 상대적 유전자 발현의 측정에 통계적으로 동일하게 간주한다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

미각 sensilla에서 녹음 활동 전위의 가장 어려운 측면이있는 응답을 결정하는 것입니다 &quot;정상적인.&quot;주어진 곤충 종, 총 수 및 미각 수용체 뉴런의 감도 (GRNs)에 대한 첫 번째 시간을 기록하는 하나의 미각 sensillum 팁을 사용하면됩니다 가능성이 알 수 없습니다. 많은 예비 녹음을 먼저 범위 및 테스트하는 화학 물질의 농도를 결정해야합니다. 이 경우에, 우리는 단일 GRN DEET (도 1)의</strong...

DEET, 피카, 시트로 넬랄 및 IR3535 등의 화합물을 효과적으로 1,2 aegypti 중요한 질병 벡터 Aedes을 포함하여 모기를 격퇴하는 것으로 나타났다. 우리는 모기 반발과 관련된 세포를 결정하기 위해 특정 미각 sensilla과 관련된 감각 뉴런에서 활동 전위를 기록한다. 이러한 조직에서 발현 유전자의 하류 서열과 결합, 우리는 개선 발수 기능에 대한 새로운 화합물을 스크리닝하기 위해 가장 가능성이 세포의 반응을 매개하는 유전자를 식별 할 수있다. RNA-SEQ 신속 유전자 발현에 시간적, 공간적 변화를 추적하기위한 표준이되고, 강력한 도구입니다. RNA-서열은 곤충 화학 감각 부속 분석과 기관은 크게 유전자 (6)에 의해 기존의 PCR 기반 검색 유전자에 개선, 여러 종의 곤충 3-5 분자 수용체를 발견하는 데 사용되었다. 곤충은 가장 다양한 동물 클래스를 나타냅니다, 사전많은 기회를 공무 원은 유전자와 독특한 표현형 사이의 연결을 공부한다. RNA-서열 기술은 살아있는 곤충 조직에 이용 될 수있다. 마찬가지로, 미각 uniporous sensilla 감각 세포 내에서 전기 생리 학적 기록은 다양한 곤충 종으로 달성 될 수있다. 이 두 기술의 페어링은 연구자가 관찰 화학 감각 표현형에 포함 된 세트 유전자를 좁힐 수 있습니다. 다른 종은 특정 과제를 제시하지만, 화학 감각 수용체 유전자와 화학 감각 적응 사이의 연결을 알릴 수있다. 크기와 화학 감각 sensilla의 형태는 가변적이며 노이즈를 줄이고 반복 신호를 식별하는 활동 전위를 기록 할 때 광범위한 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 화학 감각 기관의 해부는 사소한 또는 섬세하고 시간이 곤충의 형태와 크기에 따라 소비 할 수있다. 고품질 RNA의 이러한 복구 중에 특정의 안료를 피로서뿐만 아니라, 약간의 문제가 필요할 수조직 수집. 행동 시험을 통해 발수 화합물의 효과를 입증하는 직접적이고 유익한 반면,이 방법은 시간의 동작 메커니즘에 대해서 집중적 넓다. RNA-서열과 결합 전기 생리학은 곤충 회피 행동을 원동력의보다 구체적인 분석이 가능합니다. 화학 차별 &quot;툴킷&quot;곤충 종 식별되면,보다 구체적인 시도는 알려진 방충제이 가능에 향상시킬 수 있습니다. 이러한 행동에 대한 책임을 감각 세포의 수용체와 관련된 단백질은 직접 화학적 스크리닝을 위해 이종 표현 될 수있다. 또한, 분자 모델링 화학 물질이 수용체 7에서 강한 반응을 이끌어내는 것이다 예측할 수있다. 화학 감각 조직의 좁은 세트의 모든 활성 유전자의 스냅 샷은 다른 종에서 비슷한 유전자를 식별하는 데 유용 할 수있다. 서열 상 동성 및 표현시 사용milarities, 연구자들은 대부분 곤충에 광범위하게 효과가 기피제에 대한 응답을 매개 분자 수용체의 세트를 형성 할 수있다. 우리는 곤충 화학 감각 경로를 해체 연구자를 돕기 위해 비 모델과 경제적으로 중요한 곤충의 neuroethology으로 탐구하는 것이 더 설득하기 위해 다음과 같은 프로토콜을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>Glass capillary</td><td>A-M Systems</td><td>628000</td><td>Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4&quot;</td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>A-M Systems</td><td>7875</td><td>.015&quot; bare</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>Alfa Products</td><td>369</td><td>0.127 mm diameter</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252</td><td>#5SF Inox</td></tr><tr><td>Refridgerated stage</td><td>BioQuip Products</td><td>1429</td><td>Chill Table</td></tr><tr><td>Preamplifier</td><td>Syntech</td><td>Taste Probe</td><td>preamplifier</td></tr><tr><td>Software for electrophysiology</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td>software for electrophysiology</td></tr><tr><td>TetraMin fish food</td><td>Tetra</td><td>Tropical fish food granules</td><td>fish food ground to fine powder</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA isolation reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Nano Drop Products</td><td>ND-1000</td><td>tabletop spectrometer</td></tr><tr><td>R statistics</td><td>freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)</td><td>www.r-project.org</td><td>Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.</td></tr><tr><td>1.5 ml tube rack</td><td>Evergreen</td><td>240-6388-030</td><td>Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.</td></tr><tr><td>1.5 ml collection tubes with pestle</td><td>Grainger</td><td>6HAX6</td><td>RNase free</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>11178160</td><td>Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.</td></tr><tr><td>Primer-BLAST Primer Designing tool</td><td>NCBI</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

애에서 활동 전위의 추적 기록. aegypti 미각 sensilla (도 1) 화학 약품의 범위와 직접 자극의 효과를 입증한다. 이 기술은 합리적인 시간 범위 (일반적으로 적은 500 ms보다)를 통해 주어진 진폭과 지속 시간의 스파이크를 계산하여 어떤 자극하는 화학 물질에 대한 응답을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 추적 기록은 실험 조건 주어진 조건에서 쉽게 재현 할 수 있어야합니...

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Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

전기 생리 학적 시험에 의해 측정 Aedes aegypti의 주요 부속 미각 유전자 발현을 추정하기 위해 두 가지 방법을 사용하여, 우리는, 추정되는 쓴맛 반발 화합물 신경 반응을 기본 유전자 세트를 확인했다.

생리 녹음 및 황열병 모기의 미각 부속 기관의 RNA 시퀀싱<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

physiological-recordings-rna-sequencing-gustatory-appendages-yellow

Research

JoVE Journal

Biology

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

8.0K 조회수.  United States Department of Agriculture.  전기 생리 학적 시험에 의해 측정 Aedes aegypti의 주요 부속 미각 유전자 발현을 추정하기 위해 두 가지 방법을 사용하여, 우리는, 추정되는 쓴맛 반발 화합물 신경 반응을 기본 유전자 세트를 확인했다. 

비디오: Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

곤충의 단일 Sensillum 레코딩 Drosophila melanogaster과 아노 펠 레스 gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

연구

신경과학

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

애에서 Midgut과 침샘의 해부. aegypti 모기

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

생물학

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

옐로 피버 모스키토에서 Hemocytes를 수집 및 스테 이닝을위한 프로토콜 Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

면역학 및 감염병학

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

CRISPR-Cas9을 이용한 황열병 모기 이집트숲모기(Mosquito Aedes aegypti )의 게놈 편집

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

유전학

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Aedes aegypti 모기에서 동물 유래 혈액 및 인공 식사 먹이주기 및 정량화

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong preference for human hosts over other warm-blooded animals for blood meals. Olfactory cues play a critical role for mosquitoes as they explore their environment and seek a human host to obtain blood meals, thus transmitting human diseases. Odorant receptors (ORs) expressed in the olfactory sensory neurons are known to be responsible for the interaction of mosquito vectors with human odors. To gain deeper insights into Ae. aegypti&#8217;s olfactory physiology and investigate their interactions with humans at the molecular level, we used an optimized protocol of Xenopus Oocytes heterologous expression to functionally analyze Ae. aegypti odorant receptors in response to human odors. Three example experiments are presented: 1) Cloning and synthesizing cRNAs of ORs and odorant receptor co-receptor&#160;(Orco) from four to six days old Ae. aegypti antennae; 2) Microinjection and expression of ORs and Orco in Xenopus oocytes; and 3) Whole-cell current recording from Xenopus oocytes expressing mosquito ORs/Orco with a two-electrode voltage-clamp. These optimized procedures provide a new way for researchers to investigate human odor reception in Aedes mosquitoes and reveal the underlying mechanisms governing their host-seeking activity at a molecular level.

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

A protocol is presented that functionally characterizes mosquito ORs in response to human odors using a Xenopus oocyte expression system coupled with a two-electrode voltage clamp, providing a powerful new technique for exploring the responses of mosquitoes ORs to exposure to human odors.

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

아시아 타이거 모기에 Photoperiodic 휴면의 RNA-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

지방 기관 문화 시스템 Aedes Aegypti, Zika 바이러스 벡터에

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

생리 녹음 및 황열병 모기의 미각 부속 기관의 RNA 시퀀싱

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Aedes aegypti 모기에서 동물 유래 혈액 및 인공 식사 먹이주기 및 정량화

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

아시아 타이거 모기에 Photoperiodic 휴면의 RNA-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜,

지방 기관 문화 시스템 Aedes Aegypti, Zika 바이러스 벡터에

차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여