The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.

참고 :이 문서에 설명 된 모든 절차가 미시간 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설립 지침에 따라 수행된다. 1. 시스템 준비 및 설정 <ol><li> 50 ㎖ 티슈 화장실까지 사용 조직 조 수축 실험에 필요한 양이 생리 식염수 (PSS) 5 L의 확인; PSS 조리법에 대한 표 2를 참조하십시오. 필요한 조직 세척의 숫자로 곱한 후 조직 화장실의 수 배에 목욕 볼륨을 곱에 의해 필요한 총 부피를 계산합니다. <ol><li> PSS을 지침으로 표 2를 사용합니다. 물 약 4 L의 염을 녹여. 참고 : HPLC - 유형 I 물을 권장합니다 </li><li> 엔드 솔루션 1.6 mM의 칼슘 그래서,이 용액에 (이수화 염을 사용하는 경우 147g / L) 1 M CaCl2를 솔루션 8 ML을 추가합니다. </li><li> 5 L.에 양자 sufficit PSS 솔루션 </li></OL&gt; </li><li> 순환 온수 목욕을 설정하여 37 ° C로 조직 목욕 시스템을 예열한다. 중요한 단계 : 시스템의 각 구성 요소들이 서로 직렬로 연결되어 있는지 확인, 물 재킷이다. 흐름의 방향은 중요하다 - 가장 높은 가시 연결에 가장 낮은 가시 연결에서 밖으로 각 구성 요소에 물 흐름을 보장합니다. </li><li> 데이터 수집 시스템을 켭니다. 실험 전에 힘 트랜스 듀서 적어도 15 분에 전원 온도를 평형합니다. 주 : 대부분의 힘 센서가 온도 변화에 민감하고 전원이인가 된 후 처음 열 드리프트를 전시 스트레인 게이지를 사용합니다. </li><li> 실행 데이터 수집 소프트웨어 및 데이터 수집 시스템과의 연결을 보장한다. 데이터 기록을 가능하게하는 제조 지침을 따르십시오. </li><li> 힘 센서가 조직이 조직 조 및 데이터 기록이 시작되기 전에 배치되기 전에 교정해야합니다; FO교정 llow 제조사의 지시. </li><li> 95 %, O2 / 5 % CO 2 의료용 가스 실린더에 조직 목욕 시스템을 연결하고 가스 누출을 점검 한 다음 시스템을 가압. </li><li> PSS와 조직 조 저수지 채우고 용액 시간은 최적 온도에 도달 할 수있다. 프라임 시스템 및이 시스템 및 튜브 내의 기포를 제거한다. </li><li> PSS 버퍼에 산소와 실험 기간 동안 조직 조에서 소개 될 예정 약물을 배포하는 브라운 운동을 제공 일관된 솔루션 폭기를 보장하기 위해 조직 목욕 폭기 장치를 확인합니다. 확인 폭기 / 거품 데이터 레코딩을 중단 할 조직의 움직임을 유발하지 않는다; 필요에 따라 가스 흐름을 감소시킨다. 참고 : 조직 목욕 및 데이터 수집 시스템은 이제 실험을 시작할 수 있습니다. </li></ol> 2. 조직 준비 <ol><li> 이상적으로, 동물에서 조직을 해부 직전에 사용하고 내가 직접 배치NTO PSS. 참고 : 일부 조직은 4 ° C에서 하룻밤 PSS에 저장 될 수 있지만, 적절한 컨트롤을 장기간 보관 후 조직의 기능을 검증하기 위해 수행해야합니다; 6 절을 참조하십시오. </li><li> 이 운동의 조직으로 흉부 대동맥을 사용합니다. </li><li> 제도적 지침에 따라 쥐를 마취 아래로 쥐의 등쪽을 배치합니다. 발가락 핀치이 고통스러운 자극에 대한 반사 반응의 손실을 통해 마취를 확인합니다. 참고 :이 프로토콜은 복강 내 주사를 통해 전달 펜 토바 비탈의 70 ㎎ / ㎏을 사용합니다. 쥐 마취에 대한 제도적 지침과 다를 수 있습니다. </li><li> 흉곽의 하단에있는 진동판을 따라 가위로 절개를 작성하여 기흉을 만듭니다. 그런 다음, 흉골에 흉곽의 바닥에서 절개를 계속 양분. </li><li> 멀리 해부 또는 척추의 상단에있는 그 장기를 따로 배치하고 척추를 따라 직접 거짓말 대동맥을 찾습니다. 참고 :이 STEP는 대동맥을 해부 할 수있는 충분한 작업 공간을 제공합니다. </li><li> 대동맥에 대한 모든 연결을 끊다; 및 식도, 폐, 등에서 진동판의 수준에서 척추에 수직 대동맥을 잘랐다. </li><li> 부드럽게 집게로 대동맥을 잡고 척추에서 대동맥을 해부 가위를 사용합니다. 심장을 향해 척추와 작업에 인접한 낮은 조리개 영역에서 해부를 시작합니다. 조직에 손상을 줄 수 있습니다 대동맥 조직에 추가 당기지하기 위해 예방 조치 또는 예인선을해야합니다. </li><li> 즉시 PSS를 포함하는 준비된 해부 접시에 대동맥을 배치합니다. 참고 : 반지에 대동맥의 해부 가장 검은 실라 스​​틱 기반을 가지고 해부 접시에 이루어집니다. 이는 해부 접시에 안정성을 제공하면서, 대동맥 cannulate하고 접시에 체결 될 수있다 와이어의 사용을 허용한다. 검은 배경 해부 에이즈 대비를 제공합니다. 케어는 내피로 cannulating 와이어의 사용에주의가 필요합니다원점이라 세포층 용기의 와이어 루멘에 대해 과량의 마찰에 의해 제거 될 수있다. </li><li> 와이어를 타고 한 쪽 끝에 작은 90 ° 각도를하고 가이드 와이어를 고정하기 위해 실라 스​​틱 기반에 각진 끝을 밀어 넣습니다. 해부 접시에 전체 대동맥를 놓습니다. </li><li> 집게와 가이드 와이어의 끝을 잡고 부드럽게 대동맥의 루멘에 와이어를 스레드. </li><li> 집게를 사용하고 와이어에 대동맥을 밀어 넣습니다. 가이드 와이어의 자유 단부는 볼 곡선 부드럽게 와이어이며 조직을 안정화시키기 위해 접시의 실라 스​​틱 파운데이션에 자유 단을 배치하는 경우. </li><li> 흉부 대동맥은 흰색과 다소 섬유 나타날 때까지 작은 vannas 가위와 집게를 사용하는 등 혈관 주위 지방 조직과 다른 모든 관계없는 조직, 혈전을 제거합니다. </li><li> 와이어에서 청소 대동맥을 제거하고 폭 약 3-5mm이다 반지의 대동맥을 잘라 가위를 사용합니다. </li><li> TI의 쌍 중 하나에 대동맥 고리를 배치후크를 잡고 부드럽게 후크 위에 반지를 슬라이드 집게를 사용하여 ssue 후크. 두 번째 훅이 과정을 반복합니다. 복잡하게 얽힌하지 않는 후크를 보장하기 위해주의; 그림 3 참조. </li><li> 각 후크가 부착 된 다른 실크 봉합사를 가지고 있는지 확인하십시오. 다른 손으로 묶여 힘 변환기에있을 것입니다 10-4cm 긴 조각 봉합 동안 하나의 후크, 유리 또는 스테인리스 스틸 막대에 부착을 허용 실크의 작은 매듭 루프를 가지고 있는지 확인; 그림 3 참조. 주 : 대동맥가 후크 고정되면, 조직은 조직 조 내에 장착 될 준비; 그림 3 참조. </li><li> 반복하여 두 번째 조직 목욕 실에서 제 대동맥 고리를 탑재, 2.14-2.15 단계를 반복합니다. </li></ol> 목욕 3. 조직 배치 <ol><li> 이 시스템에서, 조직 화장실 자체가 고정되어 있습니다. 이 때, 그리고 온도에 와서 솔루션을 따뜻하게, 폭기 PSS와 조직 화장실을 채우기 허용전자. </li><li> 실크 봉합사로, 스테인리스 스틸 막대에 말뚝에 조직 준비의 고리 중 하나를 묶어. 조직 목욕 챔버로이 끝을 놓습니다. 링 스탠드에로드를 연결하고 버퍼에 몰입 조직을 유지하기 위해 PSS 가득 염색 접시에 다른 쪽 끝을 배치; 그림 3 참조. <ol><li> 조직 목욕 챔버에서로드와 조직을 배치하고 조직이 완전히 PSS에 침지하고로드가 안전해야합니다; 그림 3 참조. </li><li> 힘 변환기에 다른 봉합을 묶어 조직과 힘 센서 사이의 봉합에 느슨하게해야합니다. 참고 :이 느슨 마이크로 미터를 조정하여 제거됩니다; 그림 3 참조. </li></ol></li><li> 두 번째 대동맥 링과 조직 조 챔버에 대해 이러한 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 수동 장력 설정 주 : 각 조직은 평활근 세포가 OPTIMA 응답하는 길이 (LO)가에서야. 예비 실험은 각각의 조직 유형에 대해 수행되어야이 길이 검사 할 달성 최적 연신 장력을 결정한다. 쥐 흉부 대동맥 4g의 최적의 수동적 스트레칭 긴장이있다. <ol><li> 2g에 장력을 증가시키고 고원 도달하는 조직 기다릴 마이크로 미터 / 랙과 피니언을 사용한다. 고원에 도달하면, 긴장 또 다른 2g을 높이고 고원에 조직을 기다립니다. 참고 : 2g의 초기 장력이 설정 고원에 도달 한 후 대동맥 고리에서, 조직은 다음 ~ 1.6 g에 휴식을 취한다. 2g의 두 번째 응용 프로그램은 ~에 조직이 다시 긴장하고 긴장이 감소되는 3.6 g을, 조직을 가져올 것입니다. 따라서, 총 장력 4g을 첨가 한 후, 소프트웨어는 장력의 약 3.2 g을 나타내야한다. </li><li> 두 번째 대동맥 링과 조직 조 챔버에 대해 이러한 단계를 반복합니다. </li></ol> 5. 평형의 약국 만들기 <ol><li> 의 조직을 평형조직에 수동적 긴장을 적용한 후 60 분. </li><li> 평형 단계에서 조직마다 15 ~ 20 분을 씻는다. 조직 목욕을 배출하고 따뜻하게 저수지에서 PSS와 PSS를 교체합니다. 주 :이 시간 동안, 조직을 수동 장력의 손실에 의해 지시되는, 긴장한다. </li><li> 이 시간 동안, 그래서 약물 콘텐츠의 단지 소량이 원하는 농도를 달성하기 위해 필요한, ​​욕중의 실제 농도보다 적어도 1000 배 더 집중 될 필요가 실험 약물을 준비한다. </li></ol> 6. 초기 도전 <ol><li> 평형 기간의 끝에서, 조직을 한 번 씻어 최종 데이터를 저장하고, 모든 입력을 다시 제로. </li><li> 조직이 응답되는 (활성 수축의 원인이됩니다 화합물) 작용제를 선택합니다. 주 : 래트 흉부 대동맥, 동맥 평활근 적극적 기인의 신경 분포에 알파 아드레날린 수용체 작용 물질로 수축한다교감 신경계에 의해 조직. 아드레날린 작용제 아드레날린 작용제 휴식의 원인이 주어진 장 조직에서 유용하지 않을 것입니다. 이 경우, 아세틸 콜린 (콜린성 수용체)와 같은 수용체 작용제이 사용될 수있다. 페닐에 아세틸 콜린 양에 대한 대안은 상기 제 1 도전 높은 칼륨 (K) 등의 비 - 수용체 작용제를 사용하는 것이다. 평활근에서 높은 K 간접적으로 열린 칼슘 채널을 운영하고 있으며, 따라서 평활근의 무결성의 일반적인 지표로 볼 수 있습니다. <ol><li> 조직 조 10 -5 M 페닐에 추가하여 첫 번째 과제 또는 웨이크 업 과제를 수행합니다. 50 ml의 조직 조에서이 농도를 달성 10-2 M 페닐에 솔루션의 50 μl를 추가합니다. 주 : PSS 50 ㎖에 50 μl의 최종 농도는 스톡보다 1000 배 더 적은 정도로, 1 / 1000 희석, 또는 10-5 M. 조직 목욕 C 내에서 볼륨과 볼륨의 일관성 유지 보수 기술hamber 최종 약물 농도를 결정하는 단계에 중요하다. </li></ol></li><li> 데이터의 기울기가 제로가되면 조직 조에 10-5 M 페닐에 추가하고 다음 피크 고원 수축을 허용한다. 사후 실험 분석을 돕기 위해 각 실험 이벤트를 기록해야합니다. </li><li> 고원 후 비우고 새로운 PSS와 조직 목욕 챔버를 보충에 의해 철저하게 작용 물질을 세척 할 것. 뿐만 아니라 이러한 이벤트를 기록해야합니다. 참고 : 엄지 손가락의 규칙은 목욕 작용제의 농도가 각각 세척으로 10 배 감소한다는 것입니다. 이상 3-4 세척이 필요할 수 있지만 아래로 다시 평형 기준 톤 (긴장)에 조직을 가지고있다. </li><li> 진행하기 전에 ~ 10 분 동안 기준 톤에서 조직의 나머지 부분을 보자. </li></ol> 7. 실험 주 : 프라 조신, 알파 아드레날린 수용체 길항제는 농도 RESP를 시프트 조직 조 챔버에 도입 될온세 곡선 페닐에 (PE)에; 이것은 명백한 적대입니다. <ol><li> 한 목욕 차량을 추가 (H 2 O)하는 프라 조신이 용해시켰다. 다른, 프라 조신의 적절한 농도를 추가합니다. 이 경우, 5 × 10-9 M 또는 욕실에서 5 nM의 농도를 달성하기 위해 다른 하나의 욕 차량의 25 μL 프라 조신과의 10 -5 M 농도의 25 μL를 추가한다. 주의 : 차량의 첨가 본 실시 예에서는 불필요 해 보이지만 혈관 작용 될 전위 (예를 들면, DMSO, 에탄올, 아세트산)가 다른 차량을 사용할 때, 그렇게하는 것이 필수적이다. 이 혈관에 작용하는 수에 대한 증거가있는 경우에도 해당 차량을 추가합니다. </li><li> 화장실에서 차량 / 프라 조신을두고 1 시간 동안 조직을 씻어하지 않습니다. <ol><li> 조직을 균등화하는 동안, 작용제 (PE)의 여러 농도를 준비합니다. 예를 들어, &lt;더 반응을 유도하지 농도 (농도에서 광범위한 포함/ 최대 응답 (능가 농도 EM&gt; 10 -9 M PE) 예를 들어, 10 -4 M PE). 농도 - 반응 곡선은 10 -1 M 주식 솔루션에서 PE의 여섯 별도의 원액 (10-6 -10 -1 M) 연속 희석을 통해을, 자연 로그 때문에. 각각의 농도에 필요한 볼륨이 모든 화장실 (예&gt; 300 μL)에 필요한 트리플 전체 부피보다 약간 더 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 표 1에 기재된 바와 같이 작용제를 추가로 계속. 참고 :이 실험은 PE하는 누적 농도 반응 곡선을 생성합니다; 각각의 반복은 계정에 이미 목욕에 추가 물질의 양을합니다. 더 이상 수축을하지 않을 때까지 추가 증가가 발생하거나, 전체 곡선은 plateaued있다. <ol><li> 티슈 (threshold)에 도달 될 때까지 개별적으로 약물 농도를 추가한다. </li><li> 아무런 변화가 발생하지 않으면, 다음의 농도를 추가시리즈; 표 2를 참조하십시오. 참고 : 이러한 추가의 타이밍이 사용 작용제에 따라 달라집니다. 예를 들어, 노르 에피네프린과 페닐에 수축이 빠르게 개발하고 분 이내에 고원해야합니다. 이와는 대조적으로, 엔도 텔린 1 수축은 천천히 개발하고 가까운 45 분 동안 고원하지 않을 수 있습니다. 다른 실험만큼, 이와 같은 곡선의 형성 후에 조직에서 수행 될 수있다 (1) 밖으로 세척 물질; 및 (2)는 정상적인 조직 수축성 동작으로 복귀하고 이전 자극의 영향을받지 않는 것으로 입증 될 수있다. </li></ol></li></ol> 8. 데이터 분석 <ol><li> 이전과 개입 직후에 데이터를 저장해야합니다 (예를 들어, 웨이크 업 또는 전체 곡선). </li><li> 찾기 및 데이터 분석에 도움이 각 조직 조 챔버 / 입력 채널에 대한 조직의 기준을 설정합니다. </li><li> 기준이 설정되면, 각각의 농도에 대한 최대 응답을 발견하고, 찬 기록기준선에서 GE. 순차적으로 농도의 각을 통해 이동하고 기준선 이동을 기록합니다. </li><li> 결과 데이터를 그래프입니다. 어떤 그래프 프로그램에서이 작업을 수행합니다. 참고 : 그래프 패드 프리즘이 약리학을 위해 설계, 이것은 여기에 제시된 실험의 종류에 이상적입니다. </li></ol>

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M., O'Connor, C., McLoughlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+changes+in+pH+on+wall+tension+in+isolated+rat+pulmonary+artery:+role+of+the+RhoA/Rho-kinase+pathway.">Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).</li><li>Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors+are+uncoupled+from+contraction+in+rat+vena+cava.">Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava.</a> Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

연구 도구로 아이소 메트릭 힘의 측정은 150 세 이상이지만, 수축 조직 2 수용체의 특성에 대한 프로토 타입 기술되고 있습니다. 이 기술의 힘은 단순함과 다양성에있다 : 길항제의 존재 또는 부재 하에서 작용 물질의 농도를 증가시킴으로써 유도 반응을 기록함으로써, 정보의 무수한 각 약물의 약리학 적 특성 및 수용체에 대해 유도 될 수있는 그것은 3-5을 결합한다. 이러한 유형의 실험이 또한 사용될 길항제 비경쟁 자연 대 경쟁에 대한 정보뿐만 아니라, 수용체 얼룩이 비특이적 약효 6-8 가너. 따라서,이 절연 조직 조 간단한 실험으로 치환 작용제 - 유도 된 근육 수축을 매개하는 수용체의 약리학 비교적 완전한 프로파일을 생성 할 수있다. 효능 작용의 측면에서, 제해당 조직에서 작용제의 전자 상대 효능 (E MAX)과 힘 (EC 50) 같은 조직 한 다른 작용제의 응답에 비해 계산 될 수있다. 우리의 실험에서는, 래트 흉부 대동맥 비히클 또는 종래 수축을 조직 조에 α 1 아드레날린 작용제 페닐에 첨가하고 생성 한 시간 동안 α 1 아드레날린 수용체 길항제 프라 조신 (5 ㎚) 중 하나와 함께 배양 하였다. 수정 된 결과를 두 선물 도표 녹색 응답이 최대로 표시 PE에 의해 달성의 최대 수축으로 표시 한 그림 1의., ½ 최대 수축하게 표시하고 응답하는 것이 원인이 된 PE 농도와 관련. 이러한 값을 식별하는 것은 반 최대 (50 %) 반응 또는 EC (50) 값을 달성 작용제의 유효 농도를 식별한다. 불행하게도, 작용제에 의존하는 매개 변수를 사용하여수용체 결합 특성이 9 복잡 할 수 있습니다 결정하기 위해 혼자에요. 상수 길항제 해리 PK (B)의 -log 10 몰 길항제 -log 10 : 이상적으로, 수용체 길항제를 사용하여 추가 실험은 약물과 수용체 사이의 상호 작용을 정의하는 중요한 두 가지 중요한 파라미터들의 계산을 허용 필요한 농도의 농도 - 반응 곡선에서 두 배의 우측 시프트 (PA (2)) (10)을 유도한다. K 및 PA B 2 이득들이 작용제 독립적 값이며, 심지어 다른 조직 (11) 사이에 일정하게 유지된다는 사실로부터 유용성 양쪽 모두. 다른 계산 된 값 (50)을도 2의 데이터로부터 약동학 B는 다음 방정식을 이용하여 계산 될 수 있고, EC에 기초 : = 2 × 10-8 M 프라 조신의 부재하에 50 EC 사전에 EC (50)프라 조신의가 나타나지 않는 = 7 × 10 -6 M 다음의 수학 식 B에 K를 풀 : 로그인 (DR-1) = [B] 로그 - K B 로그 장소 : [B]는 길항제 농도 = 5 X 10-9 M. 로그인 (5 × 10-9 M) = -8.3 박사 = 없을 길항제 / EC (50)의 존재 EC 50 값의 용량 비율. 우측 시프트가있는 경우,이 값은 1보다 클 것이다. 따라서 : 박사 = 7 × 10 -6 M / 2 × 10 -8 M 700 × 10 -8 M / 2 × 10 -8 M = 2분의 700 = 350 [B]와 박사를 대체 : K B를 기록 - = -8 (350-1)를 기록 2.54 = -8 - KB 로그 의 pKa B = 10.54 프라 조신은 α 1 아드레날린 RECEPT와 상호 작용할 때 프라 조신이 값은 얻은 값과 일치페닐에 프린에 수축을 매개 아드레날린 수용체 α 1 아드레날린 수용체임을 제안 또는 12,13. 몇 가지 단계는이 실험의 성공에 매우 중요합니다. 조직은 조직의 생존력 상실을 방지하기 위해 박리 후 남아 있어야 PSS. 모든 아이소 메트릭 근육 준비 수동 장력 (14, 15)에 대해 최대한의 힘을 생성하는 최적의 길이 긴장 관계를 가지고있다. 이 프로토콜에서 설명하는 실험에서, 최적의 수동 장력 티슈는 이전에 수동 장력 0.5 g의 잠깐 씩 첨가하여 결정 하였다. 조직 톤없이 시작해야하고 평형의 30 분 후, 조직 활성 톤 생성의 KCl (80 mM)을 최대의 농도로 도전되었다. 이어서, 조직을 세척하고, 기준 계조로 복귀시켰다. 기준선에서 15 분 후, 수동 장력의 또 다른 0.5 g을 넣고,이 프로세스의 고원까지 반복활성 장력을 추가 수동 긴장을 달성했다. 예비 실험에서, 수동 장력 4g 총량 대동맥에서 최대 활성 장력 발생을 달성하도록 결정하고, 따라서 장력의 총량이 이전에 평형화 고리 상에 배치된다. 절차 적으로, 이는 종래 수동 장력 애플리케이션을 제로로 최선이지만, 실험 전에 언제든 수행 될 수있다. 실험 또는 해부 어느 시점에서, 조직을 스트레칭 오버, 부정적인 조직의 생존과 실험 결과에 영향을 미칠 것입니다. 이 단계는 과량 신축성 높은 가능성을 갖는 한, 조직 욕에 배치 할 때 가장 필수적이다. 수와 기간에 적절한 세정, 재현 효과를 위해 필요합니다. 두 번째 문제는 너무 빨리 조직이 기준 긴장 돌아왔다 초기 접종 후, 또는 그 이전에, 비정상적인 반응 발생합니다. 가역 길항제 / 저해제를 공부하는 경우, 조직은 inhibi로, 추가 작용제하기 전에 세척하지 마십시오토르 농도는 감소 될 것이다. 분리 된 조직 목욕 분석에 주목할만한 장점과 단점이 있습니다. 단점 : 조직은 후크 고리의 제거 수술 또는 배치하는 동안 손상의 다른 정도가 발생할 수 있습니다. 내피 세포의 환상 대동맥의 내벽이 때문에 전지 층을 손상시키지 않도록주의가 후크 고리의 위치에주의해야한다. 조직들은 또한 조직 조에서 생존하는 시간의 뚜렷하게 상이한 길이를 가질 수 있고,이 결정되어야한다; 모든 조직은 동일하다. 이와 더불어, 조직은 시간이 컨트롤은 모든 실험 필요한 제어가되도록 하루 종일 자신의 응답에서 변경 될 수 있습니다. 이것의 좋은 예는 전형적인 8 시간의 실험 기간 동안 100 %에 의해 수축력 최대로 향상 기니피그 기관이다. 물에 난 용성이다 마약 PSS에 침전 수 있습니다. 마지막으로, 누적차 효능에 대한 수용체의 탈감작이 발생하는 경우 작용제는 다른 결과를 초래할 수있는 약물의 비 누적 추가; 안지오텐신 II는 빠른 과내를 보여줍니다 하나의 약물이다. 장점 : 조직 조 실험의 주요 이점 중 하나는 실시간이라는 것이다; 그것은 전개하고 신속하게 결론을 확인하고 실험 기간 동안 다음 단계뿐만 아니라 문제 해결을 계획 할 수 있습니다으로 한 실험을 볼 수 있습니다. 실험은 할 수있는 일이 걸립니다. 여러 조직은 통상적 동물 자체 조절 역할을 할 수 있도록 하나의 동물에서 제조 될 수 있으며, 그 강도를 실험에 추가한다. 약물 조직의 비교적 순수한 응답을 테스트하도록 하나는 다른 요소로부터 조직을 분리 할 수있다. 그러한 조직 조 시스템과 같은 시험 관내 실험은 생체 내 실험과 비교하여 약물의 적은 양의 사용을 허용한다. 본원에 기재된 염기성 실험 설계가 될 수광범위하게 추가 매개 변수의 기록 또는 다른 외부 자극의 도입을 허용하도록 수정했습니다. 예를 들어, 전극의 첨가는 근에 분포하는 신경 16,17의 전기장 자극 허용한다. 열이나 산도 프로브의 추가로, 수축 온도에 응답하여 pH의 영향도 18,19를 측정 할 수있다. 이와 유사하게, 산소는 부분적으로 또는 저산소증 유도 효과를 평가하기 위해 N이 전체에서 대체 할 수 있습니다. 또한,이 비디오에 사용 된 아이소 수축력 측정의 기본 원칙은 동일한 세포 내 칼슘 20 등척성 장력 개발 및 변경을 허용 수반 측정 시스템을 개발하는데 사용될 수있다. 그 시스템은 빠르게 반응 동안 조직 샘플을 고정 할 수있는 신호 변환 이후도 용이하게 검토되고, 신호 전달 경로 시스템의 생화학 적 활성을 검증 할 수 있도록. EQU의 변화이 작업을 수행하는 데 사용할 수 있습니다 ipment은 거대하다. 이 모든 시스템 구성 또는 자동 양손은 여러 다른 회사에서 구입하실 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 조직 화장실 조직 홀더는 사내 미시간 주립 대학 기계 상점에 의해 손으로 날려 (조직 화장실)과 손 건설 (홀더)이었다.

약리학 분야는 150 년 이상 격리 된 조직 목욕 시스템을 사용하고있다. 이 시스템의 범용성은 고혈압, 심장 부전, 당뇨병, 위장 질환, 방광 질환 또는 장애를 가진 수백만 명의 개인을 치료 한 요법의 기초를 형성하는 이러한 지식으로, 수용체 및 수용체 신호 전달을 특성화하기 위해 전세계 과학자 허용했다 장애, 천식, 연하 장애, 몇 가지 이름. 이 조직은 조직의 기능을 할 수 있습니다로이 날을 위해, 고립 된 조직 목욕, 신약 개발 및 기초 연구의 중요한면을 남아있다. 이 주피터 과정에서는 공식적인 프로토콜은 수용체의 특성을 허용 아이소 메트릭 수축을 측정하는 격리 된 조직 목욕 실험의 데이터를 이용하여 시각 및 가상 실험을 설명하기 위해 공유됩니다. 이 기술의 주요 장점은 조직 생활된다는 것이다몸에 관련된 생리 학적 결과 (수축 또는 이완)와 전체 조직으로 차 기능. 이 단계 (약물 - 수용체 상호 작용, 신호 전달, 두 번째 메신저 세대, 평활근의 흥분의 변화, 조직 기능의 변화)의 합성이다. 다른 기술은 이러한 각 단계의 연구 (예, 방사성 리간드 약물 친 화성, 두 번째 메신저의 측정에 대해 구속력을) 할 수 있지만, 분리 된 조직 조 기술은 이러한 모든 단계를 하나의 통합 할 수 있습니다. 또 다른 장점은 조직의 기능을 유지하는 셀룰러 설정 대 조직에 더 의미가있는 중요한 약물 학적 변수의 계산을 허용한다는 것입니다; 이 조사 된 약물이 전체 몸에서 어떻게 작동하는지에 가까운 온다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabChart Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td></td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerLab (4 channel)&#160;</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadBridge (4 channel)</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML112</td>
			<td>ML112</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Adapter Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC11</td>
			<td>MLAC11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Force-Displacement Transducer</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>FT03</td>
			<td>FT03</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Transducer Cable</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>TAC-7 REV-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BNC to BNC Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IsoTemp 2100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>IC-2100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Bath</td>
			<td>Multiple Sources&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Physiological Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Silk Suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7615</td>
			<td>SP104</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ring Stand</td>
			<td>Humboldt MFG Co</td>
			<td>H-2122 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Dishes</td>
			<td>Handmade with Silicone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon Tubing</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>63010-100</td>
			<td>R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hose Clamps</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co</td>
			<td>06832-08</td>
			<td>SNP-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Muscle Bath</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250ml Warming Chambers</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas Dispersion Tube</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7202-06</td>
			<td>7202-02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Custom Stands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Three-Prong Clamps</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-Connector</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Hooks</td>
			<td>Hand Made in House</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica Stereomicroscope MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>10447254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12562-36</td>
			<td>12562-36</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Petri Dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td>7740 Glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 170 Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-150</td>
			<td>160-150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Splinter &#38; Fixation Forceps</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-55</td>
			<td>160-55</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

효능 작용의 관점에서, 소정의 조직의 상대적인 작용제 효능 (E MAX) 및 효능 (EC 50)는 계산과 같은 조직 한 다른 작용제의 반응과 비교 될 수있다. 우리의 실험에서는, 래트 흉부 대동맥 비히클 또는 종래 (도 1)을 조직 조에 α 1 아드레날린 작용제 페닐에 추가 및 수축을 발생시키는 1 시간 동안 α 1 아드레날린 수용체 길항제 프라 조신 (5 ㎚) 중 하나와 함께 배양 하였다. 그림 2 선물는도 1의 결과를 수정했습니다. 녹색 응답은 PE에 의해 달성의 최대 수축 반응하는 것이 원인이 최대, ½ 최대 수축 등으로 표시 한 후 PE 농도와 연관로 표시 표시했다. 이러한 값을 식별하는 것은 반 최대 (50 %) 반응을 달성하거나 EC 작용제의 유효 농도를 식별하는 것이다 <sUB&gt; (50) 값입니다. 이 S 자형 곡선 물류 기능 EC 50 값의 커브 피팅 및 계산에 사용할 수있는 사용이 example.Computer 소프트웨어에서 donegraphically했다. 생성하고 이러한 결과를 해석에서, 농도 - 반응 곡선을 작성하는 작용제 낮고 높은 농도를 사용하는 것이 중요하다. 충분히 안정된 점 기준과 최대 고원을 표시하지 않고, EC (50) 및 E MAX는 추정 될 수있다. 이이 예에서는 그래픽으로 이루어졌다. S 자형 곡선 로지스틱 함수를 사용하는 컴퓨터 소프트웨어는 EC (50)의 커브 피팅 값과 계산에 사용될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> 그림 1 :. 조직 목욕 회로도 만화 이중 벽에 배치 조직의 고리를 나타내는, 물 재킷 조직 바일. 버퍼 유출입은 챔버의베이스에 통합 된 3 방향 스톱 콕 유리에 의해 조절된다. O 2 / CO 2 PSS 또는 가스의 누설을 방지하는 개스킷에 의해 밀봉된다 폭기 통해 버블 링시켰다. 재순환 입력 적절한 재순환을 유지하고 온도를 야기 disregulation 공기 주머니의 형성을 방지하기 위해 출력 이하이다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> 그림 2 :. 쥐 흉부 대동맥 + 내피 세포는 위의 그림은 네 개의 개별 실험 (다른 동물과 다른 색상으로 표시되는 다른 세트 업에 다른 연구자들에 의해 수행) PE에 의한 수축을 이동하는 프라 조신의 능력을 테스트를 보여줍니다. 프라 조신 (5 nM의)은 명확 병렬 방식으로 PE - 유도 수축 곡선을 우측으로 이동했다. 그림 3 : 쥐 흉부 대동맥 + 내피 세포 그래픽 부재 (차량)에 PE에 대한 EC 50 값의 추정 및 길항제의 존재 (프라 조신).. 그린 라인 (그룹 C는) 만 표시됩니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 소금 </td><td> MW (g / 몰) </td><td> 5 리터 </td><td> FINAL mM의 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> (g) </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 58.45 </td><td> 37.99 </td><td> (130) </td></tr><tr><td> 의 KCl </td><td> 74.56 </td><td> 1.75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136.1 </td><td> 0.8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td> 황산• 7H20 </td><td> 246.5 </td><td> 1.45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td> NaHCO3를 </td><td> 8421 </td><td> 6.25 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> 우선 당 </td><td> 180.16 </td><td> (5) </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> (380) </td><td> 0.05 </td><td> 0.03 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 정상 생리 소금 솔루션 (PSS) 조리법이 실험에 사용 된 중탄산염 버퍼 PSS의 내용.. 모든 염의 분자량 원하는 농도를 달성하기 dH보다 2 O 5 L에 첨가 량이 포함된다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 목욕 농도 </td><td> 작용제를 첨가 조로 이루어 </td></tr><tr><td> 1 × 10-9 M </td><td> 50 ml의 1 × 10 -6 M </td></tr><tr><td> 3 × 10-9 M </td><td> 100 ㎖의 1 × 10-6 M </td></tr><tr><td> 1 × 10-8 M </td><td> 35 ml의 1 × 10 -5 M </td></tr><tr><td> 3 × 10 -8 M </td><td> 100 ㎖의 1 × 10-5 </td></tr><tr><td> 1 × 10-7 M </td><td> 35 ml의 1 × 10 -4 M </td></tr><tr><td> 3 × 10 -7 M </td><td> 100 ㎖를 1 × 10 -4 M </td></tr><tr><td> 1 × 10 -6 M </td><td> 35 ml의 1 × 10 -3 M </td></tr><tr><td> 3 × 10 -6 M </td><td> 100 ㎖의 1 × 10-3 M </td></tr><tr><td> 1 × 10 -5 M </td><td> 35 ml의 1 × 10-2 M </td></tr><tr><td> 3 × 10-5 M </td><td> 100 ml의 1 × 10-2 M </td></tr><tr><td> 1 × 10 -4 M </td><td> 35 ml의 1 × -1 M </td></tr></tbody></table> 표 2 :. 목욕 티슈 첨가제 작용제 농도 작용제의 양은 프로 각 욕에 첨가 될perly 누적 농도 - 반응 곡선을 구축. 원하는 욕 농도는 작용제의 농도를 증가시키는 양의 순차 첨가를 통해 달성된다. 각 추가 계정에 목욕에 이미 존재하는 작용제의 농도를합니다. 이 작용제의 단일 농도 증가량을 사용하여 발생 될 조직 조에서의 부피 증가를 최소화하기 위해 행해진 다.

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Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

약리학 연구에 고립 된 조직 목욕-애플리케이션에서 부드러운 근육 기능의 측정

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

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Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

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비디오: Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

초점 칼슘 2 +</sup평활근에서> 과도 감지

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

연구

생물학

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

엑기스의 Intravital 이미징을위한 마우스 Cremaster 근육 준비

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

절연 골격근의 수축성, Fatigability 및 Alternans의 예 VIVO 평가

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

패치 클램프 전기 생리학 및 압력 Myography를 사용하여 간선 평활근 Kv7 칼륨 채널 기능을 탐색

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Zebrafish의 유충의 근육 기능을 평가하기 위해 수축하는 동안 힘 측정

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

마우스입니다 관류 신장 기법

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...