Name: isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine
Uploaded: 2014-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine at JoVE.com

저자는이 문서에 사용 실험 조직을 수집 할 수있는 기회를 제공하기 위해 라이언 채플린 켄터키 고기 연구소와 동물 식품 과학과의 대학의 박사 그레그 Rentfrow을 인정합니다.

살아있는 동물을 사용하지 않았기 때문에 본 연구에 사용 된 절차는 켄터키 동물 관리 및 사용위원회의 대학의 승인을 필요로하지 않았다. 여기에 사용 된 시료의 수집에 앞서, 모든 동물은 고정 볼트 기절 exsanguinated되었다. 이 켄터키 대학의 연방 정부 검사 도축장 시설에서 실시했다. 미국 농무부 식품 안전 검사국의 공식 대표는 시체의 살아있는 동물과 처리 처리 모든 활동을 관찰했다. 계측의 1 준비 <ol><li> 실험의 시작 조직 샘플의 모음 사이의 시간, 장비 설정을 최소화하고 (추가 인원이 가능한 경우 나, 이러한 작업이 동시에 발생할 수있다) 실험 조직을 수집하기 전에 버퍼를 제조 하였다. NOTE : 이것은 조직 실험을 실시 가능한 남아있는 시간의 가장 큰 양을 제공하지만, 일부뿐만따라서 그것은 일반적으로 가능한 한 일찍 시작하는 것이 바람직하다, 실험은 오랜 기간 동안 실행할 수 있습니다 (또는 하루에 여러 실험을 완료하는 욕망이있다). </li><li> 전원을 연결 컴퓨터, 데이터 수집 장비, (버퍼 (들)) 수조와 myograph 장치 (들). myograph 장치 (들)에 교정 장치를 놓고 온도를 미리 설정 따뜻하게 단위 및 교정 장비 (37.5 ° C로 사전 설정) myograph 열을 켜고 수 있습니다. <ol><li> 컴퓨터에서 이전에 만든 차트 소프트웨어 설정 파일을 열고 실행을 시작합니다 (그러나 데이터를 수집하지 않음). </li></ol></li><li> 10 분 동안 장비를 따뜻하게. <ol><li> 데이터를 수집 시작합니다. </li><li> 모든 채널을 제로. </li><li> 확인하고, 인증 된 중량에 의해 공급이 g-포스로 그 채널과 연관된 각 힘 센서로부터 공급 된 전기 신호를 표준화하기 위해, 각 채널 (multimyograph 당 4 채널)에 (필요한 경우) 캘리브레이션을 수행. </li><li> 교정 및 단위 변환을 완료 한 후에, g 등의 모든 후속 데이터를 저장한다. 각 개별 기관의 욕망에 따라 적절하게 변경; 장비 및 소프트웨어는 milliNewtons 볼트와 같은 다른 장치의 사용을 허용한다. </li></ol></li><li> 가스 라인이 막혀 않은 지 확인하고 (들) 단위를 myograph하는 가스 공급 (95 %, O2 / 5 % CO 2)를 켭니다. 지속적으로 전체 절차를 수행하는 동안 (myograph 챔버에서) 모든 버퍼를 기체. </li><li> 70 % 에탄올 모든 myograph 챔버를 작성하고 10 분 동안 담근 에탄올을 제거하고 두번째 10 분 담가에 대해 반복합니다. <ol><li> 에탄올을 제거한 후, 챔버에서 버퍼의 세번째 추가를 떠나 준비된 버퍼 (버퍼 준비를위한 제 2 절 참조) 세 린스 다음에 탈 이온수로 3 회 씻어. 참고 : 버퍼와 조직이 준비 될 때까지이 시점에서 장비는이 상태에서 유휴 상태를 유지할 수 있으며, 직원은 experimen 진행 준비가되어 있습니다t. </li></ol></li></ol> 버퍼의 2 준비 <ol><li> 11.1 mM의 D-글루코오스의 최종 농도를 달성하기위한 교통 및 조직 샘플의 처리에 사용하기위한 1 L-Henseleit 크렙스 완충액을 준비한다; 1.2 mm의 4 황산; 1.2 mM의 KH 2 PO 4; 4.7 밀리미터의 KCl; 118.1 mM의 NaCl을; 3.4 mM의 염화칼슘이; 24.9 mM의 탄산 수소 나트륨. <ol><li> 저어 접시에 탈 물을 약 900 ㎖ 중에 크렙스 염 9.6 g을 섞는다. </li><li> 원하는 버퍼의 L 당 2.1 g의 중탄산 나트륨 다음에 0.373 g 염화칼슘 탈수 섞는다. </li><li> 95 %, O2 / 5 % CO 2와 함께 20 분 동안 가스 완충액. </li><li> L. 1로 볼륨을 조절, 가스 처리 후 7.05로 산도를 조정 (최종 목표 pH가 7.4이되어야합니다 버퍼의 여과 산도를 증가) </li><li> 필터를 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 깨끗한 멸균 한 L 매체 병 및 저장 버퍼로 버퍼를 소독. </li></ol></li><li> 별도의 크렙스-H를 준비크렙스 - Henseleit이 수축 실험과 관련된 추가 화합물과 버퍼 수송을위한 2.1 단계에 설명 된대로 myograph 실험에 사용 enseleit 완충 용액. 참고 : 일반적으로이 L이 문서에서 설명하는 실험에 충분하지만,이 볼륨이 증가하거나 실험의 길이에 따라 감소 될 필요가있다, myograph 챔버, 및 (치료 추가에 대해) 수의 버퍼 교체의 수입니다. <ol><li> 가스 처리 단계 (단계 2.1.3) 이전에, 9.1 mg의 추가 버퍼 데시 프라 민 염산의 (버퍼의 L 당 준비되고있다). </li><li> 프로프라놀롤 염산의 1.0 μM 솔루션을 준비하고 크렙스 - Henseleit 완충 용액이 용액 (준비되고 버퍼의 L 당) 1 ㎖에 추가합니다. 사용의 일에이 버퍼를 확인하고 myograph 작동 온도 (myograph에서 37.5 ° C 온도를 산출 온도)에 보관하십시오. 참고 : 데시 프라 민은 생체 아민 재 흡수 메커니즘을 억제하기 위해 추가더 빠르게 발생하도록 혈관 입욕 버퍼로부터 추가 실험 정화를 허용. 프로프라놀롤의 추가는 수용체 아드레날린을 β하는 치료 화합물의 결합을 비특이적을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 3 수집 및 혈관의 제조 <ol><li> 가능한 한 빨리, 시체에서 위장관를 제거합니다. 동물이 더 이상 무의식적 인 반사를 전시하면, 머리를 제거하지 숨길 다음 수직으로 시체를 올립니다. 시체에서 위장 육부 (항문 식도)의 제거가 승인 도축장 직원 (&lt;20 분의 시간에서 멋진의)에 의해 완성되어야한다. 참고 : 일반적으로 장관이 표준 운영 절차 또는 시설의 직원이 다음에 연방 정부가 위임 절차와에서 수집되는 위치 / 시설로 제한됩니다 얼마나 빨리. <ol><li> 대부분의 시설에서, 위장관의 조작을 실시식량 공급을 입력 운명 사체의 처리에서 별도의 위치에서. 위장관은 촬영과 조사를 위해 밖으로 확산 될 수있는 근처의 편리한 위치를 사용합니다. </li></ol></li><li> 위장관이 확산되면, 소장, 맹장에 소장을 연결하는 회맹 배 및 회맹 배 (그림 1A)에 인접 연장 회장 플랜지를 식별합니다. <ol><li> 메스 나 칼을 사용하여 매우 가볍게 회장 플랜지의 중심 장간막 막에 절개. 두 집게 손가락을 사용하여, 퉁명스럽게 장간막 혈관 (그림 1B)를 노출 지방과 결합 조직을 멀리 해부. </li></ol></li><li> 장 장간막에서이 플랜지 또는 팽창에서 여러 가지를 해부 (~ 길이 2cm) 회장 (그림 1C)의이 부분을 지원하는 노출 장간막 동맥과 정맥 번들. <ol><li> U 경우조직을 파악 직접 파악 또는 손상에 부정적인 조직의 성능 (14)에 영향을 줄 수 스트레칭의 일종으로 그들을 제거하는 동안의 모든 혈관을 잡아 당기지하는데주의를 기울여야하는 집게를 노래. 혈관 제거는 가장 제거 될 섹션의 각 단부에 걸쳐 절단 한 다음 이제 격리 구역에 함께 또는 병렬로 절단함으로써, 수행된다. 편의를 위해 선박 집게 한 쌍의 파악하기 위해 일부 조직을 제공하기에 따라 주변 조직의 일부를 제거합니다. </li><li> 포셉 쌍, 차가운 얼음-Henseleit 크렙스 완충액을 함유하는 튜브에 조직 샘플을 담그고 처리 실험실에서 발생할 수있을 때까지 얼음 상에 저장한다. </li></ol></li><li> 절삭면이나 배양 접시에서 조직 샘플을 놓고 부분적으로 차가운 얼음 크렙스 - Henseleit에 잠수함. <ol><li> 범위 # 5 보석상 집게, 노이스 홍채 가위를 사용하여 램프를 확대 또는 해부,주의 깊게 주변의 지방과 니플을 멀리 해부 (5.0 배의 배율 2.5은 충분하다)조직을했습니다 및 동맥과 정맥을 분리합니다. 섹션의 일단에 개구 용기를 식별하고 신중 집게로 용기를 둘러싸는 밴드를 파악. </li><li> 가위로 잘라 올려 근막 아래에 가위의 끝을 밀어 용기에 평행합니다. 초기 절개 한 후, 지방 및 결합 조직은 가위로 상기 양측을 절단하여 용기로부터 분리 될 수있다. 선박 벤치에 소요되는 시간을 최소화하면서 혈관이 가능한 깨끗한 지 확인합니다. </li><li> (샘플 수집 후 최대 24 시간 동안 저장하고 여전히 유효 수축력 데이터를 생성 상태를 유지 할 수 있습니다) 4 ° C에서 신선한 크렙스 - Henseleit 버퍼와 저장소의 튜브에 혈관을 돌려줍니다. </li><li> 면도날을 사용하여, 슬라이스 용기가 2 mm 부의 원하는 수로 myograph에 사용되는 (그것은 일관된 단면을 얻기 위해 조직 슬라이서를 사용하는 것이 도움이된다). </li><li> 해부 SCO 아래의 각 부분을 검사PE (12.5X 배율)은 각 섹션 실수 해부 청소하는 동안 수행 더 이상, 지점, 밸브, 또는 표면 손상이 없음을 확인합니다. 이상 징후, 분기, 밸브, 또는 표면 손상이있는 경우 혈관 부분을 교체합니다. </li></ol></li><li> myograph 챔버 (일반적으로 &lt;30 분)에 장착하기위한 준비가 될 때까지 C 얼음 또는 4 °에서 (크렙스 - Henseleit 버퍼에 빠져들) 점포 허용 썰어 용기 섹션. </li><li> 부드럽게 루멘을 통해 지원을 삽입하여 myograph에 선박을 탑재하고 2-3그램 읽기 위의 혈관을 스트레칭하지 않도록주의하면서 (myograph에 micropositioner 사용) 장력을 증가시킨다. </li><li> 모든 챔버가 적용되면, 모든 방에서 버퍼를 진공 청소기로 청소 및 버퍼의 5.0 ㎖로 채우고 평형 기간과 실험을 시작하기 15 분 타이머를 시작합니다. </li></ol> (4) 실험 <ol><li> 안정한 고해상도를 달성하기 위해 1.5 시간 동안 모든 용기 섹션을 평형화1.0 g의 팅 장력. <ol><li> 크렙스 - Henseleit 배양 버퍼마다 15 분 교체합니다. </li><li> 평형 동안 지속적으로 2g에 혈관 부분에 긴장을 조절하고 약 0.80 g까지 휴식을 취할 수 있습니다. 선박 (그들은 마운트를 미끄러 져 있음)을 너무 많이 긴장을 허용하지 않도록하십시오. 선박이 조정을 필요로하지 않고 1g 장력을 보유하고 안정된 기준 긴장을 달성하기 위해보십시오. </li></ol></li><li> 평형화 동안의 KCl 수용액 1.32 M 용액이 참조로서 사용되도록 준비한다. </li><li> 만족스러운 평형의 완료 후, 용기를 목욕 5.5 ml의 용액에 0.12 M 용액에 결과에 1.32 M의 KCl 용액 500 μl를 추가합니다. <ol><li> 이 외에도에서 최대 반응은 조직 생존력을 평가하기 위해 사용되며, 행 (처리 된 데이터를 정규화하는 등의 농도 응답을 사용할 수있는 수동 장력을 조정할 수 없어, 1.32 M KCl을 첨가 이어gonist). </li><li> 장력이 1.0 g의 기준 값으로 돌아올 때까지 15 분 간격으로 버퍼를 교체합니다. </li></ol></li><li> 기준선에 도달하면, 버퍼를 변경 함과 동시에 1 분 타이머를 시작한다. 시작 시간의 경이적인을 방지하기 위해 동시에 모든 챔버에 대해이 작업을 수행합니다. <ol><li> 추가 할 수있는 기준을 흔든다은 1 분 카운트 다운 동안 챔버 (1)에 대한 설명을 준비합니다. </li><li> (이 총 부피의 0.5 % 미만을 유지 치료) 실험 지시로서 각 챔버에 25 ㎕의 분취 액에 기준을 추가한다. </li><li> 최종 표준이 추가되면, 9 분 타이머를 시작한다. </li><li> 구 분 표준 인큐베이션의 끝에, 처리 챔버에서 함유 완충액을 제거하고 신선한 완충액 5.0 mL를 넣고 2.5 분 타이머를 시작. </li><li> 단계를 반복 4.4.4. </li><li> 제 2.5 분 세정의 끝에서, 진공 챔버와 신선한 완충액을 추가 SECON의 개시 카운트 다운하는 1 분 타이머를 시작D 표준 추가. </li></ol></li><li> 일의 표준 추가 모든이 사이클을 계속합니다. </li><li> 최종 표준뿐만 아니라 이후 9 분 배양 동안 500 μL의 실행 기준 용량 추가의 끝의 1.32 M KCl을 참조 화합물을 제조. </li><li> 최종 처리 첨가 후 1 분 간격에 따라,의 KCl을 추가하고 9 분 타이머를 시작합니다. 주 : KCl을 첨가 실험의 결론에 조직의 생존 능력을 확인하기위한 것입니다 무시할 응답 결과 처리를 관리하는 경우에 유용합니다. </li><li> 최종 9 분 기준 화합물 보육의 결론에, 진공 청소기를 사용하거나 모든 챔버에서 버퍼를 제거합니다. 신선한 버퍼를 추가하지 마십시오. 실험을 마친다. </li><li> , 차트 파일을 저장 혈관 부분을 제거하고 적절하게 처리하고 정리 프로토콜에 따라 (제조업체가 제공 및 실험실 특정 될 수 있습니다) myograph의 장비. </li></ol>

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이러한 생물학적 검정의 개발 초기 도전 장간막 혈관 용 반복 수집 사이트 구축했다. 회장 결과적 장간막 통해 소장에서 진행 중에 소장 변화의 기능의 일부와 유사한 패턴으로 변화 샘플 사이트 일관성은 중요하다. 장간막 동맥과 정맥의 회장 지점은 가장 쉽게 식별 해부학 적 랜드 마크를 통해이었다. 맹장의 위치 및 장간막의 왼쪽에 그 말단에 회맹 배 다음으로이 두개골 장간막 동맥 (15)의...

티슈 침대 혈류량의 변화는 장기의 기능에 큰 영향을 미칠 수있다. 소장의 주요 기능은 영양소 흡수이다. 영양소 흡수 및 혈류 증가 표면 일 소화물 이동함에 따라 영양소 흡수에 도움을 위해 장내의 흡수성 표면 동맥 혈류가 필요하다. 혈류의 감소로 인해 transepithelial 그라데이션이 감소로 영양소 흡수의 감소를 일으킬 수있다. 영양소 이외에, 또한 소장의 장간막 국소 혈류에 효과를 발휘하는 2 차 대사, 약물, 독소에 노출 될 수있다. 반추 동물의 경우, 화합물은 사료에서 해방 될 수있다 (예를 들면, 아미노산, 또는 맥각 알칼로이드와 같은 독소와 같은 영양소) foregut의 발효 과정을 통해. 이 화합물은 반추위 발효 미생물의 신진 대사를 살아남을 경우, 지금은 흡수 가능또는 상호 작용 그들은 동물의 위장관을 통과있다. 생체 내 혈류를 측정하는 다른 방법을 사용할 수가있다 (예를 들어, 도플러 초음파, 혈액 유량계, 방사성 표지 된 미소 구, 및 표시 희석 기법 내주) 다양한 실험 시나리오 또는 치료의 평가를 허용한다. Mulvany 및 Halpern 3 전선을 사용하는 기술을 설명하는 문서 myograph 혈관 링 제제를 장착 발행까지 그러나, 혈관 평활근의 기계적 또는 약리학 적 특성에 관한 정보를 얻기 위해, 방법은 대형 선박을 제한된 남았다. 이 기술의 개발 이후 변형 관형 구조체의 평가 다른 다양한 애플리케이션을 허용 연관된 myograph 시스템으로 이루어질 것을 계속한다. 시스템은 또한 여기서 큰 혈관 관류 4를 장착하기위한 고정 봉을 이용하도록 한 내용기술이 요구되지 않습니다. 용기 및 동물 종류와 다른 동물 종의 데이터로부터 동일한 용기에 다른 해부학 적 기원과 구별에서 혈관의 dissimilarities 때문에 쉽게 다른 선박 또는 다른 동물 5 종류에서 동일한 용기에 걸쳐 추정 될 수 없다. 따라서, 별도의 생물 검정을 개발하고 이러한 측면이 변경 언제든지 확인해야합니다. 최근 여러 생물 검정은 복재 정맥과 오른쪽 반추위 동맥과 정맥 6,7는 가축에 사용하기 위해 이러한 기술과 수사관 개발되었다. 이러한 생물학적 검정은 맥각 알칼로이드는 소장지지 혈관에 미치는 효과를 구체적으로 조사하기 위하여 개발되었다. 그것은 공급 알칼로이드 50 ~ 60 %로 4 위 내용에 나타나는 것으로보고되었다, 그러나 5 %는 대변 팔에 복구됩니다. 스트릭 랜드 등. 9, 맥각 알칼로이드의 리뷰가 가능한 데이터 sugg를 언급EST는 소장 흡수가 ergopeptine 가장 중요한 사이트가 될 수 있음. 커트 등. 맥각 알칼로이드의 열을 검토 바이오 측면 그들이 상피 장벽을 통과하면, 맥각 알칼로이드가 쇄골 하 정맥 또는 장간막 정맥 및 포털 혈액으로 림프 시스템에 의해 하나를 운송 말했다. 로즈 등. 11은 높은 내생 감염 (높음 맥각 알칼로이드) 다이어트 소모 처리구에서 십이지장 혈류의 감소 및 결장을보고 하였다. 오른쪽 반추위 동맥과 정맥 생물 검정을 사용하여, 푸트 등. (12) 맥각 알칼로이드가 반추위 혈관에서 혈관 작용 것을 보여 주었다. 푸트 외. 13이어서 생체 내에서 증명이 감소 반추위 상피 혈류 맥각 알칼로이드 결과로 반추위 노출. 반추위의 흡수성 표면에 혈류 감소는 부수적 영양소 (휘발성 지방산) 플럭스의 감소를 일으켰다. 한때 감안할 때foregut에서 소장에게 전달 맥각 알칼로이드의 antity; 이 소장 혈관 및 영양 흡수에 비슷한 효과가 발생할 것이라고 가정했다. 이는 소 근위 회장 장간막 동맥 및 정맥 생물 검정의 개발을 필요로.

<table><tbody><tr><td>Multi Myograph</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>610M</td><td>A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Powerlab 8/sp</td><td>ADIntruments</td><td>ML785</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 7</td><td>ADInstruments</td><td>Version 7</td><td></td></tr><tr><td>Force Calibration Kit</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>100055</td><td>Specific to DMT myographs</td></tr><tr><td>Bottle-top Filter</td><td>Nalgene</td><td>595-4520</td><td>0.22 &amp;#956;m pore size; 45 mm neck size</td></tr><tr><td>#5 Jewler&amp;rsquo;s Forceps</td><td>Miltex</td><td>555008FT</td><td>Any brand of forceps can be used</td></tr><tr><td>Noyes Iris Scissors</td><td>Miltex</td><td>18-1510</td><td>Any brand of scissors can be used</td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Any brand of dissecting light microscope will suffice</td></tr><tr><td>Adjustable Tissue Matrice</td><td>Braintree Scientific</td><td>TM C12</td><td>This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly</td></tr><tr><td>Krebs-Hensleit Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3753-10x1L</td><td>It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Desipramine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900-5G</td><td></td></tr><tr><td>Propranolol-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0884-1G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Scott Gross</td><td>UN3156</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine

포유류의 위장 시스템은 지속적으로 해당 시스템으로부터 혈류에 영향을 미칠 수있는 화합물 (바람직한 및 바람직하지 않은)에 노출된다. 소장에 혈액 흐름의 변화는 기관의 흡수 기능에 대한 효과가 발생할 수 있습니다. 발효와 소화 과정을 통해 사료에서 해방 독소에 특히 관심이 생산 효율성을 개선 할 수있는 영역으로 반추 동물에서 개발했습니다. 이 문서와 관련된 비디오는 소 장간막 동맥의 고립 된 단면에서 vasoactivity과 multimyograph를 사용하여 정맥 화면 화합물을 개발 한 체외 생물 검정을 설명합니다. 혈관이 마운트 myograph으로 평형화되면, 생물 분석 자체가 사용될 수있다 : 수축성 응답 또는 관심있는 화합물을 평가하기 vasoactivity 스크리닝 도구로; 약리학 적으로 특정 수용체​​ 작용제에 의해 수용체를 표적 종류의 존재를 결정의; 하나 이상의 길항제의 존재와 수용체의 역할을 결정하고; 또는 길항제를 사용하여 원하는 화합물의 잠재적 인 상호 작용을 결정합니다. 이 모든 것을 통해, 데이터는 실시간으로 수집되고, 하나의 동물로부터 수집 된 조직은 다른 실험 치료의 다수 (체외 이점)에 노출하고, 정확을 제공하는 모세관 침대의 양쪽에 혈관 구조를 의미 할 수있다 소장을 지원하는 구 심성 및 원심성 혈액 공급에 일이 될 수 있는지의 그림.

포함 된 결과를 생성하는 데 사용되는 혈관 3주 간격 내 6 홀스타인 수송아지 (425 ± 8 ㎏)에서 수집 하였다. 의 KCl 농도 증가 처리를 추가로 전형적인 장간막 혈관 수축 반응의 예는 반응의 크기는 (공여체 동물의 크기와 상관) 용기의 크기와 약간 다를 것이다.도 2에 표시 할뿐만 아니라 수있다 부적절한 취급으로 (부정적) 영향을받을 수집 및 청소하는 동안 선박의 (스트레칭). 따라서, ...

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Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

소장은 자주 혈액 흐름에 부정적인 영향을주고 영양분 흡수에 영향을 미칠 수있는 독소에 노출된다. , 화합물 또는 관심의 독소를 multimyograph 및 장간막 동맥을 사용하고 정맥 분리하는 vasoactivity에 대한 검사를 할 수 있습니다.

생물 검정으로 소 장간막 동맥과 정맥의 섹션을 분리하고 사용하면 소장에서 Vasoactivity을 테스트

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

isolating-using-sections-bovine-mesenteric-artery-vein-as-bioassay-to

Research

JoVE Journal

Medicine

9.6K 조회수.  USDA-Agricultural Research Service.  소장은 자주 혈액 흐름에 부정적인 영향을주고 영양분 흡수에 영향을 미칠 수있는 독소에 노출된다. , 화합물 또는 관심의 독소를 multimyograph 및 장간막 동맥을 사용하고 정맥 분리하는 vasoactivity에 대한 검사를 할 수 있습니다. 

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Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

자동 와이어 Myography를 사용 Mesenteric 동맥 수축과 휴식 연구

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

연구

의학

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

<em&gt; 생체 내</em혈관 투과율을 테스트하려면&gt; 분석

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

압력 Myography를 사용하여 저항 장간막 동맥에서 근육 조직 대응 및 Vasoactivity 평가

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying tissue compartments, restricting the transport of smaller molecules across the epithelium and almost completely prohibiting epithelial macromolecular transport. This selectivity is determined by the mucous gel layer, which limits the transport of lipophilic molecules and both the apical receptors and tight junctional protein complexes of the epithelium. In vitro cell culture models of the epithelium are convenient, but as a model, they lack the complexity of interactions between the microbiota, mucous-gel, epithelium and immune system. On the other hand, in vivo assessment of intestinal absorption or permeability may be performed, but these assays measure overall gastrointestinal absorption, with no indication of site specificity. Ex vivo permeability assays using &#34;intestinal sacs&#34; are a rapid and sensitive method of measuring either overall intestinal integrity or comparative transport of a specific molecule, with the added advantage of intestinal site specificity. Here we describe the preparation of intestinal sacs for permeability studies and the calculation of the apparent permeability (Papp) of a molecule across the intestinal barrier. This technique may be used as a method of assessing drug absorption, or to examine regional epithelial barrier dysfunction in animal models of gastrointestinal disease.

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

예 생체 내 창자 주머 니나는 위장 질환 모델에서 점막 투과성을 평가하는

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

쥐 장간막의 Angiogenesis 분석

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

생물학

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

패치 클램프 전기 생리학 및 압력 Myography를 사용하여 간선 평활근 Kv7 칼륨 채널 기능을 탐색

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

압력 Myography를 사용 쥐과 저항 동맥의 기능을 평가

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion 기술은 쥐 장간막에서 미세 혈관 투과성의 규정을 조사하기 위해

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.