1. 유도 조건에서 아마의 성장. <ol><li> 5 &quot;냄비는 흙으로 가득하고 firmed 있습니다. </li><li> 냄비 당 세 씨를 ¼ 인치 깊이 심어져 있고 토양은 씨앗을 통해 firmed 있습니다. </li><li> 냄비는 다음 적절한 영양 솔루션 100ml로 물결 무늬가있는 아르 <ol><li> 비 유도 제어 (C) 조건 매주 1 / 10 일 강도 촉진제를 사용합니다. 높은 영양 상태 (NPK 치료) 전체 강도의 기적을했다하면 매주 적용 자랍니다. 낮은 영양 - 식물은 성장에 걸쳐 적용되는 수돗물을했다. (듀런트 1971, 컬리스 1980). </li></ol></li><li> 식물은 여름에 자연광 아래에서 재배하고 있습니다. 겨울 동안 그들은 16 / 8시간 진한 / 라이트 사이클과 나트륨 불빛 아래에서 재배하고 있습니다. </li><li> 주간 간격으로 출발하고 meristems는 회수됩니다. </li><li> 식물은 빠른 액체 질소에 냉동 수 있습니다. </li></ol> 검색 결과 세 genotypes의 조건 (그림 1)에 따라 서로 다른 상대 속도로 성장합니다. 따라서 제어 조건 하에서 경기수 라인 L은 S (그림 1A)보다 더 활발한되는 최고 자랍니다. 낮은 영양분 아래 (물), S는 L 또는 경기수 (그림 1B) 하나보다 커집니다. 높은 영양에서 (NPK) L은 S (그림 1C)보다 약간 더 나은 성장 경기수보다 커집니다. 세 가지 서로 다른 트리 트먼트에 따라 재배 라인의 각 사이의 비교는 그림 1 D에 표시됩니다 - F. PL은 통제 조건 (그림 1D)에 따라 가장 높은 성장 영양 (그림 1E)와 S L 이하 최고 마찬가지로 높은 영양 및 제어 조건을 모두 아래 (그림 1 층). 이러한 데이터는 세 줄의가 세 가지 환경에 따라 자신의 성장에 따라 차별화된 수 보여줍니다. 음표의 L은 NPK 조건 (그것이 유발되었던 이하)에서 최고의 성장하는 동안 아베가 제어 조건 하에서 최선을 성장한다는 것입니다. S는 향상된 영양 조건을 활용할 수있는 것이 아니라 매우 낮은 영양 조건 하에서 성장하는 것이 좋습니다 수있다 세 조건에서 동일한 대해 자랍니다. 식물의 분화와 관련된 성장 매개 변수는 식물 높이 (그리고 각 잎 사이의 거리는이 internode 길이,와 관련된), 잎 크기 및 분기의 정도를 포함합니다. 경기수에 대한 제어 조건 하에서 식물은 가지와 높이이고 잎이 크고 진한 녹색입니다. 낮은 영양소에서 식물은 매우 짧은, 각 잎 사이의 거리도 매우 짧은되고 단풍이 작고 밝은 녹색입니다. 끝에 나뭇잎이 줄기 내려보다 어두운 녹색입니다. 높은 영양소 아래 공장은 제어 조건의 주요 줄기 및 측면 촬영 모두 제어 식물보다 짧은 것을 제외하고는 매우 유사하게 나타납니다. 대형 genotroph에 대한 식물은 높은 영양분 아래에서 가장 활발한 성장을 제외하고는 아베의 것과 매우 유사. 다시 낮은 영양소 아래에있는 식물은 매우 짧은이며 밝은 녹색 잎이있다. 나뭇잎이 낮은 영양소에 따라 밝은 녹색 있지만 S genotroph는 세 가지 환경에서 마찬가지로 자랍니다. 그러나, 낮은 영양 상태에서 S genotroph은 아베 또는 L 라인 중 하나를보다 더 활발한입니다. 2. 플렉스 meristems과 나뭇잎의 RNA와 DNA extractions은 별도로 수행됩니다. 로체 총 RNA 준비 키트는 RNA extractions과 Qiagen DNeasy 식물 DNA 준비 키트는 DNA extractions 사용되었다 위해 사용되었다. RNA 추출 <ol><li> 3 meristems 플러스 일부 주변 단풍은 eppendorf 튜브에 저장 cryovial에서 이동 및 접지 준비 때까지 액체 질소에 게재됩니다. </li><li> 무균 모래는 튜브에 추가되고 조직은 고급까지 micropestle를 사용하여 접지합니다. </li><li> 로체 총 RNA 준비 Kit에서 400 UL 용해 / 바인딩 버퍼가 추가되며 대단히 짧은 시간이 표시되지 않을 때까지 조직 추가지면입니다. </li><li> 샘플은 15 초 모래 및 이물질을 수집하는 13,000 RPM에서 1 분 늘인 다음 용해를 지원하고 vortexed입니다. </li><li> 뜨는은 열을 회전에 추가되고 감독으로 RNA 준비 키트 지침의 나머지 부분은 다음입니다. </li></ol> DNAse 치료 <ol><li> 10X DNAse 버퍼의 10분의 1 RNA 샘플 볼륨이 추가됩니다. </li><li> DNAse 30 단위가 추가되고 반응은 37 incubated 있습니다 ° 30 분 및 70 ° C 5 분위한 C. </li></ol> 역방향 전사 <ol><li> cDNA 키트에 적용 Biosystems RNA는 당 방향, 37 incubated 반응 ° C 1 시간 95 ° C 5 분.로 사용됩니다 </li></ol> cDNA는 다음 PCR이나 qPCR에 사용됩니다 qPCR qPCR는 ABI의 1 단계 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 모든 assays는 각 실행 세중의에서 수행되었다. 굴지의 유전자는 사본 번호를 컨트롤처럼 사용되었다가장 가능한 하우스 키핑 유전자. <ol><li> 적절한 프라이머 쌍은 1μl의 각 튜브에 추가되었습니다. </li><li> cDNA는 적절한 농도와 9μl로 희석되었다 각각의 튜브에 추가 </li><li> 2X 전원 SYBR 녹색 PCR MasterMix (ABI)의 10μl와 각 튜브에 추가되었습니다 </li><li> 프로그램 증폭 프로그램은 보낸 사람 : <ul><li> 95 10 분 ° C </li><li> 95에서 15sec 40 사이클 ° C, 60 ° C에서 1 분 </li></ul> 증폭 특이성을 확인하기 위해 열 변성 단계 </li><li> 상대 표현 수준 2의 값이 (- CTactin CTunknown)에 의해 결정됩니다. </li></ol> DNA 준비 <ol><li> Qiagen DNeasy 식물 DNA 준비 Kit에서 버퍼 AP1은 microfuge 튜브의 살균 모래, 6 단풍에 추가됩니다. 아무 대단히 짧은 시간이 표시되지 않습니다 때까지 조직은 micropestle과 땅입니다. </li><li> 키트 지침은 지시대로 따라합니다. </li></ol> 검색 결과 줄기 따라 다양한 위치에 나뭇잎에서 분리된 DNA의 PCR 증폭은 식물 유도 조건 (4)에 따라 성장하는 동안 LIS - 1의 모습이 발생하는 것을 보여줍니다. qPCR 결과 LIS - 1 (또는 유도와 관련된 다른 게놈 변경)의 존재가 LIS - 1의 바로 근처 (그림 2)에서 유전자의 표현에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 그림 2에 표시된 여섯 유전자는 모든 differentially 넷은 높은 PL 표현 (LIS - 1 제외) S의 높은 표현을 (LIS - 1를 가지고있는)하는 데 두 필요로 아베와 S로 표현됩니다. 패널 1과 2는 LIS - 1의 삽입 지점에 가장 가까운 두 유전자입니다. 서로 다른 성장 조건 하에서 큰 genotroph (유발 변화를 가지고 있지만 LIS - 1을하지 않는)와 표현에서 이러한 유전자의 표현은 LIS - 1과 표현의 변화 사이에 인과 관계를 결정하기 위해 필요한 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 경기수, L과 S는 세 가지 다른 영양소 정권 아래에서 성장. 패널 - 제어, B - 낮은 영양소 및 C - NPK. D - 경기수, 전자 - S, F - 제가 패널 D를 - F 왼쪽에서 오른쪽으로 : 낮은 영양분, 제어 및 NPK. D - 경기수, 전자 - L, F - S. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="그림 2 엄지" /> LIS - 1의 삽입 지점 주위에 그림 2. 유전자 발현. 진 1 (성장 억제제) LIs1 즉시 5 &#39;이며 LIS - 1의 유전자 2 (킵 관련 cyclin 의존 키나제 억제제 아이디 3 &quot;. 다른 유전자는 모든에서 만들어진 같은 비계 (~ 5백킬로바이트) 갈래 전체 플렉스 게놈 시퀀스하시기 바랍니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 낮은 영양 조건 하에서 재배 스토 몬트 서러스의 식물의 각각의 나뭇잎에서 추출한 DNAs의 PCR의 amplifications. PCR 제품은 2 % 아가로 오스 - TBE 젤에서 분리되었다. uninserted 사이트 패널에 표시됩니다, 삽입된 사이트의 두 끝을는 패널 B와 C로 표시됩니다 리프 샘플 1-6은 예제 1 파종 후 초기되는 주간 간격으로 고립되었다.

<ol>
	<li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum.">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax.">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li><li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmentally+induced+adaptive+(?)+insertion+event+in+flax.">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

플렉스는 본질적으로 불안 정한 게놈을 가지고 나타납니다. 몇 세대에 걸쳐 재배 때 상업 섬유 아마 종류의 숫자가 급격히 비 균일됩니다. 같은 관찰은 오일 플렉스 종류에 대한 진정한 보유하지 않습니다. 따라서 섬유의 품질과 게놈 불안정성에 대한 선택 사이의 연관이있을 나타납니다. 환경 원래 섬유 작물의 성장의 농경 관찰 조사를 통해 확인되었습니다 아마 변화를 물려 전할 수있는 유도. 특정 phenotypic과 게놈 유사 이러한 반복 관측 환경 스트레스가 발생할 수 있습니다 게놈 rearrangements의 제품군에 영향을 미칠 수있는 방법의 질문을시킵니다. 특정 환경에 대응하기 LIS - 1의 반복 모습이 돌연변이 직접 또는 간접적으로 선택되는과 일치합니다. 다양한 치료에 의해 유도 라인의 성장은 또한 관련 유도하는 조건 하에서 향상된 성능을 나타냅니다. 또 다시 LIS - 1의 존재와 관련된 표현의 변경 사항이이 삽입 식물 성능에 영향을 미칠 것을 나타냅니다. 비디오 프레 젠 테이션은 기존의 인쇄물을 통해 전달하는 것은 불가능 방식으로 공장 phenotypic 변화를 관찰을위한 포럼을 제공합니다.

<ul><li> 원래 스토 몬트 서러스 다양한 플렉스 씨앗 경기수 및 genotrophs L과 S를 표시됨 </li><li> 5 &quot;냄비 </li><li> 토양 potting </li><li> 촉진제 </li><li> 온실 </li><li> 고압 나트륨 조명 </li><li> 액체 질소 </li><li> 모르타르 및 pestles </li><li> Micropestles 및 microfuge 튜브 </li><li> Thermocycler </li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동 장치 </li><li> 디지털 이미징 설정 </li><li> StepOne qPCR 모듈 </li><li> Qiagen DNeasy 식물 DNA 준비 키트 </li><li> cDNA 키트에 적용 Biosystems RNA </li><li> 로체 총 RNA 준비 키트 </li></ul>

environmentally induced heritable changes in flax

어떤 아마 품종들은 게놈을 수정하고 이러한 수정이 여러 세대에 걸쳐 상속 수에 의해 영양 스트레스에 대응. 또한 이러한 게놈 변화와 관련된 것은 phenotypic 유사 1,2을 물려 전할 수있는 있습니다. 세 가지 다른 영양 조건 하에서 재배 아마 다양한 스토 몬트 서러스 (PL)는 중 (제어 조건 하에서) inducible 유지 또는 안정 각각 높거나 낮은 영양 조건 하에서 성장하여 규모 genotroph을 하나에 수정이 될 수 있습니다. 이러한 조건의 각에서 초기 성장으로 인한 라인이 이후 세대에서 동일한 조건 하에서 재배하면 더 나은 성장을 표시, 특히 아베 라인은 높고 낮은 영양소 모두 아래에서 성장하는 식물 미만 나타내는 컨트롤 치료하에 최고의 성장 스트레스. 식물 영양 스트레스 증가하는 동안 물려 전할 수있는 변화의 유도와 관련된 게놈 변화 중 하나는 삽입 요소의 모양 (LIS - 1) 3, 4이다. 이 삽입 행사와 관련, 아마 다양한 스토 몬트 서러스 (PL)이 세 가지 영양 조건 하에서 재배 때하는 것이 중 (제어 조건 하에서) 변함없다 수 삽입은 모든 식물에 나타납니다 (낮은 영양소 이하) 이것이 전염이있다 다음 세대하거나 삽입 (또는 일부)가 나타나지만 세대 (높은 영양소 이하) 4 전송되지 않습니다. 이 삽입의 모양의 주파수는 또한 후속 세대의 성장 반응과 일치 긍정적인 선택, 아래에 나타냅니다. 성장의 다양한 단계에서 수확 잎 또는 meristems는 DNA와 RNA 분리에 사용됩니다. RNA는 다양한 성장 환경 및 / 또는 t 그는 존재 / LIS - 1의 부재와 관련된 표현의 변화를 식별하는 데 사용됩니다. 분리된 DNA는 삽입가 발생하는 그 식물을 식별하는 데 사용됩니다.

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Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

게놈과 phenotypic 유사 콘텐츠의 집합 내에서 게놈 변화의 영양소 스트레스 결과에 따라 일부 아마 품종을 재배. 특정 사이트에서 복잡한 삽입 다양한 영양 정권 아래에서 성장과이 사이트 주변의 유전자 표현의 변화와 연결되어 있습니다.

플렉스의 변경을 물려 전할 수있는 환경을 유도

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.2K 조회수.  Case Western Reserve University. 게놈과 phenotypic 유사 콘텐츠의 집합 내에서 게놈 변화의 영양소 스트레스 결과에 따라 일부 아마 품종을 재배. 특정 사이트에서 복잡한 삽입 다양한 영양 정권 아래에서 성장과이 사이트 주변의 유전자 표현의 변화와 연결되어 있습니다.

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

연구

생물학

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

이중층 탄성 등록 정보 모니터링 변경에 대한 단일 분자 방법

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

쥐에서 유선의 형태론과 유방암 위험의 변화

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

&#39;Peroxidative&#39;와 &#39;산화&#39;히드록실 급진적 Footprinting에 의해 RNA 구조의 모니터링 평형 변경

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응을 측정

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

아마의 꽃 - 딥 변환 (<em&gt; LINUM usitatissimum</em&gt;) 높은 변환 속도와 형질 전환 자손을 생성합니다

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...