The authors gratefully acknowledge the National Science Foundation (NSF) for financial support of this work through a CAREER award (CBET-0746210) and through award CBET-1159500. We would like to thank Dr. Turkson (Univ. of Hawaii Cancer Center) and Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) for assistance with cell culture.

1. 배양 세포주 <ol><li> 이하의 2 분 동안 온수에 냉각제 튜브를 보유함으로써 해동 TE 71 (마우스 흉선 상피 세포), MDA-MB-231 (인간 유방암 세포), A549 (인간 폐암 세포) 및 OVCAR3 (인간 난소 종양 세포) . 106 × g으로 6 분 동안 각각의 세포주를 원심 분리하고, 10 % FBS가 보충 된 10 mL의 DMEM 배지를 추가한다. </li><li> 서스펜션을 기음과 펠렛에 3 ㎖ 미디어를 추가 할 수 있습니다. 적절 수회 피펫 팅하여 세포를 섞는다. 이 용액을 셀 T75 플라스크에 10 % FBS가 보충 된 DMEM 7 mL의 배지를 예열 사전에 추가하고, 37 ℃에서 95 % 공기 / 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 플라스크를 유지한다. 통로 0으로이 플라스크 레이블. </li><li> 세포의 80 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, 10 분 동안 0.05 % 트립신 이들을 배양하여 세포를 수확. 미디어의 동일한 양을 첨가함으로써 트립신을 중성화. 원심 분리기 106 X g에서 6 분 동안이 솔루션입니다. 서스펜션을 제거하고 여기에 3 ㎖에게 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다. 아 믹스L 7 ml의 미디어를 포함하는 배양 플라스크에 소량 (100 μL)를 전송합니다. 인큐베이터에서 배양 플라스크를 품어. 항로 1과 플라스크 레이블. </li><li> 통로 11 또는 12까지 문화 세포주. </li></ol> 나노 입자의 2 제작 <ol><li> ~ 10 -6 M (조정) 희석 MEH-PPV 원액의 조제 <ol><li> 바이알 1 ㎎ 분자량 폴리 [2- 메 톡시 -5- (2- 에틸 헥 실옥시) -1,4- 페닐 렌 비닐 렌] (MEH-PPV) (평균 Mn)는 150,000-250,000 g / 몰, 3 ml의 테트라 히드로 푸란 (THF)을 첨가 . 핫 플레이트상에서 80 ℃에서 가열하면서 2 시간 동안 교반한다. </li><li> 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 새로운 바이알에 상기 용액을 필터. &#39;희석 MEH-PPV 원액&#39;으로이 솔루션을 레이블. 단계 2.1.3과 2.1.4에 설명 된대로이 솔루션은 농도의 미세 조정 후 나노 입자 준비에 참여한다. </li><li> 3의 용액으로 희석 MEH-PPV 주식 솔루션의 50 μl를 추가. &#39;희석 MEH-PPV 원액&#39;으로이 솔루션을 레이블. 자외선 - 마주 분광에 의해 495 nm에서 흡광도를 1cm 석영 큐벳에 전송하고 측정한다. </li><li> 희석 MEH-PPV 원액의 흡광도가 0.17보다 높은 경우, 한 번에 THF 1 mL를 첨가하여 희석 MEH-PPV 스톡 용액을 희석하고, 495 nm에서의 흡광도가 될 때까지 단계 2.1.3을 반복 0.13-0.17의 범위. </li><li> 아래 그림과 같이 램버트 - 비어 법칙을 사용하여 희석 MEH-PPV 주식 솔루션의 몰 농도를 계산합니다. 여기에 0.15 흡광도 프로토콜의 나머지 예로서 사용된다 (예., 관측 흡광도 모든 다음 계산을 조정), 사용 MEH-PPV의 흡광 계수가 107 M -1 cm 사용 경로 길이가 -1이다 1cm. = ε xbxc (는 식 1) (ε - 몰 흡광 계수, A - 흡광도, B - 경로 길이, C - 용액의 농도) 0.15 = 10 7 M -1 cm -1 X 1cm의 XC (는 식 2) C = 1.5 × 10 -8 M (는 식 3) 다음과 같이 희석 MEH-PPV 원액의 농도를 찾기 위해 상기 농도를 사용 M 1 V 1 = M 2 V 2 (는 식 4) 0.15 × 10-7 M X 3050 μL = M 2 × 50 μL (는 식 5) M 2 = 9.15 × 10 -7 M (는 식 6) 이것은 &#39;조정 희석 MEH-PPV 원액&#39;의 농도이다. </li></ol></li><li> 조정 희석 MEH-PPV 원액에 MEH-PPV의 질량을 계산 <ol><li> 섹션 2.1.4에서 얻어진 몰 농도 10 6g / 몰이다 MEH-PPV의 분자량 (M w)를 사용하여 다음과 같이 조정 원액 원액 1 ml의 MEH-PPV의 질량을 계산한다. M = N / V (N -. 더 몰, V - L의 볼륨 ()는 식 7) 따라서, 1 ㎖ 중의 MEH-PPV의 질량의 조절 싶게iluted 원액 9.15 X 10-4 g이다. </li></ol></li><li> MEH-PPV의 혼합 PCBM <ol><li> 페닐 C 61 - 뷰티 르산 메틸 에스터 (PCBM)의 질량을 계산하는 것은 50 중량 % PCBM은 질량에 대해 정의 된 50 중량 % PCBM 도핑 MEH-PPV 용액을 만들기 위해 콘텐츠 MEH-PPV 용액에 첨가되는 MEH-PPV의 (즉, MEH-PPV의 절반 질량). 2.2 절에서 얻은 MEH-PPV의 무게를 사용하여. MEH-PPV × 100 % = 50 중량 % PCBM의 PCBM / 9.15 × 10 -4 G의 질량 (는 식 8) PCBM = 4.57 × 10 -4 G의 질량 (는 식 9) </li><li> 유리 병에 1 mg을 PCBM의 무게를 500 μL의 THF를 추가합니다. 910.88 g / 몰로서 PCBM의 분자량을 사용하여이 용액에 PCBM의 농도를 계산할 PCBM 솔루션 = 0.001 g / (910.88 g / 몰 * 500 μL)의 몰 농도 (는 식 10) PCBM 용액의 몰 농도 = 2.19 × 10 -9 몰 / μL (는 식 (11)) </li><li> PCBM 용액의 부피를 계산하는 조정에 추가 할 필요 ME를 희석하지H-PPV 스톡 용액을 단계 2.3.2에서 산출 몰 농도를 사용하여 THF의 50 중량 % 도핑 PCBM MEH-PPV 용액을 얻었다 4.57 X PCBM X 1 몰 / 910.88 GX 1 μL / 2.19 × 10 -9 몰 = 229 μL의 10 -4 G (는 식 (12)) 조정 희석 MEH-PPV 원액 1 ㎖로 PCBM 용액 229 μl를 넣고 잘 섞는다. </li></ol></li><li> 재 침전 방법에 의한 나노 입자의 제조 <ol><li> 전송에 연결된 바늘로 1 ML의 주사기에 혼합 MEH-PPV / PCBM 용액 1ml를. </li><li> 급속 1,200 rpm으로 교반 DI 물 4 ㎖ 중에 혼합 MEH-PPV / PCBM 용액 1 ㎖을 주입. 주사 후 즉시 교반 중지합니다. 추가 처리없이 이러한 나노 입자를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 이미징을위한 나노 입자와 세포 라인의 3 배양 참고 : 모든 영상 실험은 35mm 페트리 접시에 완성되었다 <ol><li> nanoparti의 통풍 관세포주에서 사이클 사용 <ol><li> 12 번째 통로까지 배양 세포주. 35mm 배양 접시에서 12 일 통과 배양 세포에서. 24 시간 후 세포가 40 %의 합류이되도록 35mm 배양 접시에 추가 세포의 농도를 조정합니다. </li><li> 이 단계에서, 배양 접시에서 10 % FBS가 첨가 된 DMEM 미디어를 제거 두 번 1X DPBS로 세포를 씻어하고 페트리 접시에 2 ml의 DMEM에 나노 입자 현탁액의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 24 시간 후 배양 접시에서 DMEM / 나노 입자 현탁액을 제거하고 1X DPBS 3 회와 세포를 씻으십시오. 그런 다음 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 인큐베이션하여 세포를 고정한다. DPBS로 두 번 씻으십시오. 2 분 동안 인큐베이션하여 염료가 300nm DAPI와 세포를 염색. DPBS로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 이미징 DPBS에서 세포를 유지합니다. </li></ol></li><li> ROS의 탐지 <ol><li> 문화 A549 및 섹션 3.1.1에 설명 된대로 페트리 접시, 세포주 당 6에서 OVCAR3 세포 라인. 레이블페트리 접시는 표 1에 도시. </li><li> 표 1과 24 시간 동안 배양으로 배양 접시의 세에 2 ml의 DMEM에 나노 입자 현탁액의 100 μl를 추가합니다. 빛 복용량을받을 24 시간 후 세포를 씻어 HBSS (행크의 균형 소금 용액)의 셀을 중단 무료 미디어를 염색 할 배양 접시하십시오. </li><li> 15 분의 솔라 시뮬레이터의 램프를 따뜻하게. 자외선을 걸러 램프의 전면에 UV 필터를 놓습니다. 페트리 접시의 표면에서 0.5 일 (50 mW의 / cm 2)의 강도를 얻기 램프 전력을 조정함으로써 기준 태양 전지와 램프를 보정. 이 특정 설정에서 해당 조건 램프에 공급되는 218 W의 전력을 얻을 수 있었다. </li><li> 180 J 아래의 계산과 같이 / ㎠의 빛 복용량 결과 60 분 동안 램프 (뚜껑 오픈)에서 배양 접시를 놓고 : 50 mW의 / cm 2 × 3,600 초 / 1,000 = 180 J / ㎠ </li><li> HBSS를 제거하고 세척하지 않고 더 배양 접시에 10 % FBS가 첨가 된 2 ml의 DMEM 미디어를 추가 할 수 있습니다. 또 다른 2 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 양성 대조군을 30 분 동안 100 μM 과산화수소 (H 2 O 2)와 함께 세포를 배양한다. </li><li> 37 ° C에서 30 분 동안 염색을 가진 세포를 배양하여 ROS 검출 시약 5 μM의 최종 농도로 모든 배양 접시에 세포를 염색. </li><li> 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 인큐베이션하여 세포를 고정한다. DPBS로 두 번 씻으십시오. 2 분 동안 인큐베이션하여 염료가 300nm DAPI와 세포를 염색. DPBS로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 이미징 DPBS에서 세포를 유지합니다. </li></ol></li><li> PI와 아 넥신 V FITC에 의해 세포 사멸 및 괴사 <ol><li> 문화 5 페트리 접시에 각각의 세포주. 나머지 2 페트리 접시 제어 샘플 될 것이지만이 배양 접시의 세 가지 실험이 될 것입니다. 전자와 같은 나노 입자 실험 3 페트리 접시를 품어섹션 3.1.2에 xplained. 제어 샘플을 나노 입자로 배양되지 않습니다. </li><li> 24 시간 배양 후 단계 3.2.3을 따르십시오. </li><li> 램프 (뚜껑 오픈)에서 3 실험 배양 접시를 놓고 20 분, 40 분에 한 60 분에서 하나에 하나를 제거합니다. 이 60, 120, 180의 가벼운 용량 J / ㎠, 각각 (섹션 3.2.4에서 계산)에 노출 된 세 개의 샘플을 얻을 수 있습니다. 다음에, 제어 배양 접시 중 하나에 180 J / cm 2 광 투여를 관리. 이는 나노 입자의 부재 하에서인가 광 복용량 제어이다. 빛 나머지 제어 샘플 용량 (NO 나노 입자 및 적용 등 없음 용량)를 적용하지 마십시오. </li><li> 10 % FBS가 첨가 된 DMEM 매체와 HBSS를 교체하고 4 시간 동안 인큐베이터에서 배양 접시를 유지한다. </li><li> 15 분 동안 염색하여 세포를 배양하여 실험 및 아 넥신 V의 FITC 20 μL와 제어 배양 접시에 세포를 염색. DPBS로 두 번 씻으십시오. C를 얼룩2 분 동안 염료로 배양 300 나노 DAPI뿐만 아니라 300 나노 PI (요오드화 프로피 듐)와 ELL 학생. DPBS로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 이미징 DPBS에서 세포를 유지합니다. </li></ol></li></ol> 나노 입자 4. 내장 세포 독성 <ol><li> 96 웰 플레이트에 세포 배양을 계산 <ol><li> 미디어를 제거하고 10 분 동안 0.05 % 트립신으로 세포를 인큐베이션 DPBS로 두 번 세포를 세척하여 배양 플라스크로부터 세포를 수확. 그 결과 세포 용액에 10 % FBS가 첨가 된 2 ml의 DMEM 미디어를 추가합니다. 단봉으로 세포 클러스터를 분리하는 제대로 솔루션을 섞는다. </li><li> 세포 현탁액 100 ㎕을 취하여 10 % FBS가 보충 된 900 ㎕의 DMEM 배지에 추가. 잘 섞는다. 혈구에이 서스펜션의 10 μl를 놓습니다. 혈구를 사용하여 세포를 세어 4.1.1 4 × 10 5 세포 / ml의 세포 현탁액의 농도를 조절한다. </li><li> 5 96 웰 플레이트는 0 시간, 24 시간으로 표시 가지고 가십시오R, 48 시간, 72 시간, 96 시간. 따라서 / 웰의 세포를 파종 2500, 표 2에 나타낸 바와 같이 우물에 5 × 104 세포 / ㎖의 세포 용액 50 ㎕의 TE (71, A549)를 추가한다. OVCAR3 및 MDA-MB-231 세포주에 대해 동일한 절차를 수행합니다. </li><li> 24 시간 후 1X DPBS 가진 웰을 세척하고, 표 2에 나타낸 바와 같이 우물에 나노 입자의 농도가 증가하는 50 μL를 추가한다., 20 (100)를 추가하여 다양한 나노 입자의 농도를 준비하고, DMEM 2.4.2로부터의 나노 입자 현탁액을 180 μL에 각각 최종 0.4 × 10-4 ㎎ / ㎖ 농도의 나노 입자를 얻을 수 2 ㎖의 부피, 2.0 × 10 -4 ㎎ / ㎖, 3.6 X 10-4 ㎎ / ㎖를 얻었다. 각 셀 라인은 나노 입자의 각 농도 삼중있다. </li></ol></li><li> 어둠 속에서 세포 생존 능력을 측정 <ol><li> 바로 나노 입자를 추가 한 후 0 시간 플레이트에 10 μL의 MTT를 추가합니다. 포르 마잔 크리스 í 4 시간 동안 접시를 품어루게릭 병은 형성한다. 우물에 50 μL의 가용화 솔루션을 추가합니다. 포르 마잔 결정을 용해 6 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 마이크로 플레이트 리더와 570 nm에서 흡광도를 기록하여 0 시간 플레이트의 세포 생존율을 측정한다. </li><li> 24 시간 플레이트를 들어, 1X DPBS로 세포를 씻어 나노 입자와 각 웰 후 24 시간 배양에 50 μL 미디어를 추가 할 수 있습니다. MTT를 추가하고 4.2.1과 4.2.2에서 설명 판을 읽어 보시기 바랍니다. </li><li> 48 시간, 72 시간, 96 시간 플레이트, 1X DPBS로 세포를 씻어 나노 입자와 24 시간 배양 한 후 우물에 50 μL 미디어를 추가 할 수 있습니다. 남은 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 4.2.1 4.2.2 4.2.5에서 설명 된 바와 같이) 특정 시점에서 세포 생존 능력을 측정한다. </li><li> (N = 3) 3 회 반복 실험을 완료 </li></ol></li></ol> 5. PDT 후 세포 생존 능력을 측정 <ol><li> 세포를 계산하고 96 웰 플레이트에서 배양. <ol><li> 9 세트 레이블TE A549 71 + 판 OVCAR3 + 및 MDA-MB-231 플레이트 모두 표 3에 나타낸 바와 같이 6 웰 플레이트. 4.1.3에 도시 된 바와 같이 판의 배치는 동일하다. </li><li> 섹션 4.1.2에서 표 2에 나타낸 바와 같이 동일한 레이아웃 4.1 절에서 설명한 바와 같이 96 웰 플레이트 종자. </li><li> 24 시간이 판에 나노 입자를 추가 한 후 4.1.4에 설명 된대로. </li><li> 나노 입자의 첨가 한 후 24 시간이 1X DPBS로 세포를 씻어 각 웰에 50 μl의 HBSS를 추가합니다. </li><li> 3.2.3에서 설명한 바와 같이 각각의 빛의 용량을 가진 판을 조사. </li><li> 10 % FBS가 첨가 된 50 μL DMEM 매체와 HBSS를 교체하고 PDT 후 각각의 기간에 대한 번호판을 품어. </li><li> 4.2.1과 4.2.2에서 설명한 바와 같이 각각의 시간 후 세포 생존율을 측정한다. </li></ol></li></ol> 6. 형광 현미경 <ol><li> 나노 입자의 통풍 관 <ol><li> 현미경의 램프를 켜십시오차 영상 전에 레이저 30 분. 현미경의 무대에 (3.1 절에서 설명) 고정 된 세포를 포함하는 배양 접시를 넣어. </li><li> . 표 4에 나타낸 바와 같이 필터를 사용하여 나노 입자 및 DAPI에서 형광을 수집 ImageJ에 소프트웨어의 위상차, 나노 입자 및 DAPI 이미지를 오버레이. </li></ol></li><li> ROS의 탐지 <ol><li> 촬영 전에 현미경 30 분의 램프를 켭니다. 현미경의 무대에 (3.2 절에서 설명) 세포를 포함하는 배양 접시를 넣어. </li><li> . 표 4에 나타낸 바와 같이 필터를 사용하여 나노 입자를 검출 시약, DAPI 및 형광 ROS로부터 수집 ImageJ에 소프트웨어의 위상차, 나노 입자, 및 DAPI ROS 검출 시약 이미지를 오버레이. </li></ol></li><li> PI와 아 넥신 V FITC에 의해 세포 사멸 및 괴사 <ol><li> 촬영 전에 현미경 30 분의 램프를 켭니다. 에서 설명한 바와 같이 (세포를 포함하는 페트리 접시를 넣어현미경의 무대에 3.3 절). </li><li> . 표 4에 나타낸 바와 같이 필터를 사용하여 나노 입자, DAPI, PI 및 넥신 V에서 FITC 형광을 수집 ImageJ에 소프트웨어의 위상차, 나노 입자, DAPI, PI 및 넥신 V FITC 이미지를 오버레이. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

나노 입자를 제조하는 동안 나노 입자의 흡수를 달성하기 위해 그것은 몇 가지 중요한 조치를 유지하기 위해 필요한이었다. 이 용액의 농도가 형성되는 나노 입자의 크기를 결정하는데 중요한 역할을하는 것으로 관찰되었다로 THF에 (50 중량 % PCBM 혼합) × 10-6 M MEH-PPV 용액을 DI 물 내로 주입하도록 준비 하였다. 농도는 자외선 - 마주 분광에 의해 확인되었다. 프로토콜 단계에서 그 처음이 ?...

광 역학 요법 (PDT) 감광제는 조직을 대상으로 투여하고, 감광제를 노광시에 활성 산소 종 (ROS)를 생성한다. 이러한 중항 산소와 슈퍼 옥사이드 등의 활성 산소 종은 산화 스트레스 및 세포 및 조직 1-4 이후에 구조적 손상을 유도 할 수 있습니다. 때문에 응용 프로그램의 용이성이 방법을 적극적으로 조사되었으며, 임상 시험 장소 5,6를 촬영했다. 그러나, (감소 생체 이용률 및 잠재적 인 급성 독성에 이르게) 증감의 어두운 증감의 독성, 빛 (으로 인한 증감의 비 선택적 분포) 환자 감도 및 소수성과 같은 중요한 문제가 남아있다. 여기에서 우리는 제작과 시험관 PDT의 차세대 감광제로 풀러렌과 혼합 고분자 나노 입자를 실시하고 평가하는 방법을보고합니다. 나노 입자의자가 응집에 의해 형성된다반도체 성 중합체 MEH-PPV (폴리 [2- 메 톡시 -5- (2- 에틸 헥 실옥시) -1,4- 페닐 렌])이 물질에 용해 호환 플러렌 PCBM (C-61 페닐 - 부티르산 메틸 에스터)와 용매를 신속하게 호환되지 않는 용매 (그림 1A)에 주입된다. 호스트 중합체로서 MEH-PPV의 선택은 삼중 형성 높은 속도에 이르게 높은 흡광 계수에 의해 동기 및 플러렌 PCBM 7 효율적인 초고속 충전 및 에너지 전달을 모두한다. 이러한 속성은 단일 산소와 PDT의 과산화물 형성의 증감에 이상적입니다. 플러렌은 실제로 두 분자 및 나노 입자 형태로 8-13 PDT에 적용되어왔다. 그러나 심각한 독성은 추가 개발 (12) 방해했다. 여기에서 우리는 MEH-PPV의 호스트 매트릭스에 풀러렌을 캡슐화하는 PDT 증감 재료 복합 MEH-PPV / PCBM 나노 입자의 결과를 얻을 것을 보여 그 전본질적으로 세포 독성이 아니다 인해 상기 광 물리 특성에 암 나노 입자의 크기 및 표면 전하에 의한 세포 및 낮은 조명 용량에서 수율이 매우 효과적인 PDT 치료 대한 특이성을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV)</td><td>Sigma Aidrich</td><td>536512-1G</td><td>average M&lt;sub&gt;n&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;150,000-250,000</td></tr><tr><td>[6,6]-Phenyl C61&amp;nbsp;butyric acid methyl ester (PCBM)</td><td>Sigma Aidrich</td><td>684449-500MG</td><td>&gt;99.5%</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF)</td><td>EMD</td><td>TX0284-6</td><td>Drisolv</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>National Scientific Company</td><td>37510-1</td><td>For filtration of MEH-PPV solution</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>VWR</td><td>28145-495</td><td>25 mm, 0.2 &amp;micro;m, PTFE</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>Hamilton Company</td><td>81320</td><td>For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modification of Eagle&#039;s Medium/Ham&#039;s F-12 50/50 Mix (DMEM)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-350</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS)</td><td>Quality Biological (VWR)</td><td>10128-740</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-436</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x 0.25%</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-664</td><td>Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>15710</td><td>16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>&amp;nbsp;Biotium VWR</td><td>89139-054</td><td>Nuclear stain</td></tr><tr><td>5 ml pipettes</td><td>VWR</td><td>82050-478</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flask</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td>for culturing cells</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>VWR</td><td>82050-771</td><td>for MTT assays</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dishes with Vents</td><td>Greiner Bio-One (VWR)</td><td>82050-538</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Molecular probes</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A13199</td><td>dye for apoptosis</td></tr><tr><td>Celltiter 96 non-R 1000 assays</td><td>Promega (VWR)</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=PAG4000&quot;&gt;PAG4000&lt;/a&gt;</td><td>MTT</td></tr><tr><td>CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection</td><td>Invitrogen</td><td>C10444</td><td>For ROS detection</td></tr><tr><td>UV-vis spectrometer</td><td>Agilent 8453</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence spectrometer</td><td>NanoLog HoribaJobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynamic light scattering</td><td>PD2000DLS, Precision detector</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>NuAir DH Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss Axioskop2</td><td></td><td>63X oil immersion objective lens</td></tr><tr><td>Epiluminescence microscope</td><td>Olympus IX71</td><td></td><td>60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera</td></tr><tr><td>Solar Simulator</td><td>Newport 67005 Oriel Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reference solar cell</td><td>Oriel&amp;nbsp;</td><td></td><td>VLSI Standards Incorporated</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>BioTek Ex808</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific Partnership</td><td>3200</td><td>For counting cells</td></tr></tbody></table>

photodynamic therapy with blended conducting polymer/fullerene nanoparticle photosensitizers

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT) is reported. The nanoparticles are formed by hydrophobic interaction of the semiconducting polymer MEH-PPV (poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene]) with the fullerene PCBM (phenyl-C61-butyric acid methyl ester) in the presence of a non-compatible solvent. MEH-PPV has a high extinction coefficient that leads to high rates of triplet formation, and efficient charge and energy transfer to the fullerene PCBM. The latter processes enhance the efficiency of the PDT system through fullerene assisted triplet and radical formation, and ultrafast deactivation of MEH-PPV excited stated. The results reported here show that this nanoparticle PDT sensitizing system is highly effective and shows unexpected specificity to cancer cell lines.

통풍 및 나노 입자의 고유 세포 독성 50 중량 % 혼합 MEH-PPV / PCBM 나노 입자 TE (71)와 함께 배양하고, MDA-MB-231, A549 및 OVCAR3 세포주. PCBM 혼합 수준은 공액 폴리머 및 풀러렌 (14) 사이의 최적의 충전 및 에너지 전달 특성을 제공하는 것으로 나타났다 50 중량 % PCBM로서 선택되었다. 나노 입자의 흡수 형광 이미지는도 1b에 도시되어있다. 나노 입자는 세포 흡수를 ?...

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Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT).

혼합 폴리머 / 풀러렌 나노 입자 감광제를 실시와 광 역학 치료

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

8.5K 조회수.  University of Central Florida. This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT). 

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Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light.
To increase the therapeutic effect of PDT, we developed both photosensitizer- and anticancer agent-loaded lung cancer-targeted nanoparticles. Both enhanced permeability and retention (EPR) effect-based passive targeting and hyaluronic-acid-CD44 interaction-based active targeting were applied. CD44 is a well-known hyaluronic acid receptor that is often introduced as a biomarker of non-small cell lung cancer. 
In addition, a combination of PDT and chemotherapy is adopted in the present study. This combination concept may increase anticancer therapeutic effects and reduce adverse reactions. 
We chose hypocrellin B (HB) as a novel photosensitizer in this study. It has been reported that HB causes higher anticancer efficacy of PDT compared to hematoporphyrin derivatives1. Paclitaxel was selected as the anticancer drug since it has proven to be a potential treatment for lung cancer2. 
The antitumor efficacies of photosensitizer (HB) solution, photosensitizer encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-NPs), and both photosensitizer- and anticancer agent (paclitaxel)-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-P-NPs) after PDT were compared both in vitro and in vivo. The in vitro phototoxicity in A549 (human lung adenocarcinoma) cells and the in vivo antitumor efficacy in A549 tumor-bearing mice were evaluated.
The HB-P-NP treatment group showed the most effective anticancer effect after PDT. In conclusion, the HB-P-NPs prepared in the present study represent a potential and novel photosensitizer delivery system in treating lung cancer with PDT.

Photodynamic therapy (PDT) is an alternative choice for lung cancer treatment. To increase the therapeutic effect of PDT, lung cancer-targeted nanoparticles combined with chemotherapy were developed. Both in vitro and in vivo anticancer efficacies of PDT with prepared nanoparticles were evaluated.

폐암 표적 나노 입자와 광 역학 치료의 항암 효능

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

연구

암 연구학

A 'Plug and Play' Method to Create Water-dispersible Nanoassemblies Containing an Amphiphilic Polymer, Organic Dyes and Upconverting Nanoparticles

In this protocol, we first describe a procedure to synthesize lanthanide doped upconverting nanoparticles (UCNPs). We then demonstrate how to generate amphiphilic polymers in situ, and describe a protocol to encapsulate the prepared UCNPs and different organic dye molecules (porphyrins and diarylethenes) using polymer shells to form stable water-dispersible nanoassemblies. The nanoassembly samples containing both the UCNPs and the diarylethene organic dyes have interesting photochemical and photophysical properties. Upon 365 nm UV irradiation, the diarylethene group undergoes a visual color change. When the samples are irradiated with visible light of another specific wavelength, the color fades and the samples return to the initial colorless state. The samples also emit visible light from the UCNPs upon irradiation with 980 nm near-infrared light. The emission intensity of the samples can be tuned through alternate irradiation with UV and visible light. Modulation of fluorescence can be performed for many cycles without observable degradation of the samples. This versatile encapsulation procedure allows for the transfer of hydrophobic molecules and nanoparticles from an organic solvent to an aqueous medium. The polymer helps to maintain a lipid-like microenvironment for the organic molecules to aid in preservation of their photochemical behavior in water. Thus this method is ideal to prepare water-dispersible photoresponsive systems. The use of near-infrared light to activate upconverting nanoparticles allows for lower energy light to be used to activate photoreactions instead of more harmful ultraviolet light.

Organic dye molecules and oleic acid coated upconverting nanoparticles are not water-soluble. This protocol describes a &#8216;plug and play&#8217; method that enables the transfer of organic dye molecules and upconverting particles from their initial hydrophobic solvent to water.

&#39;플러그 앤 플레이&#39;방법은 양친 매성 고분자, 유기 염료 및 업 컨버팅 나노 입자를 포함하는 수분 산성 Nanoassemblies 만들기

In this protocol, we first describe a procedure to synthesize lanthanide doped upconverting nanoparticles (UCNPs). We then demonstrate how to generate ...

화학

Electroactive Polymer Nanoparticles Exhibiting Photothermal Properties

A method for the synthesis of electroactive polymers is demonstrated, starting with the synthesis of extended conjugation monomers using a three-step process that finishes with Negishi coupling. Negishi coupling is a cross-coupling process in which a chemical precursor is first lithiated, followed by transmetallation with ZnCl2. The resultant organozinc compound can be coupled to a dibrominated aromatic precursor to give the conjugated monomer. Polymer films can be prepared via electropolymerization of the monomer and characterized using cyclic voltammetry and ultraviolet-visible-near infrared (UV-Vis-NIR) spectroscopy. Nanoparticles (NPs) are prepared via emulsion polymerization of the monomer using a two-surfactant system to yield an aqueous dispersion of the polymer NPs. The NPs are characterized using dynamic light scattering, electron microscopy, and UV-Vis-NIR-spectroscopy. Cytocompatibility of NPs is investigated using the cell viability assay. Finally, the NP suspensions are irradiated with a NIR laser to determine their effectiveness as potential materials for photothermal therapy (PTT).

A protocol is presented for the synthesis and preparation of nanoparticles consisting of electroactive polymers.

전기 활성 고분자 나노 입자 출전 광열 등록

A method for the synthesis of electroactive polymers is demonstrated, starting with the synthesis of extended conjugation monomers using a three-step ...

공학

5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Primary Bone Tumor and Bone Metastases Cell Lines

Bone metastases are associated with poor prognosis and low quality of life for the affected patients. Photodynamic therapy (PDT) emerges as a noninvasive therapy that can target local metastatic bone lesions. This paper presents an in vitro method to study the PDT effect in adherent cell lines. To this end, we demonstrate a step-by-step approach to subject both primary (giant cell bone tumor) and human bone metastatic cancer cell lines (derived from a primary invasive ductal breast carcinoma and renal carcinoma) to 5-aminolevulinic acid (5-ALA)-mediated PDT. 
After 24 h post 5-ALA-PDT irradiation (blue light-wavelength 436 nm), the therapeutic effect was assessed in terms of cell migration potential, viability, apoptotic features, and cellular growth arrest (senescence). Post 5-ALA-PDT irradiation, musculoskeletal-derived cell lines respond differently to the same doses and exposure of PDT. Depending on the extent of cellular damage triggered by PDT exposure, two different cell fates-apoptosis and senescence were noted. Variable sensitivity to PDT therapy among different bone cancer cell lines provides useful information for selecting more appropriate PDT settings in clinical settings. This protocol is designed to exemplify the use of PDT in the context of musculoskeletal neoplastic cell lines. It may be adjusted to investigate the therapeutic effect of PDT on various cancer cell lines and various photosensitizers and light sources.

<meta charset="utf8"></head><body>원발성 골종양 및 뼈 전이 세포주에 대한 5-Aminolevulinic Acid 매개 광역학 요법

This protocol presents a step-by-step methodological approach of exposing bone metastatic cells lines and primary bone tumors to 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy (PDT). The effects on cell migration potential/invasiveness, viability, apoptosis, and senescence potential are also analyzed following PDT exposure.

원발성 골종양 및 뼈 전이 세포주에 대한 5-Aminolevulinic Acid 매개 광역학 요법

Bone metastases are associated with poor prognosis and low quality of life for the affected patients. Photodynamic therapy (PDT) emerges as a noninvasive ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

공액 고분자에 의해 세포를 전기적 활동을 생활의 광 제어

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

생체공학

An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper tissue penetration. However, the existing instrumentation on the market is not readily compatible with upconversion application. Therefore, modifying the commercially available instrument is essential for this research. In this paper, we first illustrate the modifications of a conventional fluorimeter and fluorescence microscope to make them compatible for photon upconversion experiments. We then describe the synthesis of a near-infrared (NIR)-triggered caged protein kinase A catalytic subunit (PKA) immobilized on a UCNP complex. Parameters for microinjection and NIR photoactivation procedures are also reported. After the caged PKA-UCNP is microinjected into REF52 fibroblast cells, the NIR irradiation, which is significantly superior to conventional UV irradiation, efficiently triggers the PKA signal transduction pathway in living cells. In addition, positive and negative control experiments confirm that the PKA-induced pathway leading to the disintegration of stress fibers is specifically triggered by NIR irradiation. Thus, the use of protein-modified UCNP provides an innovative approach to remotely control light-modulated cellular experiments, in which direct exposure to UV light must be avoided.

In this protocol, caged protein kinase A (PKA), a cellular signal transduction bioeffector, was immobilized on a nanoparticle surface, microinjected into the cytosol, and activated by the upconverted UV light from near-infrared (NIR) irradiation, inducing downstream stress fiber disintegration in the cytosol.

원격으로 업 컨버전 나노 중재 니 Photoactivation에 의해 세포내 신호 변환 하는 통합된 시스템

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper ...

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built using a set of conventional programmable light-emitting diodes (LEDs), a liquid crystal display (LCD) module, and a light sensor connected to a commercial microcontroller board. The box-based structure of the prototype was made with medium-density fiberboards (MDFs). The internal compartment can simultaneously allocate four cell culture multiwell microplates.
As a proof of concept, we studied the cytotoxic effect of the photosensitizer (PS) verteporfin against the HeLa cell line in two-dimensional (2D) culture. HeLa cells were treated with increasing concentrations of verteporfin for 24 h. The drug-containing supernatant medium was discarded, the adherent cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS), and drug-free medium was added. In this study, the effect of verteporfin on cells was examined either without light exposure or after exposure for 1 h to light using red-green-blue (RGB) values of 255, 255, and 255 (average fluence of 49.1 &#177; 0.6 J/cm2). After 24 h, the cell viability was assessed by the 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay.
Experimental results showed that exposure of cells treated with verteporfin to the light from the device enhances the drug&#39;s cytotoxic effect via a mechanism mediated by reactive oxygen species (ROS). In addition, the use of the prototype described in this work was validated by comparing the results with a commercial PDT device. Thus, this LED-based photodynamic therapy prototype represents a good alternative for in vitro studies of PDT.

Here, we describe a novel, simple, and low-cost device to successfully perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays using two-dimensional HeLa cell culture and verteporfin as a photosensitizer.

2D 세포 배양 모델에서 Verteporfin 세포 독성을 향상시키기 위한 자체 제작 및 발광 다이오드 기반 광역학 치료 장치

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

생화학

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light photoactivation to induce cell apoptosis. The Federal Drug Administration has approved PDT for the treatment of actinic keratosis, and clinical guidelines recommend PDT as a treatment for certain non-melanoma skin cancers and acne vulgaris. PDT is an advantageous therapeutic modality as it is low cost, non-invasive, and associated with minimal adverse events and scaring. In the first step of PDT, a PS is applied and allowed to accumulate intracellularly. Subsequent light irradiation induces reactive oxygen species formation, which may ultimately lead to cell apoptosis, membrane disruption, mitochondrial damage, immune modulation, keratinocyte proliferation, and collagen turnover. Herein, we present an in vitro method to study PDT in an adherent cell line. This treatment protocol is designed to simulate PDT and may be adjusted to studying the use of PDT with various cell lines, photosensitizers, incubation temperatures, or photoactivation wavelengths. Squamous cell carcinoma cells were incubated with 0, 0.5, 1.0, and 2 mM 5-aminolevulinic acid (5-ALA) for 30 min and photoactivated with 417 nm blue light for 1,000 s. The primary outcome measure was apoptosis and necrosis, as measured by annexin-V and 7-aminoactinomycin D flow cytometry. There was a dose-dependent increase in cell apoptosis following thirty-minute incubation of 5-ALA. To achieve high inter-test validity, it is important to maintain consistent incubation and light parameters when performing in vitro PDT experiments. PDT is a useful clinical procedure and in vitro research may allow for the development of novel PSs, optimization of protocols, and new indications for PDT.

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light photoactivation to induce apoptosis. We present an in vitro PDT protocol designed to simulate PDT that may be used to study differences in PS incubation and light treatment parameters.

Photodynamic 치료 체 외에서 접근

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

의학

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, mouth, vagina, and skin. Despite the availability of antifungal medication, the mortality rate of invasive candidiasis remains ~50%. Unfortunately, the incidence of drug-resistant C. albicans is increasing globally. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) may offer an alternative or adjuvant treatment to inhibit C. albicans biofilm formation and overcome drug resistance. Rose bengal (RB)-mediated aPDT has shown effective cell killing of bacteria and C. albicans. In this study, the efficacy of RB-aPDT on multidrug-resistant C. albicans is described. A homemade green light-emitting diode (LED) light source is designed to align with the center of a well of a 96-well plate. The yeasts were incubated in the wells with different concentrations of RB and illuminated with varying fluences of green light. The killing effects were analyzed by the plate dilution method. With an optimal combination of light and RB, 3-log growth inhibition was achieved. It was concluded that RB-aPDT might potentially inhibit drug-resistant C. albicans.

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

The growing incidence of drug-resistant Candida albicans is a serious health issue worldwide. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) may offer a strategy to fight against drug-resistant fungal infections. The present protocol describes Rose bengal-mediated aPDT efficacy on a multidrug-resistant C. albicans strain in vitro.

로즈 벵골 매개 광역학 치료 칸 디다 알비칸을 억제하기 위해

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

혼합 폴리머 / 풀러렌 나노 입자 감광제를 실시와 광 역학 치료

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폐암 표적 나노 입자와 광 역학 치료의 항암 효능

'플러그 앤 플레이'방법은 양친 매성 고분자, 유기 염료 및 업 컨버팅 나노 입자를 포함하는 수분 산성 Nanoassemblies 만들기

전기 활성 고분자 나노 입자 출전 광열 등록

원발성 골종양 및 뼈 전이 세포주에 대한 5-Aminolevulinic Acid 매개 광역학 요법

원발성 골종양 및 뼈 전이 세포주에 대한 5-Aminolevulinic Acid 매개 광역학 요법

공액 고분자에 의해 세포를 전기적 활동을 생활의 광 제어

원격으로 업 컨버전 나노 중재 니 Photoactivation에 의해 세포내 신호 변환 하는 통합된 시스템

2D 세포 배양 모델에서 Verteporfin 세포 독성을 향상시키기 위한 자체 제작 및 발광 다이오드 기반 광역학 치료 장치

Photodynamic 치료 체 외에서 접근

로즈 벵골 매개 광역학 치료 칸 디다 알비칸을 억제하기 위해