광역학 요법인 PDT는 암 치료에 몇 가지 이점을 제공하며 그 효능은 광감작제를 활성화하는 광원에 따라 다릅니다. 최근 이 분야의 발전에도 불구하고, 시험관내 모델용 PTD를 위한 고가의 재현 가능한 장치에 대한 접근이 부족하다. 이러한 요구를 달성하기 위해 이 작업은 PhotoAct라는 세포 배양에서 PDT 분석을 수행하는 새롭고 간단하며 저렴한 장치를 설명합니다.
건설을 시작하려면 3mm 두께의 중간 밀도 섬유판 인 MDF를 사용하여 다음 치수의 조각을 얻었습니다. 다음 치수로 두 개의 상자를 만듭니다. 더 큰 상자의 뒷면을 뚫어 배럴 잭 커넥터를 설치합니다.
또한 더 큰 상자의 상단, 작은 상자의 상단 및 하단을 뚫어 전기 케이블을 위한 통로를 제공합니다. 균일한 빛의 입사를 촉진하기 위해 모든 내부 표면을 검은색 잉크로 칠합니다. 작은 상자의 상단 내부 표면에 각각 10개의 LED가 있는 3개의 LED 테이프를 병렬로 부착합니다.
또한 작은 상자의 하단 내부 표면 중앙에 밝기 센서를 설치하십시오. 보조 3D 인쇄 파일을 사용하여 제어 장치의 구조를 인쇄합니다. 모든 구성 요소, 전원 버튼, 전위차계, 시간 시작 터치패드, LED, 밝기 센서, LCD, 버저 및 전원 공급 장치와 제어 장치 내부에 장착된 ESP-32 컨트롤러 보드의 부품을 설치합니다.
보충 파일에서 사용할 수 있는 프로그래밍 코드를 업로드하고 테스트를 실행하여 모든 연결이 작동하는지 확인합니다. 상자를 조립하고 함께 고정하여 틈과 그에 따른 외부 조명 간섭 및 즉각적인 빛 손실을 방지하십시오. 장착 된 제어 장치를 프로토 타입 상단의 드릴 영역에 부착하십시오.
다음 치수의 동일한 재료의 전면 도어를 만들고 경첩과 벨크로 테이프로 외부 상자에 고정하여 챔버 폐쇄 및 중단 없는 분석을 보장합니다. 또한 손잡이를 설치하여 전면 도어를 쉽고 정확하게 조작 할 수 있습니다. 작업 중 안정성을 높이기 위해 프로토타입 하단에 4개의 고무 풋 패드를 부착합니다.
Dulbecco의 변형 된 독수리 배지에서 HeLa 세포주를 배양하십시오 10 %의 태아 소 혈청과 1 %의 겐타 마이신으로 저혈당. 배양 플라스크를 5%의 이산화탄소와 섭씨 37도에 보관하십시오. 80-90%의 합류점에 도달할 때까지 세포 배양을 관리하고 검사합니다.
파종 과정으로 세포 생존 프로토콜을 시작하십시오. 플라스크로부터 배지를 컨플루언트 HeLa 세포 배양물로 제거한다. 플라스크를 인산염 완충 식염수, PBS로 세척하고 강조 표시된 세부 사항에 따라 트립신으로 배양물을 분리합니다.
혈구 측정기로 재현탁 세포를 세고 웰 당 20, 000 세포 농도의 멀티 웰 마이크로 플레이트에 시드하십시오. 어둡고 밝은 치료 조건을 위해 두 개의 플레이트를 준비하고 세포 부착을 위해 24 시간 동안 배양합니다. 광감작제로 치료를 진행하려면 양쪽 플레이트에서 배지를 제거하고 100 마이크로 리터의 증가 된 농도의 Verteporfin으로 세포를 처리하십시오.
Verteporfin 내재화를 허용하기 위해 세포를 24 시간 동안 치료하십시오. 배양 후, 처리를 제거하고, PBS로 세포를 세척하고, 약물이 없는 배지를 첨가한다. 하나의 마이크로 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 빛에 노출되지 않도록 보호하고 24 시간 동안 배양하십시오.
이 마이크로플레이트는 PDT 결과의 추가 분석을 위한 대조 데이터를 제공합니다. 다른 마이크로 플레이트는 PhotoAct에서 광 노출 조건에 활용됩니다. 장비를 작동하려면 콘센트에 꽂고 전원을 켜고 전원 버튼을 누르십시오.
멀티웰 마이크로플레이트를 PDT 챔버에 놓고 전면 도어를 측면 벨크로 테이프로 고정하여 장비를 닫습니다. 장비를 설정하려면 전위차계를 사용하여 발광의 RGB 구성을 조정하십시오. 플러스/마이너스 터치패드를 눌러 시간 구성을 조정하고 분석 기간을 설정합니다.
분석에 대한 올바른 정보가 디스플레이에 표시되는지 확인하고 필요한 경우 최종 조정을 수행하십시오. 시작 터치패드를 눌러 분석을 시작합니다. 실험 시작시 한 번의 경고음 부저가 들려야합니다.
실험 중에 방사 조도 및 남은 시간과 같은 진행 정보를 디스플레이에서 관찰 할 수 있습니다. PDT 분석 중에 전면 도어를 열거나 구성을 변경하지 마십시오. 분석이 끝나면 4 번의 경고음 부저가 들리고 전자 시스템이 모든 LED를 끕니다.
완성 된 메시지와 실험 중에 확장 된 최종 에너지 양을 디스플레이에서 관찰 할 수 있습니다. 플루언스 최종 값은 강조 표시된 방정식에 따라 계산됩니다. 광에 노출된 마이크로플레이트를 덮고 24시간 배양을 진행한다.
배양 기간 후, 양쪽 플레이트로부터 배지를 제거하고, 세포의 단층을 PBS로 세척하고, MTT 용액을 첨가한다. 포르마잔 결정 형성을 허용하기 위해 4시간 동안 두 플레이트의 어두운 상태와 밝은 조건에서 배양합니다. MTT 용액을 조심스럽게 제거하고 DMSO 및 에탄올 용액으로 보라색 결정을 용해시킵니다.
결정 용해가 완료된 후, 595 나노미터에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도 측정을 수행한다. 최종 제품은 가시 광선의 뚜렷한 스펙트럼을 방출하도록 프로그래밍 된 30 개의 산란 된 발광 다이오드, LED 세트가 장착 된 상부 내부 표면이있는 어두운 챔버로 구성됩니다. 내부 표면의 낮은 반사율과 LED 구성의 균일한 분포로 인해 균일한 광 입사율이 설정됩니다.
설정 인터페이스는 사용자 친화적이며 정착된 실험 조건을 재현할 수 있었습니다. 개념 증명으로 이 장치를 사용하여 광 노출 후 2D HeLa 세포 배양에서 Verteporfin의 세포독성 효과를 향상시켰습니다. 도면에 나타낸 바와 같이, GI50 값은 조명 조건에 대해 3.1 마이크로몰이었다.
및 어두운 조건에 대한 13.8 마이크로 몰 따라서 조건을 비교하여 효율이 4 배 이상 증가하면 Verteporfin을 감광제로 사용하고 PDT 분석에 대한 PhotoAct의 적용 가능성을 확인할 수 있습니다. 이 작업에 설명 된 프로토 타입의 사용을 검증하기 위해 상용 PDT 장치를 광감작제, 세포 및 플루 언스를 포함한 동일한 실험 조건에서 사용하고 결과를 비교했습니다. 그림에서 볼 수 있듯이 두 장치 모두 Verteporfin을 똑같이 광활성화하여 세포 독성 효과를 향상시킵니다.
마지막으로, 광 노출 후 Verteporfin에 의해 유발 된 ROS 매개 세포 사멸을 DCFDA 분석을 사용한 유세포 분석에 의해 확인했다. 요약하면, 이 장치는 총 비용이 50 미만인 상업적으로 이용 가능한 저비용 부품으로 쉽게 제작되었습니다. 이 장치의 주요 다른 장점은 휴대성, 낮은 유지 보수 수요, 여러 유형의 배양 플레이트를 조사할 수 있는 용량, 분석당 최대 4개의 장치를 동시에 사용하는 것, 정확하고 재현 가능한 조사, 컴퓨터 또는 다른 기계에 연결할 필요가 없는 사용자 친화적이고 간단한 설정 인터페이스 등입니다.
또한 의사 결정 흐름도를 제공하여 작업 중 문제 또는 오류를 찾아 수정하기위한 체계적인 문제 해결 접근 방식을 제공합니다. 이러한 발견을 통해 PDT를 과학 연구로 촉진하기 위해 PhotoAct의 이점을 확장하여 감광제의 작용 메커니즘과 임상 적용을 탐구 할 수 있습니다.
