로즈 벵골 매개 광역학 치료 칸 디다 알비칸을 억제하기 위해

이 연구는 다양한 미생물과 세포에 대한 다양한 광역학 효과를 조사하는 간단하고 다재다능하며 쉬운 시스템입니다. 이 시스템에서 LED는 실험 설계에 따라 다른 배열로 적합할 수 있습니다. PDT의 상이한 조건은 하나의 실험에서 96-웰 플레이트 또는 심지어 384-웰 플레이트에서 계산될 수 있다.

이 기술은 곰팡이 각막염을 치료하는 데 사용될 수 있기 때문에 전 세계적으로 약 150, 000 명의 사람들이 집중적 인 치료에도 불구하고 눈을 잃습니다. 시작하려면 LED 스트립에서 네 개의 녹색 LED를 잘라 96웰 플레이트의 세 웰에 맞춥니다. 광 전력계로 540나노미터에서 LED의 플루언스 속도를 측정합니다.

조사 중에 플레이트와 함께 조립 된 전기 팬으로 섭씨 25도에서 일정한 온도를 유지하십시오. 멸균 루프를 사용하여 한천 플레이트에서 칸디다 알비 칸의 단일 식민지를 골라 YPD 배지 세 밀리리터가 들어있는 멸균 된 유리 튜브에 추가하십시오. 튜브를 섭씨 25도에서 14 내지 16시간 동안 155 RPM의 회전 속도로 배양하여 효모 배양물을 성장시킨다.

다음으로 YPD 배지로 밤새 배양물을 0.5의 OD600 값으로 희석한다. 섭씨 30도에서 네 시간 동안 155RPM으로 회전하여 인큐베이션하여 로그 성장 단계를 달성하십시오. 로그상 배양물을 신선한 YPD 배지로 희석하여 OD600 값이 0.65로 반복하여, 밀리리터 당 대략 1회 내지 7번째 콜로니 형성 단위를 10회 수득한다.

동시에 1X PBS에서 장미 벵골의 4% 원액을 제조한다. 필터는 0.22 마이크로미터 필터로 멸균됩니다. 111 마이크로리터의 2% 로즈 벵골 용액을 1밀리리터의 로그 상 배양에 첨가하고, 실온에서 상이한 시점에서 공동 배양하여 세포 내의 RB의 흡수를 이해한다.

실온에서 2 1/2분 동안 16, 100배 G에서 원심분리하고, 공동 배양물을 1X PBS 1 밀리리터로 세 번 세척하였다. 세척 후, 칸디다 알비칸스 배양물을 1X PBS의 1 밀리리터에 재현탁시킨다. 각 조건에 대해 배양물을 96웰 플레이트의 세 개의 다른 웰에 분배하십시오.

웰을 LED 어레이에 맞춥니다. 조명에 노출된 그룹에서는 선풍기와 조명을 켭니다. 조사 후, 하나의 웰로부터 20 마이크로리터의 공동배양 용액을 취하고, 이를 1X PBS의 180 마이크로리터를 함유하는 튜브에 첨가함으로써 10배 연속 희석을 두 번 수행한다.

그 다음 각 직렬 희석액의 20 마이크로리터를 YPD 한천 플레이트의 한 사분면에 떨어뜨려 플레이트 상에 계수가능한 콜로니를 얻었다. 형광 현미경 검사는 적색 형광 하에서 장미 벵골로 칸디다 알비 칸을 즉시 염색하는 것으로 나타났습니다. 15분간의 인큐베이션 후에, 대부분의 세포는 장미 벵골로 염색되었고, 이는 그것이 시간 의존적인 방식으로 세포에 진입한다는 것을 나타낸다.

또한, 빛으로 장미 벵골의 활성화는 세포 내에서 자유 라디칼과 일중항 산소를 생성하여 세포 사멸을 초래합니다. 장미 벵골 또는 조사가없는 경우, 세포 사멸은 관찰되지 않았다. 칸디다 알비칸스는 0.2%로즈 벵골의 존재하에 녹색 광 조사 후 광량 의존적 방식으로 억제되었다.

먼저 96웰 플레이트를 LED의 중심과 정렬해야 합니다. 둘째, 사용된 한천 플레이트는 별도의 콜로니의 혼합을 방지하기 위해 철저하게 건조되어야 한다. 플레이트에서 자란 칸디다 알비칸은 PDT가 세포의 유전자 발현에 어떻게 영향을 미치는지 대답 할 수있는 유전자 분석을 위해 추가로 보낼 수 있습니다.

이러한 기술은 쉽고 저렴하며 다재다능한 플랫폼을 통해 암세포, 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스와 같은 다양한 세포 유형에서 PDT가 어떻게 작동하는지 조사하는 길을 열어줍니다.