고순도 색소 소구의 분리는 그들의 연구에 매우 중요합니다. 다운스트림 생화학적 조사를 용이하게 하는 신속하고 효과적인 분리 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 이 방법의 주요 이점은 절차의 상대적 속도와 수많은 식물 종 및 환경 조건에 대한 적응성입니다.
틸라코이드 재현탁액을 초음파 처리하는 동안 틸라코이드에서 플라스토글로불을 제거하고 이후 자당 구배에서 플라스토글로불을 추출할 수 있는 충분한 힘을 보장하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사후 연구원 인 Elsinraju Devadasu 박사와 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Febri Susanto입니다. V5 성장 단계와 약 120g의 무게를 가진 6 개의 건강한 옥수수의 3 주 된 묘목을 구입하는 것으로 시작하십시오.
줄기 바닥에있는 모든 잎을 잘라 내고 차가운 방으로 옮기기 전에 얼음 욕조에 빠르게 담그십시오. 녹색 안전 램프 아래에서 작업하면서 얼음 욕조에서 옥수수 잎을 제거하고 가위를 사용하여 더 작은 5x5cm 조각으로 자릅니다. 절단 된 잎 조직의 절반을 350ml의 분쇄 완충액에서 상업용 블렌더에서 7보다 낮은 수준으로 부드럽고 철저하게 분쇄합니다.
블렌더를 5-6 번 시작하고 중지하여 모든 잎이 잘리도록하십시오. 큰 깔때기에있는 25 미크론 나일론 천의 한 층을 통해 균질 액을 4 개의 250 밀리리터 원심 분리기 병으로 여과합니다. 남은 잘린 잎 조직으로 블렌딩 단계를 반복한 후 여액을 4개의 병 사이에 고르게 나눕니다.
잎 여과액의 분취량을 제거하고 대표적인 총 잎 샘플로 저장하기 위해 따로 보관합니다. 다음으로, 여과액을 섭씨 1, 840 G 및 섭씨 4도에서 6분 동안 원심분리한다. 생성 된 상청액을 붓고, 브러시의 부드러운 소용돌이 움직임으로 0.2 몰 자당을 함유 한 12 밀리리터의 매체 R 0.2에 펠릿을 다시 현탁시킨다.
펠릿을 한 병에 다시 현탁시킨 후 현탁액을 다음 병에 추가하고 재현탁을 반복하여 현탁액을 한 병에 모읍니다. 풀링된 현탁액을 6개의 3밀리리터 초원심분리기 튜브 사이에 분배하여 각 튜브에서 최대 부피 2.5ml에 도달합니다. 그런 다음 100%의 진폭에서 팁 초음파 처리기를 사용하여 각 튜브를 각각 10초 동안 4번 초음파 처리합니다.
거품을 방지하기 위해 초음파 처리기 혼을 물에 잠기고 액체 표면에서 멀리 두십시오. 각 라운드 동안 서스펜션 내에서 초음파 처리기 혼을 위아래로 천천히 움직입니다. 4 개의 튜브를 번갈아 가며 각 초음파 처리 후 각 튜브를 얼음 양동이에 다시 넣어 샘플을 식히십시오.
완료되면 초음파 처리 된 조 틸라코이드 현탁액을 섭씨 4도에서 30 분 동안 150, 000G에서 원심 분리합니다. 주사기 및 22 게이지 바늘을 사용하여 쿠션 표면을 탈지하고, 생성된 황색 및 유성 플로팅 패드를 수크로스 쿠션으로부터 조잡한 플라스토글로불로 수확한다. 각 튜브에서 약 500 마이크로 리터를 회수하여 2.0 밀리리터 튜브에 넣습니다.
plastoglobules의 초음파 처리 및 방출 전후에 조잡한 틸라코이드 분취량을 수집하십시오. 완료되면 식물 조직 처리를 계속하거나 조 플라스토글로블을 섭씨 영하 80도에서 보관하고 나중에 정제합니다. 고정상에 도달하기 위해 BG11 배지에서 50 밀리리터의 synechocystis 종 PCC 6802 배양액을 7-10 일 동안 성장시킵니다.
분광 광도계를 사용하여 셀 밀도를 750 나노 미터에서 2.0의 광학 밀도로 조정합니다. 다당류를 제거하기 위해, 배양물 50 밀리리터를 원심분리하고 상청액을 제거한다. 50 밀리리터의 완충액 A에서 세포를 2 회 반복한다.
세척된 펠릿을 25 밀리리터의 완충액 A에 재현탁시키고, 1, 100 파운드 제곱인치의 프렌치 압력 셀을 사용하여 세포를 분해한다. 백색광 아래에서 용해 된 색상이 녹색에서 빨간색, 파란색, 녹색으로 바뀔 때까지 추운 조건에서 이 과정을 세 번 반복합니다. 세포 균질액의 분취량을 제거하고 대표 전체 세포 샘플로서 저장되도록 따로 보관한다.
생성 된 균질 액을 각 튜브에 최대 2.5 밀리리터로 채워진 8 개의 3 밀리리터 초 원심 분리 튜브에 분배하십시오. 이 균질액을 400마이크로리터의 배지 R과 오버레이하여 스텝 그래디언트를 생성합니다. 튜브를 원심분리하기 전에 필요에 따라 매체 R을 추가하여 튜브의 균형을 조심스럽게 잡습니다.
틸라코이드 및 폴리 하이드 록시 알카 노 에이트 체를 포함한 다른 무거운 세포 기관은 펠릿 형성을 나타내는 반면, 플라 스토 글로불은 자당 구배의 상단 또는 그 근처에서 노란색 유성 패드를 형성합니다. 앞에서 설명한 것처럼 주사기로 원유 플라스토글로불의 플로팅 패드를 수확하고 수확물을 2 밀리리터 튜브에 넣습니다. 필요한 경우 바늘 끝으로 초원심분리기 튜브 벽의 측면에서 플라스토글로블을 긁어냅니다.
시아노박테리아 가공을 계속하거나 미정제된 플라스토글로블을 섭씨 영하 80도에서 보관하고 나중에 정제하십시오. 식물 조직 처리 방법을 사용하여 순수한 플라스토글로불을 수확하기 위해, 500 마이크로리터의 미정제 플라스토글로불, 400 마이크로리터의 배지 R0.2 및 400 마이크로리터의 배지 R을 사용하여 앞서 기술한 슈크로스 구배를 제조하고, 원심분리 후, 생성된 순수 플라스토글로불의 플로팅 패드를 2밀리리터 튜브로 수확한다. 순수한 플라스토글로불을 분취한 후 액체 질소에서 분취량을 급속 냉동한 후 섭씨 영하 80도에서 보관하거나 건조 분말로 동결건조합니다.
시아 노 박테리아로부터 순수한 플라 스토 글로 불 (plastoglobules)을 수확하기 위해, 500 마이크로 리터의 원유 플라스토 글로불, 750 마이크로 리터의 배지 R 0.7 및 750 마이크로 리터의 배지 R 0.2를 사용하여 앞서 언급 한 바와 같이 자당 구배를 생성한다. 원심분리 후, 1.5 밀리리터 튜브에서 순수한 플라스토 글로블을 수집하고 순수한 플라스토 글로블을 분취한다. 완료되면 순수한 플라스토글로불 분취량을 액체 질소에 급속 냉동하고 섭씨 영하 80도에서 직접 보관하거나 건조 분말로 동결건조합니다.
이 방법에서, 상당한 양의 플라스토글로불 또는 지질 액적 물질이 슈크로스 쿠션의 최상층에 부유하는 것을 볼 수 있었다. 후속 원심분리 후, 정제된 플라스토글로불은 슈크로스 구배의 표면 또는 그 근처에서 수득되었다. 플라스토글로불의 성공적인 분리 후, 애기장대 탈리아나 피브릴린 1a 및 애기장대 탈리아나 광계 II 서브유닛 D1에 대해 제기된 항체를 사용하여 순도 평가를 위해 개발된 면역블롯은 피브릴린 동족체가 플라스토글로불보다 주로 틸라코이드와 관련이 있음을 보여주었습니다.
플로팅 패드의 효율적이고 집중된 추출을 보장하려면 완전히 잠긴 상태에서 주사기 바늘 오리피스를 버퍼의 액체 표면 바로 아래에 놓은 다음 부드럽게 위로 당깁니다. 분리된 플라스토글로불 샘플은 후속 단백질체학 또는 지질체 연구에 적합하며 다양한 환경 조건에서 표적화된 단백질-지질 조성의 변화를 입증하는 데 사용되었습니다. 이 기술은 후속 생화학 적 조사를 통해 관련 단백질 키나아제 활성의 발견 및 올리고머 단백질 복합체의 존재를 포함하여 플라스토글로불에 대한 새로운 연구를 촉진했습니다.
