이 프로토콜은 오래된 기술에 대한 새로운 방법을 제공하며 많은 수의 기초 과학 연구자에게 새로운 접근 법을 제공 할 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 비용 효율적인 자연뿐만 아니라 더 넓은 과학적 청중이 사용하는 적응성입니다. 마이그레이션 플레이트를 준비하려면 밝은 색상의 영구 마커를 사용하여 48 웰 플레이트의 각 웰 뒤쪽 의 중심아래로 선을 그리고 세 개의 해시 마크를 그려 각 것을 관심 있는 세 가지 영역으로 나눕니다.
그런 다음 각 우물로 1.5~2회 10회 심장 섬유아세포를 플레이트하고 정상 배양 조건하에서 세포를 배양하여 90~95%의 합류에 도달할 때까지 24~48시간 동안 세포를 배양한다. 세포가 준비되면 각 우물에서 상체를 제거하고 멸균 P200 파이펫 팁을 사용하여 그려진 선을 따라 한 번의 패스 스크래치를 만듭니다. 낮은 혈청 배지로 우물을 헹구어 부착되지 않은 심장 섬유아세포를 제거하고 각 우물에 500 마이크로리터를 추가합니다.
약리학 에이전트가 사용되고 있는 경우에, 적당한 우물에 에이전트를 추가합니다. 다음으로, 20배 의 목표를 가진 반전된 현미경을 사용하여 마킹을 사용하여 각 우물을 배치하여 긁힌 라인의 상단 절반의 이미징을 허용하도록 잘 사용하여 두 개의 0시간 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 플레이트를 이동하여 긁힌 선의 하반부 반쪽을 두 번째 이미지를 수집하고 24시간 동안 세포 배양 배양배인 배양에 플레이트를 배치하도록 한다.
인큐베이션이 끝나면 비멸 PVS로 각각 잘 씻고 연기 후드에 각각 4%의 파라포름알데히드500마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 10분 후, 신선한 PBS로 3회 간 세척시 5분간 씻습니다. 마지막 세척 후, 잘 당 300 마이크로 리터의 투과및 실온에서 30 분 동안 부드러운 흔들림으로 세포를 투약화하십시오.
인큐베이션이 끝나면 퍼메라빌리징 용액을 1%의 쿠마시 브릴리언트 블루 스테인으로 10분간 바양하여 실온에서 부드러운 흔들림을 연출합니다. 그 다음에는 PBS에서 3분, 5분 동안 흔들림이 뒤따랐습니다. 마지막 세척 후, 각 웰에 PBS의 300 마이크로 리터를 추가하고 신중하게 당 두 개의 24 시간 이미지를 캡처하기 전에 제로 시간 이미지와 동일한 위치에 플레이트를 배치뿐만 아니라 시연.
실험이 끝나면 이미지와 적절한 이미징 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 0시간 이미지에 새 레이어를 만듭니다. 두 번 클릭하여 새 레이어 선 레이어의 이름을 변경하고 브러시 도구를 선택합니다. 픽셀 크기를 10으로 변경하고 색상을 빨간색으로 변경하고 두 개의 별도 선을 그려 스크래치를 설명합니다.
선은 셀을 만지지 않아야 합니다. 이미징 소프트웨어에서 24시간 이미지를 열고 이동 도구를 선택합니다. 컨트롤 버튼을 누르고 선과 배경 레이어를 모두 클릭하고 0시간 이미지의 가운데를 클릭하고 두 레이어를 24시간 이미지 의 중간으로 드래그합니다.
24시간 이미지에서 0시간 배경 레이어를 클릭하고 불투명도를 제어 버튼을 50%로 변경하고, 0시간 배경과 선 레이어를 클릭하고 편집 및 무료 변환을 클릭하여 자유로운 변환을 사용하여 레이어를 자유롭게 변환하고, 24시간 배경 이미지에 제로 시간 배경 및 선 이미지를 정렬하여 영역 마이그레이션 라인이 24시간 이미지에 올바르게 배치되도록 합니다. 선 레이어가 성공적으로 오버레이된 경우 마우스 오른쪽 단추를 클릭하여 0시간 배경 레이어를 삭제합니다. 나머지 줄 레이어를 사용하여 24시간 동안 스크래치 영역으로 마이그레이션된 셀 수를 확인할 수 있습니다.
그런 다음 새 마이그레이션 이미지를 포토샵과 TIFF 또는 JPEG 파일로 저장합니다. 마이그레이션 셀 수를 정량화하려면 마이그레이션 이미지와 TIFF 또는 JPEG 파일을 수락하는 프로그램을 열고 각 이미지에 대해 두 개의 빨간색 선에 대해 두 개의 빨간색 선을 수동으로 터치하는 셀 수를 계산합니다. 그런 다음 이미지당 마이그레이션 셀 수를 기록합니다.
마이그레이션 영역을 확인하려면 이미징 소프트웨어의 마이그레이션 선이 포함된 24시간 이미지를 열고 이미지를 마이그레이션 영역 이미지로 저장합니다. 저장한 후 백그라운드 레이어를 클릭하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하여 레이어를 삭제합니다. 브러시 도구를 사용하여 선과 클릭 이미지, 모드 및 회색 배율에 사용된 것과 동일한 색상으로 스크래치 선 사이의 영역을 채우고 이미지를 흑백으로 변경합니다.
이미지를 저장하고 마이그레이션 영역 이미지와 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 엽니다. 편집을 클릭하고 반전합니다. 마이그레이션 줄의 영역을 확인하려면 이미지를 클릭하고 조정하고 임계값을 설정합니다.
검은색 마이그레이션 영역은 빨간색으로 바뀌고 백분율 영역은 임계값 상자에 표시됩니다. 그런 다음 마이그레이션 줄에 대한 백분율 영역을 기록하고 이 값이 동일한 이미지에 대한 마이그레이션 셀 수와 결합되어 있는지 확인합니다. 이 분석에서는, 비 당뇨병 심혼에서 46의 섬유아세포 및 당뇨병 심혼에서 129의 섬유아세포는 24 시간 실험 기간 도중 이주했습니다.
입증된 바와 같이 이동 영역의 측정은, 비당뇨병 스크래치 영역이 측정된 총 면적의 24.78%를 차지하는 반면, 당뇨병 이주 스크래치 영역은 측정된 전체 면적의 16.77%를 차지하는 것으로 나타났다. 마이그레이션 영역으로 정규화하면 세포 마이그레이션에 대한 더 나은 엄격한 평가를 제공하고 잠재적인 인적 오류를 무효화합니다. 예를 들어, 마이그레이션된 섬유아세포 의 수만 비교되는 경우, 이 분석에서 이 우물에서 마이그레이션된 세포의 수가 두 번째 우물에서 마이그레이션된 셀의 두 배였다는 것이 이 분석에 나타납니다.
그러나, 스크래치 영역이 데이터를 정상화하는 데 사용되었을 때, 이주 부위에 대한 섬유아세포의 비율은 두 우물 모두에서 거의 동일하도록 관찰되었다. 0시간 이미지에서 캡처한 대로 24시간 이미지에서 마이그레이션 영역을 다시 캡처해야 합니다. 이 절차에 따라, 면역 조직 화학은 세포 내의 단백질 발현을 검사하기 위해 수행 될 수있다.
우리는 스크래치 마이그레이션 분석에 이 새로운 접근이 이전에 사용할 수 없었던 과학 연구의 더 많은 길을 열어 줄 것이라고 믿습니다.
