여기에서, 묘목에서 Phytophthora nicotianae 저항성에 대한 담배 유전자형의 효율적이고 정확한 스크리닝을위한 프로토콜이 제시됩니다. 그것은 분자 메커니즘 연구뿐만 아니라 정밀 번식에도 실용적입니다. 자료. 담배 품종 Beinhart1000-1, Beinhart1000 BH 및 Xiaohuangjin1025 XHJ를 중국 담배 생식 생물 자원의 국가 중기 제네백에서 얻으십시오.
BH는 내성이 있는 반면, XHJ는 피토프토라 니코티아나 감염에 취약하다. Phytophthora nicotianae 저항성 평가를위한 담배 유전자형 심기. 담배 씨앗을 질석과 섞어서 살균 된 화분 토양에 부드럽게 씨앗을 방송하십시오.
냄비를 성장 챔버에 넣으십시오. 16 시간의 빛 / 8 시간의 어두운 사진 기간 동안 섭씨 25 도의 일정한 온도를 유지하십시오. 트레이와 폼 시트가있는 수경 재배 장치를 준비하십시오.
씨앗이 발아 한 후, 화분 토양에서 묘목을 찌른다. 멸균 탈이온수로 뿌리를 부드럽게 씻고 수경 장치에 이식하십시오. 장치를 섭씨 25도의 기후 챔버에 놓고 6 시간 빛 / 여덟 시간의 어두운 사진 기간 동안 24 시간 동안 보관하십시오.
Hoagland 영양 용액을 미리 준비하십시오. Hoagland 영양 용액으로 수경 재배 장치에 묘목을 이식하십시오. 장치를 섭씨 25도의 기후 챔버에 16 시간 빛 / 8 시간의 어두운 사진 기간 동안 2 주 동안 두십시오.
Phytophthora nicotianae zoospore suspension의 제조. 오트밀 한천 배지의 제조. 33 그램의 오트밀을 속이 빈 그릇에 넣고 1, 000 밀리리터의 멸균수를 넣으십시오.
전자기 오븐에 끓입니다. 오트밀이 끈적 거리면 멸균 거즈 조각을 통해 액체를 변형시킵니다. 액체를 1, 000 밀리리터 점진적 실린더에 붓고 멸균수로 부피를 1, 000 밀리리터로 조정하십시오.
액체를 유리 시약 병에 붓고 18 그램의 한천을 넣으십시오. 잘 흔들어 혼합물 오트밀 한천 배지를 섭씨 121도에서 15분 동안 오토클레이브한다. 실온에서 30 분 동안 그대로 두십시오.
약 20 밀리리터의 멸균 된 오트밀 한천 배지를 각 페트리 접시에 붓습니다. 균사 재배 전에 페트리 접시를 실온에서 완전히 식히십시오. 균사체 재배.
직경 1cm의 펀치와 이쑤시개를 섭씨 121도의 오토클레이브에서 15분 동안 오토클레이빙하여 미리 준비합니다. Phytophthora nicotianae 균사 한천 문화에 구멍을 뚫어 둥근 균사 매트를 만듭니다. 균사 매트를 골라 오트밀 한천 배지에 균사체 측면을 내려 놓고 14 일 동안 어둠 속에서 섭씨 25도에서 균사체를 배양하십시오.
Phytophthora nicotianae zoospore suspension의 제조. 각 균사체 재배에 0.1% 질산칼륨 용액을 접시당 15밀리리터씩 첨가한 다음, 섭씨 4도에서 20분간 배양하여 스포란지움을 유도하였다. 동물원 포자를 방출하기 위해 접시를 섭씨 25도에서 25 분 동안 유지하십시오.
동물원 포자 현탁액을 비이커에 수집하고 현미경 및 혈구계로 동물원 포자 농도를 측정하십시오. 멸균 된 물로 밀리리터 당 네 번째 동물원 포자에 동물원 포자 농도를 10 배로 조정하십시오. 질병 저항성 담배 품종의 확인.
Hoagland 영양 용액에서 묘목을 가져 와서 Phytophthora nicotianae zoospore 현탁액 20 밀리리터에 뿌리를 섭씨 25도에서 90 밀리미터의 페트리 접시에 담그고 어둠 속에서 3 시간 동안 접종하십시오. 예방 접종 후, 담배 묘목을 10 밀리리터의 멸균수로 새로운 페트리 요리에 넣고 뿌리를 담그십시오. 두 장의 여과지로 덮어서 뿌리를 촉촉하게 유지하십시오.
접시를 섭씨 25도 16 시간 빛 / 8 시간의 어두운 사진 촬영 기간에 보관하십시오. 이삼 일 후에 질병의 중증도를 관찰하십시오. 제어 처리를 위해 담배 묘목을 10 밀리리터의 멸균 수로 페트리 접시에 직접 넣고 뿌리를 담그고 뿌리를 여과지 두 조각으로 덮으십시오.
Phytophthora nicotianae 감염의 평가. 접종 후 사흘에서 오일 사이에 질병 중증도를 평가합니다. 중국 국가 표준에 따라 개별 식물 질병 심각도를 0에서 아홉 개까지의 척도로 채점하십시오.
등급 0은 전체 식물에 증상이 없음을 의미합니다. 1등급은 줄기 둘레의 1/3 미만 또는 시들게 하는 잎의 1/3 미만의 줄기 병변을 의미합니다. 3 등급은 줄기 둘레의 1/3과 1/2 사이 또는 잎의 1/3과 1/2 사이의 줄기 병변을 약간 시들게합니다.
5 등급은 줄기 둘레의 1/2보다 큰 줄기 병변을 의미하지만 둘레 주위 또는 잎의 1/2와 2/3 사이가 시들지는 않습니다. 7 등급은 전체 줄기 둘레 또는 시들게하는 잎의 2/3 이상 주위의 줄기 병변을 의미합니다. 9 학년은 식물이 죽은 것처럼 보인다는 것을 의미합니다.
다음 공식을 사용하여 질병 지수를 계산하십시오. 질병 중증도는 여섯 등급으로 나뉘어졌다. 대표적인 결과.
내성 품종 BH 및 감수성 품종 XHJ의 사주령 식물은 이 기사에 제시된 방법을 사용하여 Phytophthora nicotianae에 도전하였다. 접종 후 사흘 후, XHJ에서는 줄기 둘레의 약 1/2를 덮고 잎의 1/2을 약간 시들게했습니다. 내성 다양성 BH에서는, 어떠한 증상도 관찰되지 않았다.
접종 후 나흘 후, XHJ에서 잎 시들음과 심한 줄기 병변이 발생했지만 이러한 증상은 접종 후 오일 BH.At 에는 나타나지 않았지만 개별 식물 질병 중증도는 담배 질병 및 곤충 해충의 등급 및 조사 방법에 대한 중국 국가 표준을 기반으로 기록되고 계산되었습니다. BH의 평균 질병 지수는 6.48이었으며, 이는 표준에 따른 내성 R을 나타내고, XHJ의 평균 질병 지수는 76.85였으며, 이는 표준에 따른 감수성 S를 나타낸다. 접종 효율을 확인하기 위해, 상대적 병원체 바이오매스를 실시간 PCR로 정량화하였다.
실시간 PCR의 결과는 표현형 관찰을 확인한다. BH와 XHJ 사이의 교차의 BC4 F2 집단으로부터의 5개의 자손, 두 개의 중간 내성 품종, K326 및 Yunyan87은 동물원 포자 현탁 접종법 및 귀리 곡물 접종 방법에 의해 평가되었다. 동물원 포자 현탁법은 작은 묘목에 대해 수행되었고, 귀리 곡물 접종 방법은 성인 식물에 대해 수행되었다.
BC4 F2 집단의 5 자손의 경우, 질병 지수는 동물원 포자 현탁 법에 의해 16.49에서 77.60까지의 범위였으며 귀리 곡물 방법에 의해 10.33에서 83.08 사이였습니다. 두 감염 방법 사이의 저항 분류는 대부분 서로 일치합니다. 두 가지 중간 저항 품종 K326과 Yunyan87을 사용하여 평가는 두 가지 방법 모두에서 내성을 나타 냈습니다.
이들 데이터는 서로 다른 성장 기간에 담배에 대해 수행되었음에도 불구하고 두 접종 방법 사이의 상관관계를 예시한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 P.nicotianae 묘목 단계에 의한 감염에 대한 담배의 내성을 평가하는 효율적이고 신뢰할 수있는 방법입니다. 이 프로토콜은 귀리 곡물 방법이 성인 식물의 대규모 내성 스크리닝에 적용 가능하기 때문에 분자 메커니즘 연구뿐만 아니라 육종에도 실용적입니다.
이 두 가지 방법은 보완적인 방법을 사용할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.
