Name: advanced animal model of colorectal metastasis in liver: imaging techniques and properties of metastatic clones
Uploaded: 2016-11-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones at JoVE.com

우리는 Luc2-tdTomato 플라스미드와 HCT116 세포주의 도움 씨 애니 Solanki (동물 자원 센터) 쥐 관리, 박사 라라 레오니 박사 제프리 L. 그린 (시카고 대학)에 감사드립니다 DLIT와. 형광 및 발광 강도의 정량화는 IVIS 스펙트럼에 시카고 대학 (퍼킨 엘머, 홉 킨톤, MA)에 통합 작은 동물 영상 연구 자원에서 수행되었다. 이 작품은 암 연구를위한 버지니아와 DK 루드비히 기금에 의해 지원되었다, 폐 암 연구 재단 (LCRF), 전립선 암 재단 (PCF) 및 암 센터 지원 그랜트 (P30CA014599). 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비에 아무런 역할을하지 않았다.

모든 동물의 절차는 시카고 대학 (프로토콜 # 72213-09)에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 무균 조건 하에서 수행 하였다. 1. 준비 <ol><li> 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린 및 100mg / ml 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) : 500 HCT116 종양 세포의 배양을위한 배지의 용액을 만든다. </li><li> 20 분 동안 251 ° F에서 4 수술 타월, 거즈, 두 개의 작은 Adson 픽업, 바늘 구동부 위 두 쌍 작은 클램프 3 microclips - 악기 3 등 비장 주입 모델에 사용되는 오토 클레이브 . </li><li> , 마우스에 대한 수술 후 마취를 준비 비장 주입 다음 피하 투여 할 수 있습니다. 마우스 당 0.9 생리 식염수 500 μL에 부 프레 노르 핀의 4 μg의 - 2 희석. </li><li> 복강 내 주사 지속 시간에 대한 반디 루시페린의 150 μg의 / 150 μL의 분취 량을 준비생물 발광 분석을 보내고. -20 ° C에서 보관하고 빛으로부터 보호합니다. </li></ol> 루시 페라 제 / tdTomato 표지 단일 클론 셀 라인 10, 11를의 2 세대 <ol><li> 해동 HCT116 인간 대장 암 세포를 10 % FBS, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신을 가진 DMEM에서 293FT 인간 배아 신장 세포를 유지한다. 5 % CO 2, 37 ℃에서 문화를 유지한다. </li><li> 높은 역가의 렌티 바이러스를 생성합니다. <ol><li> 12 × 106 293FT 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 완전 DMEM 18 ㎖ (cDMEM)에서 15cm 세포 배양 접시에서 통로 (3) 및 (10) 사이에서 세포, 1 % 비 필수 아미노산 - D 1 플레이트 (10) . 37 ° C에서 품어 5 % CO 2. </li><li> 이 D에서 다음 형질 감염 용액을 사용하여 세포를 형질 감염 : <ol><li> 각각의 접시를 들어, 다음을 사용하십시오 루시 페라 제 (Luc2) 및 tdTomato 삽입 pFUG의 렌티 바이러스 벡터의 37.5 μg의의 DNA 혼합물멸균 H 2 O의 1062 μL의 총에 재현 탁 (11) (시카고 대학에서 박사 제프리 그린의 선물), pCMVΔ8.74 25 μg의, 그리고 pMD2.G의 12.5 μg의를 구성 2 M CaCl2를 188 μL를 추가합니다. </li><li> 추가 1250 배 헤 페스 완충 식염수 (HBS, 50mM의 헤 페스, 1.5 밀리미터 나 2 HPO 4, 180 mM의 염화나트륨, pH를 7.12)를 DNA / CaCl2를 용액에 한 번에 한 방울의 μL 관통 기포 취입하면서 피펫으로 솔루션입니다. </li><li> 20 분 동안 실온에서 인큐베이션하고 25 μM의 최종 농도를 확인하기 위해 RT cDMEM 클로로퀸 및 15.5 mL를 첨가. </li></ol></li><li> 293FT 세포의 각 접시에 미디어를 기음과 형질 전환 솔루션으로 교체합니다. 도금 세포가 쉽게시키다로, 천천히 형질 용액 16 mL를 넣고. </li><li> D 3 일 후 8 - 다시, 타키 16 시간의 형질 감염 용액을 제거하고, 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)로 한번 세포를 씻어NG는 셀을 제거하지 않도록주의. 10 mM의 헤 페스 신선한 cDMEM 18 mL로 미디어를 교체합니다. 참고 천천히 요리 이동 형질 감염 용액을 흡인하고 세포 빠지지 않도록 플레이트의 측벽을 통해 미디어를 추가한다. </li><li> D (4)에 형질 감염 시점으로부터 48 시간에, 세포를 빠지지 않도록 천천히 피펫으로 흡인하여 접시에서 매체를 수집한다. 원심 분리기에서 5 분 동안 300 XG에 수집 된 미디어가 큰 세포 찌꺼기를 침전한다. </li><li> 사용하여 바이러스 상층 액을 필터 0.45 μm의 저 단백질 결합 50,000 XG, 4 ° C에서 2 시간 동안 SW-28 로터를 사용하여 필터 플라스크와 원심 분리기. 원심 분리 완료 후 즉시 상등액을 경사 분리하고 와이퍼와 상기 튜브의 내부를 건조. </li><li> 1 % FBS로 감소 세럼 중간 (RSM)의 50 μL의 바이러스 성 펠렛을 재현 탁. 분취 량은 나중에 사용하기 (바이러스 주)에 대한 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 렌티 바이러스를 형질 도입와 HCT116 세포로 ES는 tdTomato 양성 클론의 패널을 생성합니다. <ol><li> 바이러스 감염 전 1 1 × 105 웰 플레이트 (24) (D)의 밀도에 HCT116 세포 접시. </li><li> 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 8 μg의 / ML의 폴리 브렌과 : (100 희석 1) (cRSM) RSM의 4 mL에 (2.2.7)에서 재 부유 바이러스의 40 μL를 희석. </li><li> 감염의 날, DPBS 한 번 세포를 세척 한 다음 각 웰에 단계 2.3.2에서 희석 바이러스의 250 μL를 추가합니다. 각 웰에 cDMEM의 1 mL를 넣고 다음 37 ° C에서 4 시간 5 % CO 2 품어하고; 72 시간 - 48 CO 2를 37 ° C에서 품어 5 %. </li><li> 0.05 % 트립신 1 ㎖ 및 0.53 mM의 EDTA로 세포를 재현 탁하고 트립신 중화 cDMEM 1 mL를 넣어. 4 분 동안 300 XG에 microcentrifuge 관 및 펠릿에 세포를 전송합니다. 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 (HBSS) 플러스 2 % FBS 1 mL에 펠릿 배를 씻으십시오. </li><li> 단계 2.3.4에서 펠렛을 재현 탁1 × 106 세포 / ㎖에서 단일 세포 현탁액 FACS 완충액 (2 % FBCS 및 PBS 2 mM의 EDTA)와. </li><li> 정렬 PE 양성 세포 게이팅 셀 소터를 사용 tdTomato 양성 HCT116 세포 (여기 / 방출 : 585분의 556 ㎚). 부모 tdTomato 양성 HCT116 세포 (도 1A)을 생성하는 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 cm 접시에 수집 된 세포를 성장한다. </li><li> 0.05 % 트립신 8 mL의 3 0.53 mM의 EDTA와 2.3.6에서 부모 tdTomato 양성 HCT116 세포를 재현 탁 - 5 분 ​​후 트립신을 중화 8 mL의 cDMEM의 추가합니다. <ol><li> 4 분 동안 300 XG에 50 ML의 튜브 및 펠릿에 세포를 전송합니다. 상층 액을 제거하고 cDMEM (그림 1B) 200 μL 당 1 셀에 부모 tdTomato 양성 HCT116 세포를 희석. </li></ol></li><li> 5 % CO 2, 37 ° C (그림 1C)에서 96 웰 플레이트에 잘 당 하나의 셀 (희석 200 μL)를 플레이트. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 플라스크에서 개별 단일 클론 성장. (그림 1D). </li></ol></li></ol> 세포 수의 함수로서 형광 신호 강도 3. 교정 <ol><li> 10 3 0의 밀도 지금 HCT116-L2T이라 형질 HCT116 세포를 플레이트 (2) × 104 3 × 105, × 104 (5), 7 × 104, × 104 9 10 5 세포 / 웰의 각 밀도 삼중의 96 웰 플레이트. </li><li> 배양 5 시간 후, IVIS (10)를 사용하여 형광 강도를 tdTomato 정량화. <ol><li> 소프트웨어를 시작하려면 바탕 화면의 이미지 소프트웨어 아이콘을 클릭합니다. 이미징 시스템을 초기화하기 위해 &quot;초기화&quot;버튼을 클릭합니다. (몇 분 정도 소요) 초기화가 완료되면, &quot;형광&quot;, &quot;사초&quot;노출 시간, &quot;중간&quot;비닝 (binning), &quot;2&quot;F / 정지를 선택, &quot;535&quot;여기 필터,와 &quot;580&quot;방출 필터. </li><li> 이미징 스테이션의 96 웰 플레이트를 놓고 촬영을 시작합니다 &quot;획득&quot;을 클릭합니다. 이미지가 획득 한 후, 도구 팔레트에서 &quot;ROI 도구&quot;버튼을 클릭 슬릿 아이콘 12 × 8을 선택합니다. </li><li> 96 웰 플레이트의 이미지 신호의 영역을 커버하고 측정 탭을 클릭하여 12 × 8 슬릿을 만듭니다. 평방 cm 당 스테 라디안 당의 당 광자 단위로 투자 수익 (ROI) 측정 테이블과 창을 관찰 (광자 / S / SR / cm 2). </li></ol></li><li> 셀의 개수 및 신호 강도를 나타내는 함수 (Y 축)과 동일한 인수 (X 축)와 산점도를 구축. 형광 강도의 단위에 대응하는 세포의 양을 계산 (도 2) (10), 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 회귀 곡선을 계산한다. </li></ol> 간 전이 4. 동물 모델 <ol><li> HCT116-L2T 셀 (70)에 도달하면- 80 % 컨 플루는 비장 주입 약 1 시간 전을 준비합니다. 3 0.53 mM의 EDTA 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 해리 - 5 분 ​​후 cDMEM 동량로 중화. 응집을 방지하기 위해 철저하게 피펫해야합니다. </li><li> 자동 세포 계수기로 세포를 계산합니다. </li><li> 2 × 106 세포 / 100 μL - 1.2의 농도로 1X DPBS에서 세포를 재현 탁. 피펫과 응집을 방지하기 위해 철저하게 세포를 재현 탁해야합니다. </li><li> 때때로 튜브를 재현 탁, 사출까지 얼음에 세포를 유지합니다. </li><li> 생쥐를 마취에 앞서, 단계 13에 기재된 프레 놀핀 혼합물의 500 μL를 주입하여 피하로 수술 전 마취 루스 유체를 제공한다. 통증 (감소 이동성, 구부리고 키, 신랑 실패, 처리 발성)의 징후가 해결 될 때까지 하루에 두 번 추가 프레 노르 핀 혼합물의 동일한 용량을 관리 할 수 ​​있습니다. </li><li> 6 ~ 8 주 마취마취 실에서 산소의 2 % 이소 플루 란과 올드 여성 무 흉선 누드 마우스. 쥐가 꼬리를 곤란하게하여 마취하에 완전히 있는지 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. 비장 주입에 대한 개별 코 콘 각 마취 마우스를 전송합니다. 절개에 앞서, 각 마우스는 무균 수술 드레이프로 피복되어야한다. </li><li> 누드 마우스의 왼쪽 측면에 피부를 통해 외부에서 보이는 보라색 영역으로 비장을 확인합니다. 미세 절제 가위를 사용하여, 바로 비장 위의 피부 상에 8mm 왼쪽 측면 절개를합니다. <ol><li> 다음으로, 복부 벽에 들어 올려 작은 절개를합니다. 내부 장기를 절개 부위로부터 멀리 이동되도록 복강 내로 공기를 허용한다. 약 5 mm의 복벽 절개를 크게한다. </li><li> 부드럽게 면봉으로 절개 주위에 압력을 적용하여 비장을 노출. 필요한 경우, 췌장의 지방 부드럽게 사람이 될 수있다비장을 손상하지 않도록 노출에 도움이 ipulated. </li></ol></li><li> 천천히 노출 비장의 끝으로 27 G 바늘 1 ML의 주사기를 사용하여 세포의 100 μL를 주입. 여분 간 종양을 방지하기 위해, 60 초 - 30 이상에 걸쳐서 천천히 주입한다. </li><li> 종래 주입 세포 현탁액의 유출을 방지하기 위해, 사출의 끝에서 바늘을 제거하는 비장에 microclip 배치. </li><li> 5 분 동안 장소에 microclip를 남겨주세요. </li><li> 주 사후 5 분은 지혈을위한 휴대용 소작 장치를 사용하여 비장 절제술을 수행한다. 전방 측면에서 시작되는 지라 폐문을 해부하다. 대형 선박을 해부하면, 과도한 출혈을 방지하기 위해 소작을 이용하여, 인접하는 지방 조직과 혈관의 전방 측 미리 응집. 참고 : 지혈하는 방법 :가, 소작 직접 출혈 지점을 응고 3 출혈 지점에 압력을가 - 5 분, 또는 5-0 실크 넥타이 출혈 지점을 봉합-결찰. </li&gt; <li> 두 개의 층에 각 마우스의 측면 절개를 닫습니다. 첫째, 하나의 가로 스티치에서 5-0 흡수 꼰 봉합 (예를 들어, vicryl)와 복벽을 닫습니다. 다음에, 하나의 수평 스티치 다시 4-0 흡수성 필라멘트 봉합사 (예 prolene의)을 사용하여 피부를 닫는다. </li><li> 모든 절차 사이의 무균 상태를 유지하기 위해 70 % 이소프로판올을 분사하여 모든 악기를 청소합니다. 참고 : 그들이 마취에서 깨어있는 동안 동물이 따뜻하게되어 있는지 확인합니다. 그들은 외래되고 정상적인 활동으로 돌아갈 때까지 수술 후 모든 쥐를 모니터링합니다. 5 분 - 일반적으로, 회복 시간은 약 3이다. 그들은 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. </li></ol> 생체 발광 생물 이미징 5. <ol><li> 에 이미지를 수행주 단위로 측정하고 시간이 지남에 따라 생물 발광의 변화를 정량화한다. </li><li> 마취 챔버에 마우스를 놓고 산소의 2 % 이소 플루 란으로 그들을 마취. 쥐가 꼬리를 곤란하게하여 마취하에 완전히 있는지 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> 다음으로, 복강 단계 1.4에서 반딧불 루시페린 preprepared 150 μL 각 마우스를 주입. </li><li> 개별 코 콘 이소 플루 란을 투여와 함께 IVIS에서 마우스를 놓습니다. 인접 마우스에 신호를 최소화하기 위해 사이에 스페이서와 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 다섯 마우스의 최대 한번에 이미징 될 수있다. </li><li> 측정 및 생물 발광 강도를 루시페린 주사 후 3 분을 분석 할 수 있습니다. <ol><li> 단계 3.2.1에 설명 된대로 IVIS 초기화 후, &quot;발광&quot;, &quot;일초&quot;노출 시간, 및 &quot;중간&quot;비닝 (binning)을 선택한다. </li><li> imagin을 시작합니다 &quot;취득&quot;버튼을 클릭지. 루시페린 주입 후 일정한 시간 (3 분)에서 각각의 영상을 수행해야합니다. </li><li> 이미지가 획득 한 후, 이미지 창 및 도구 팔레트가 나타납니다. &quot;ROI 도구&quot;를 클릭하고 &quot;1&quot;, &quot;2&quot;, &quot;3&quot;, &quot;4&quot;또는 &quot;5&quot;원 아이콘에서 이미지화 마우스의 수에 대응. </li><li> ,이자 (로아)의 영역을 정의 마우스의 복강에 발광 신호의 신호 영역에 동그라미를 한 다음 복사 효율의 임의의 단위로 투자 수익 (ROI)의 &quot;측정&quot;을 클릭합니다 ((광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안) / (μW / cm 2)). 배경의 추가 투자 수익 (ROI) 원을 가지고 있는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> 사주 포스트 분사 이전 동물의 희생에서 개별 종양 식민지의 생물 발광 강도의 실시간 3D 재구성을 사용하여 종양 부담과 분포를 평가하기 위해 IVIS를 사용하여 확산 발광 이미징 단층 촬영 (DLIT)를 수행합니다. <oL&gt; <li> 쥐를 마취 단계 5.2.4에 기술 된 바와 같이, 루시페린을 주입. DLIT 한번에 한 마우스에 대해 수행된다. </li><li> 단계 3.2.1에 설명 된대로 IVIS를 초기화 한 후, &quot;이미지 마법사&quot;, &quot;생물 발광&quot;을 선택하고 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. &quot;DLIT&quot;를 선택하고 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. &quot;반딧불&quot;프로브를 선택하고 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. &quot;마우스&quot;이미지 제목, &quot;자동&quot;노출 매개 변수,보기의 &quot;C-13 cm&quot;필드 및 &quot;0.5 cm&quot;주제 높이를 선택하고 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. 영상을 시작합니다 &quot;획득&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 이미지가 획득 한 후, &quot;DLIT 3D 재건&quot;탭을 선택하고 &quot;분석&quot;탭과 3D 복원 영상을 생성하기 위해 &quot;재구성&quot;을 클릭합니다. </li><li> &quot;도구&quot;와 &quot;3D 애니메이션&quot;을 클릭합니다. 3 차원 애니메이션 창에서 &quot;Y 축에 회전 CCW&quot;를 선택합니다. .mov 인 형식 파일에 &quot;레코드&quot;와 &quot;저장&quot;을 클릭합니다. </li></ol></li></ol> 6. 예 생체 형광 영상 <ol><li> 비장 주사 다음 육주 - 마취, 또는 4에서 제도적 지침에 따라 동안 자궁 경부 전위로 마우스를 희생. </li><li> 간을 수확. 오른쪽 측면에 왼쪽에서 수평 절개를합니다. 픽업과 칼 모양의 프로세스를 잡아, 낫 모양, 간장 정맥과 하대 정맥을 해부하다. <ol><li> hepatoduodenal 인대를 해부하면서 꼬리가 로브를 손상하지 않도록주의하면서 오른쪽 간신 인대의 hepatoduodenal 인대, 그리고 왼쪽 간신 인대를 해부하다. 이 형광도 표시됩니다으로 간을 수확 한 후, 담낭을 제거합니다. 본 추가 여분 간 종양의 기록합니다. </li></ol></li><li> 본 거시적 숫자 및 간 종양의 크기의 노트를 가지고, 그리고 DPBS에 수확 간 놓습니다. 참고 : 종양은 육안으로 거시적으로 볼 수 있습니다흰색으로 종양 (대표 예를 들어,도 4 참조). </li><li> 이전 이미징 시트 배치에, 각각의 간을 부드럽게 종이 타월에 모래 바닥으로 물기를 제거합니다. </li><li> IVIS를 사용하여 각 종양 식민지에서 형광 강도를 측정한다. <ol><li> &quot;형광&quot;, &quot;사초&quot;노출 시간, &quot;중간&quot;비닝 (binning), &quot;2&quot;F / 정지, &quot;535&quot;여기 필터 및 &quot;580&quot;방출 필터를 선택합니다. 영상을 시작합니다 &quot;획득&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 영상을 획득 한 후, 화상 창 도구 팔레트를 찾아. &quot;ROI 도구&quot;를 클릭하고 원 아이콘에서 &quot;1&quot;을 선택합니다. ((방사 효율의 임의의 단위로 투자 수익 (ROI)의 &quot;측정&quot;을 클릭 한 다음 동그라미 이미지에 개별 종양 식민지의 신호 영역의 ROI를 정의하고 광자 / S / cm 2) / 스테 라디안 / (μW / cm 2) ). 배경의 추가 투자 수익 (ROI) 원을 가지고 있는지 확인하십시오. </li></oL&gt; </li><li> 이 구형으로 가정하여 총 종양 볼륨을 계산합니다. 종양의 부피 = 4 ×의 π의 XR 3분의 3 (R = 반지름). splenically 주입 된 세포의 수로 나눈 간 종양의 수와 암 콜로니 형성 세포 (FC)의 비율을 계산한다. </li><li> 단계 3.3에서 선형 근사에서 식민지 당 총 세포 수 (=의 X)를 계산합니다. TD (날) (28) / Y.을 같이 = Y = X (2) 상기 TD 로그로 세포 분열 (= Y)의 개수를 계산 </li></ol>

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Rep. 5 (10946), (2015).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models.">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li><li>Wang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analyses+identify+osteopontin,+LAMB3+and+ITGB1+as+critical+pro-metastatic+genes+for+lung+cancer.">Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer.</a> PLoS One. 8 (2), e55714 (2013).</li><li>Fidler, I. J., Kripke, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+results+from+preexisting+variant+cells+within+a+malignant+tumor.">Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor.</a> Science. 197 (4306), 893-895 (1977).</li><li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li><li>Khodarev, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT1+pathway+mediates+amplification+of+metastatic+potential+and+resistance+to+therapy.">STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy.</a> PLoS One. 4 (6), e5821 (2009).</li><li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-organ+microenvironment+interactions+in+the+pathogenesis+of+cancer+metastasis.">Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis.</a> Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).</li><li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligo-+and+polymetastatic+progression+in+lung+metastasis(es)+patients+is+associated+with+specific+microRNAs.">Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs.</a> PLoS One. 7 (12), e50141 (2012).</li><li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+characterizes+oligometastasis(es).">MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es).</a> PLoS One. 6 (12), e28650 (2011).</li><li>Calon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+of+colorectal+cancer+on+a+TGF-beta-driven+program+in+stromal+cells+for+metastasis+initiation.">Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation.</a> Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).</li><li>Vanharanta, S., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+metastatic+traits.">Origins of metastatic traits.</a> Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).</li><li>Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways:+Interferon/Stat1+Pathway:+Role+in+the+tumor+resistance+to+genotoxic+stress+and+aggressive+growth.">Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth.</a> Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-stimulated+gene+15+(ISG15)+is+a+trigger+for+tumorigenesis+and+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma.">Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).</li><li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites.">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li><li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer.">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li><li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases.">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).</li><li>Evans, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+mice+to+men:+Murine+models+of+colorectal+cancer+for+use+in+translational+research.">From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

현재 보고서에 기재된 동물 모델은 두 가지 방식에 기초한다. 우선, 정착 및 간에서 증식 다른 성향과 전이성 클론을 관찰 할 수있는 기능을 보장하기 위해 높은 이종 모노클로 날 세포주 패널 오히려 설정된 분획 암 세포주 12,13보다 설립되었다. 전이 현상에 대한 단일 클론 방식은 최근의 게놈 데이터 (14)에 의해 정당화되고, 성공적 전이성 10,15,16 프로세스를 모델링 이전...

차 대장 암 (CRC)에서 간 전이 환자는 예후가 불량 특징으로한다. 12 % - 5 간전 (단계 IV)을 가진 환자가 단지 8의 5 년 생존율이 동안 88 % 3,4 - 기본 nonmetastatic CRC에 대한 5 년 생존율 (단계는 I - III) (75)으로 추정 6. 그러나, 전이성 환자는 전이 및 다른 재발 시간의 서로 다른 숫자를 제시, 이종 그룹을 나타냅니다. 임상 관찰과 (지역 성장 속도에 비례) 단일 전이의 크기 (식민지 능력 또는 식민지의 주파수에 비례 할 수 있음) 전이의 수는 독립적 인 예후 인자 1,7가 있음을 나타냅니다. 성장 능력과 전파 및 간 미세 환경에서 생존 능력 : 즉, 간 식민지화 전이성 클론의 성공은 두 가지 특성에 의존한다. 디자인캡처 크게 간 전이 생물학에 대한 우리의 이해를 향상시키고 잠재적 인 치료 접근 방법의 설계를위한 효과적인 도구를 제공 할 수 있습니다 전이성 클론의 특성을 정량화의 기능이 성공적으로 임상 모델. 실험 간전 모델 이전 8,9보고되었지만, 이들 중 어느 정량적 캡처 생체와 생체 외 모두 개별 전이성 클론의 특성을 설명하는 기능을 제공했다. 여기, 우리는 다른 간 식민지의 효율성과 성장 특성을 가진 종양 클론의 생성을 포함하는 간 전이의 새로운 고급 모델을 제시한다. 우리는 전이성 용량 본질적인 차이가 모노클로 날 세포주의 생성과 루시페라아제 및 tdTomato 형광 단백질 암세포 이중 표지의 조합을 채용. 이 실험 모델에서, 데이터의 개발 것을 나타간 전이는 식민지 주파수의 용어 및 임상 관찰과 일치 배가 시간 (TD)으로 설명 될 수있다. 이 모델의 정량적 특성은 약물 발견 및 진단 목적으로 쉽게 채용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>IVIS Spectrum &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Imaging System</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>124262</td><td>&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; imaging system</td></tr><tr><td>LivingImage 4.0 Software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>128165</td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>VAD-MGX Research Anesthetic Machine</td><td>Vetamac</td><td>VAD-MGX</td><td>Inhalation anesthesia machine</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>Cell culture reagents</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>Cell culture reagents</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 &amp;mu;g streptomycin)</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>Cell culture reagents</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>24020117</td><td>Cell culture reagents</td></tr><tr><td>Buprenex Injection (0.3 mg/mL)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>Buprenorphine hydrochloride</td></tr><tr><td>Gemini Cautery System</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Hand-held cautery for splenectomy</td></tr><tr><td>Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5426</td><td>Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection</td></tr><tr><td>D-luciferin, potassium salt</td><td>Goldbio Technology</td><td>LUCK-1G</td><td>Luciferin potassium salt</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>Reduced Serum Medium</td></tr><tr><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td>BIO-RAD</td><td>1450102</td><td>Automatic cell counter</td></tr><tr><td>JMP10 software&amp;nbsp;</td><td>SAS Institute</td><td></td><td>Data analysis software</td></tr><tr><td>BD FACSAria II cell sorter</td><td>BD Biocsiences</td><td></td><td>Cell sorter</td></tr></tbody></table>

advanced animal model of colorectal metastasis in liver: imaging techniques and properties of metastatic clones

간 및 전이 진행의 느린 속도의 제한된 수의 환자는 성공적으로 치료 로컬로 처리 될 수 1,2- 접근한다. 그러나, 약간의 간 전이의 이질성에 대해 알려져 있으며, 개별 전이성 콜로니의 발달을 평가 할 수있는 동물 모델이 필요하다. 여기서는 정량적 간에서 개별적인 종양 클론의 개발을 시각화하고 성장 동역학 및 정착 효율을 추정하는 능력을 제공 간 전이의 고급 모델을 제시한다. 우리는 안정적으로 루시 페라 제와 tdTomato 다른 성장 특성을 갖는으로 표시 HCT116 인간 대장 암 세포의 단일 클론 파생 상품의 패널을 생성합니다. 비장 절제술 다음 비장 주입,이 클론의 대부분의 간 전이를 생성 할 수 있지만, 다른 주파수의 정착 및 가변 성장률이다. 생체 내 이미징 SYSTE 사용m (IVIS)는, 그것을 시각화 생체 발광 및 생체 형광 이미징 전이 현상을 정량화 할 수있다. 또한, 확산 발광 이미징 단층 촬영 (DLIT)는 생체 내에서 간 전이의 3 차원 분포를 제공한다. 수확 간의 전 생체 내 형광 이미징은 개인 간 전이성 식민지의 정량적 측정을 제공, 간 식민지의 주파수의 평가와 성장 속도론을 허용 전이. 모델 임상 관찰 간전이 비슷하기 때문에, 간 전이와 연관된 유전자를 검출하기위한 간 전이성 질환 전위 융제 또는 보조제 치료를 시험하는 양상이 될 수있다.

이 실험의 목표는. 생체 전이성 종양 부담 직렬 정량화하고 식민 주파수 간 전이 현상의 성장 동역학의 추정의 가능성과 일관된 쉽게 재현 동물 모델을 확립 하였다 2-6도 전설로, 크리에이티브 커먼즈 CC-BY 라이센스 (10)에 따라 이전 출판물에서 제공됩니다. 더블 표지 종양 세포 단일 클론의 생성 <...

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Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

advanced-animal-model-colorectal-metastasis-liver-imaging-techniques

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.5K 조회수.  The University of Chicago. The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

비디오: Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are administered specifically to the liver to induce a localised liver tumour, via mobilisation of the spleen and splitting into two, leaving intact the vascular pedicle for each half of the spleen. Lewis lung carcinoma cells that constitutively express the firefly luciferase gene (luc1) are inoculated into one hemi-spleen which is then resected 10 minutes later. The other hemi-spleen is left intact and returned to the abdomen. Liver tumour growth can be monitored by bioluminescence imaging using the IVIS whole body imaging system. Quantitative imaging of tumour growth using IVIS provides precise quantitation of viable tumour cells. Tumour cell death and necrosis due to drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This mouse model allows for investigating the mechanisms underlying metastatic tumour-cell survival and growth and can be used for the evaluation of therapeutics of liver metastasis. 

This article describes a procedure for the induction of orthotopic bioluminescent liver tumours in mice, and subsequent analysis of tumour growth confined to the liver using live whole body luminescence imaging.

Murine 발광 생물 간장 Tumour 모델

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

연구

의학

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

암 연구학

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this clinical challenge, tumor xenograft mouse models using long-established human carcinoma cell lines and many transgenic mouse models with tumors have been developed as preclinical models. They partially mimic the features of human carcinomas, but often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies including invasion and metastasis. Thus, alternative models that better represent the malignant progression in human CRC have long been awaited.
We herein show generation of patient-derived tumor xenografts (PDXs) by subcutaneous implantation of small CRC fragments surgically dissected from a patient. The colon PDXs develop and histopathologically resemble the CRC in the patient. However, few spontaneous micrometastases are detectable in conventional cross-sections of affected distant organs in the PDX model. To facilitate the detection of metastatic dissemination into distant organs, we extracted the tumor organoid cells from the colon PDXs in culture and infected them with GFP lentivirus prior to injection into highly immunodeficient NOD/Shi-scid IL2R&#947;null (NOG) mice. Orthotopically injected PDX-derived CRC organoid cells consistently form primary tumors positive for GFP in recipient mice. Moreover, spontaneously developing micrometastatic colonies expressing GFP are notably detected in the lungs of these mice by fluorescence microscopy. Moreover, intrasplenic injection of CRC organoids frequently produces hepatic colonization. Taken together, these findings indicate GFP-labelled PDX-derived CRC organoid cells to be visually detectable during a multistep process termed the invasion-metastasis cascade. The described protocols include the establishment of PDXs of human CRC and 3D culture of the corresponding CRC organoid cells transduced by GFP lentiviral particles.

To allow highly sensitive detection of the disseminating human colorectal cancer (CRC) cells colonizing tissues, we herein show a protocol for efficient transduction of green fluorescent protein (GFP) lentiviral particles into PDX-derived CRC organoid cells prior to their injection into recipient mice, with stereo-fluorescence microscopic observation.

GFP Lentivirus 불리고 Organoids 환자 파생 결 장 종양에서 경작에 의해 생성 된 Micrometastases의 고감도 검출

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

대장암의 Orthotopic 마우스 모델

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

생물학

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and colorectal cancer (CRC). More than 50% of patients with muscle-invasive UCC, despite curative therapy for clinically-localized disease, will develop metastases and die within 5 years, and metastatic CRC is a leading cause of cancer-related deaths in the US. Xenograft models that consistently mimic UCC and CRC metastasis seen in patients are needed. This study aims to generate patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) models of UCC and CRC for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of LN stromal cells mimicking the progression of human metastatic diseases for drug screening. Fresh UCC and CRC tumors were obtained from consented patients undergoing resection for HG-UCC and colorectal adenocarcinoma, respectively. Co-inoculated with LN stromal cell (LNSC) analog HK cells, luciferase-tagged UCC cells were intra-vesically (IB) instilled into female non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice, and CRC cells were intra-rectally (IR) injected into male NOD/SCID mice. Tumor growth and metastasis were monitored weekly using bioluminescence imaging (BLI). Upon sacrifice, primary tumors and mouse organs were harvested, weighed, and formalin-fixed for Hematoxylin and Eosin and immunohistochemistry staining. In our unique PDOX models, xenograft tumors resemble patient pre-implantation tumors. In the presence of HK cells, both models have high tumor implantation rates measured by BLI and tumor weights, 83.3% for UCC and 96.9% for CRC, and high distant organ metastasis rates (33.3% detected liver or lung metastasis for UCC and 53.1% for CRC). In addition, both models have zero mortality from the procedure. We have established unique, reproducible PDOX models for human HG-UCC and CRC, which allow for tumor formation, growth, and metastasis studies. With these models, testing of novel therapeutic drugs can be performed efficiently and in a clinically-mimetic manner.

This protocol describes the generation of patient-derived orthotopic xenograft models by intra-vesically instilling high-grade urothelial cell carcinoma cells or intra-rectally injecting colorectal cancer cells into non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of lymph node stromal cells, which mimics the progression of human metastatic diseases.

인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

허혈 재관류 손상의 설정에서 전이성 간 종양의 뮤린 모델

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the tumor microenvironment, play a crucial role in metastatic CRC progression and predict poor patient prognosis. However, there is a lack of satisfactory mouse models to study the crosstalk between metastatic cancer cells and CAFs. Here, we present a method to investigate how liver metastasis progression is regulated by the metastatic niche and possibly could be restrained by stroma-directed therapy. Portal vein injection of CRC organoids generated a desmoplastic reaction, which faithfully recapitulated the fibroblast-rich histology of human CRC liver metastases. This model was tissue-specific with a higher tumor burden in the liver when compared to an intra-splenic injection model, simplifying mouse survival analyses. By injecting luciferase-expressing tumor organoids, tumor growth kinetics could be monitored by in vivo imaging. Moreover, this preclinical model provides a useful platform to assess the efficacy of therapeutics targeting the tumor mesenchyme. We describe methods to examine whether adeno-associated virus-mediated delivery of a tumor-inhibiting stromal gene to hepatocytes could remodel the tumor microenvironment and improve mouse survival. This approach enables the development and assessment of novel therapeutic strategies to inhibit hepatic metastasis of CRC.

Portal vein injection of colorectal cancer (CRC) organoids generates stroma-rich liver metastasis. This mouse model of CRC hepatic metastasis represents a useful tool to study tumor-stroma interactions and develop novel stroma-directed therapeutics such as adeno-associated virus-mediated gene therapies.

간 전이 스트로마를 연구하기 위해 대장암 오가노이드의 포털 정맥 주사

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D tumoroids. Since patient derived tumor organoids can retain the characteristics of the original tumor, these reliable preclinical models enable cancer drug screening and the study of drug resistance mechanisms. However, CRC related death in patients is mostly associated with the presence of metastatic disease. It is therefore essential to evaluate the efficacy of anti-cancer therapies in relevant in vivo models that truly recapitulate the key molecular features of human cancer metastasis. We have established an orthotopic model based on the injection of CRC patient-derived cancer cells directly into the cecum wall of mice. These tumor cells develop primary tumors in the cecum that metastasize to the liver and lungs, which is frequently observed in patients with advanced CRC. This CRC mouse model can be used to evaluate drug responses monitored by microcomputed tomography (&#181;CT), a clinically relevant small-scale imaging method that can easily identify primary tumors or metastases in patients. Here, we describe the surgical procedure and the required methodology to implant patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice.

This protocol describes the orthotopic implantation of patient-derived cancer cells in the cecum wall of immunodeficient mice. The model recapitulates advanced colorectal cancer metastatic disease and allows for the evaluation of new therapeutic drugs in a clinically relevant scenario of lung and liver metastases.

생쥐에서 환자 유래 암세포의 정형외피 이식은 진행성 대장암을 재현합니다.

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...