Name: in situ immunofluorescent staining of autophagy in muscle stem cells
Uploaded: 2017-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells at JoVE.com

이 작품은 NIAMS AR064873, Epigen Project PB에서 지원되었습니다. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT에서 LL로

마우스를 표준 동물 시설 절차에 따라 사육하고 유지하였으며, 모든 실험 프로토콜은 동물 복지 보장 및 이탈리아 동물 보건부의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았으며, NIH의 관리 및 사용 가이드 실험실 동물. 1. Autophagic Flux의 근육 손상과 In Vivo 블록 <ol><li> 근육 부상. <ol><li> 급성 골격근 손상을 유도하기 위해 약 20 g 무게의 2 개월 된 C57BL / 6J 마우스의 왼쪽 경골 전방 (TA) 근육에 10 μM cardiotoxin (CTX) 스톡 20 μL를 직접 주입하십시오. 동등한 수의 남성과 여성을 사용하십시오. 교란되지 않은 반대쪽 다리를 대조군으로 사용하십시오. 참고 : 0.9 % 염화나트륨 용액에서 10 μM CTX는 여과해야하며 (0.22 μm PVDF 필터) -20 ° C에서 보관해야합니다. 반복 된 동결 - 해동 사이클을 피하십시오. </li><li> i를 사용하여30 G 주사 바늘이 달린 주사 주사기 NS의 중앙에 CTX를 주사하십시오. TA에서 정확한 손상을 유도하려면 주사기의 바늘이 근육의 바닥에서 꼭대기까지 5 mm 깊이의 말단 힘줄 근처에 들어서는지 확인하십시오 ( 그림 1A ). </li></ol></li><li> 교란이없는 손상된 쥐에서의 자폐증 플럭스 차단. <ol><li> autophagic 플럭스, 24 h Post-Injury (pi)를 평가하기 위해 복강 내 (IP) 주입 ( 그림 1B )에 의해 24 시간마다 50 mg / kg 클로로퀸 (CLQ)을 4 일간 투여하십시오. <ol><li> PBS 1 X에 CLQ (10 MG / ML)를 용해하고 0.2 μm의 막을 통해 그것을 필터링합니다. 모든 마우스의 무게를 측정하고 주입 할 CLQ 양을 계산합니다. 참고 : 같은 날 CLQ 솔루션을 준비하고 사용하십시오. CLQ 보관은 -20 ° C에서 1 개월까지 보관할 수 있습니다. autophagy는 대사 관련 과정이기 때문에 항상 CLQ 치료를 항상 동시에 수행하십시오 ( 예 : 아침에 befo오전 10시). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 근육 조직 섹션 <ol><li> 마우스 희생. <ol><li> 상해 5 일 후 마우스를 안락사. </li><li> 자궁 경부 탈구 또는 CO 2 에 의한 안락사 수행 (확인을 위해 자궁 경관 전위가 뒤따라야 함). autophagy 과정은 마우스의 수면 / 습관과 관련이 있기 때문에 항상 아침에 ( 예 : 오전 10시 이전에) 마우스를 동시에 희생합니다. </li></ol></li><li> TA 격리 및 포함. <ol><li> 해부하기 전에 70 % 에탄올을 마우스에 뿌리십시오. </li><li> 가위를 사용하면 허리의 높이에서 마우스의 등쪽 피부에 작고 수직 인 절개 (길이 3 mm)를 만듭니다. 꼬리와 발을 잘라서 피부 제거를 단순화하십시오. 피부를 꼬리쪽으로 당기고 제거하여 밑에있는 근육을 노출시킵니다. 도 2A 에 도시 된 바와 같이, TA 근육은 국소화하기 쉽다 </strong&gt;. </li><li> 두 포셉의 도움으로 말초 힘줄을 파악하십시오. </li><li> 원위 힘줄을 자르십시오; TA와 extensor digitorium longus (EDL) 힘줄은 종종 절단되어 나중에 분리됩니다 (2.2.6 단계 참조). </li><li> 집게를 사용하여 힘줄로 조교근을 잡고 조심스럽게 근육을 근위 말단 (무릎 부근; 그림 2B )쪽으로 당깁니다. 참고 :이 시점에서 EDL 및 TA 근육은 쉽게 인식 할 수 있으며 TA는 EDL보다 크고 표면적입니다. </li><li> 두 개의 말초 힘줄을 반대 방향으로 잡아 당김으로써 TA를 EDL 근육과 분리하십시오 ( 그림 2C ). </li><li> 근위 힘줄을 자르십시오. </li><li> 포셉을 사용하여 조직을 손상시키지 않고 근육을 덮고있는 얇은 근막을 제거하십시오. </li><li> 종이 타월로 시료의 과도한 수분을 제거하십시오. 과도한 수분이 sig를 생성하므로 근육이 젖지도 않고 지나치게 건조하지 않도록하십시오.근육에 심각한 손상을 입히고 다음 염색을 위태롭게합니다. </li><li> 몰드 바닥에 최적 절단 온도 (OCT) 화합물을 놓고 그림 2D에 표시된 방향으로 그 안에 근육을 놓습니다. 100 % 이소 펜탄을 약 3 ~ 4cm 깊이에 도달 할 때까지 비이커에 넣으십시오. 비커를 폴리스티렌 상자에 액체 질소와 접촉시킵니다. </li><li> 액체 질소가 비커에 들어 가지 않도록하십시오. 발포성 포말이 생기므로 포말에 영향을 미치고 근육 부위가 손상 될 수 있습니다. </li><li> 이소 펜탄을 관찰하고 적절한 온도 (-140 ° C ~ -150 ° C)에 도달 할 때까지 기다리십시오. 적절한 온도에서 냉동 된 이소 펜탄의 단단한 흰색 층이 비이커 바닥에서 결정화됩니다. </li><li> 이소 펜탄이 완전히 고체가 얼면 녹고 다음 단계로 진행하기 전에 얼어서 온도를 낮추십시오. </li><li> prechilled 집게를 사용하여 미묘하게 곰팡이를로 낮추십시오약 20-30 초 동안 이소 펜탄. 냉동 샘플을 -80 ° C의 냉동고에 옮길 때까지 드라이 아이스가 담긴 용기에 넣으십시오. 참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 근육 조직 cryosections. <ol><li> -80 ° C에서 적어도 한 밤 후, cryosectioning을 수행하십시오. </li><li> -20 ° C의 냉동고에서 저온 유지 장치 나이프와 안티 롤 플레이트를 꺼내어 각각의 지지대에 저온 유지 장치 캐비닛에 놓습니다. </li><li> 샘플 스텁에 OCT 한 방울을 올려 놓고 그림 2D 에서 시각화 된 바와 같이 고정 된 샘플을 수직 NS 방향으로 놓습니다. </li><li> 샘플 스터브를 척에 올려 놓습니다. </li><li> 안티 - 롤 플레이트를 칼에서 당기지 않고 40μm에서 약간의 절개를하여 근육을 포함하지 않는 OCT를 제거하십시오. 근육이 보일 때 슬라이스 두께를 7-8 μm로 줄이십시오. </li><li> 롤 방지 플레이트가 제자리에 고정 될 때까지 당깁니다.칼의 가장자리 또는 조금 위에. </li><li> 조직 절편 당 7-8 μm 두께의 횡단면 절편을 만들고 3-4 절편을 장착하십시오. 참고 : 권장되는 저온 유지 장치 온도는 -15 ° C ~ -23 ° C입니다. 샘플의 횡단면은 위성 틈새 위치에서 근육 줄기 세포를 찾아내는 후속 분석에 필요합니다. </li><li> 섹션의 준수를 극대화하기 위해 슬라이드를 실온에서 10-15 분 동안 유지하여 항체 배양 중 분리를 방지하십시오. 참고 : 공기 건조 단계는 모호한 결과를 제공하는 면역 염색에 영향을 줄 수 있습니다. 슬라이드는 -80 ° C에서 몇 달 동안 비 고정으로 보관할 수 있습니다. 여기서 프로토콜을 일시 중지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> Hematoxylin Eosin (H &amp; E) 염색을 시행하여 TA 근육의 절제술시 근육 손상을 검사합니다. <ol><li> 근육의 품질을 평가하기 위해 ( 즉 , 부상, 근육 격리 및 inclus의 효과이온 및 cryosections), H &amp; E 얼룩을 수행합니다. 모든 실험 시점에 대해 하나의 슬라이드를 4 % PFA로 10 분 동안 고정시킵니다. 고정 후 1x PBS의 여러 변화에서 슬라이드를 잘 씻어. 참고 :주의. PFA는 발암 물질이므로 신중하게 취급해야합니다. </li><li> 모든 실험 포인트에 대해 하나의 슬라이드를 가져 와서 염색 용기에 넣으십시오. </li><li> 섹션이 덮여 8 분 동안 품어 때까지 9g / L hematoxylin 항아리를 채우십시오. </li><li> 헤 마톡 실린을 재활용하십시오. </li><li> 항아리를 흐르는 물에 10 분 동안 두어 과량의 헤 마톡 실린을 제거하십시오. 참고 : 섹션에 직접 물이 흐르지 않도록하십시오. </li><li> 멸균 된 물로 씻으십시오. </li><li> 산성화 된 90 % 에탄올에서 0.5 분 (w / v)의 에오신으로 1 분간 절편을 부화시킨다. </li><li> eosin을 재활용하십시오. </li><li> 3 분 / 세척을 위해 멸균 물로 두 번 씻으십시오. 참고 : 화학 물질 후드에서 다음 단계를 수행하십시오. </li><li> 절편을 70 % 에탄올로 씻으십시오. </li><li> 빨래90 % 에탄올이있는 섹션. </li><li> 섹션을 100 % 에탄올로 씻으십시오. </li><li> 절편을 0.879 g / mL o-Xylene으로 배양하십시오. 참고 :주의. o-Xylene은 인화성이며 중독성이 있습니다. 장갑, 실험용 코트 및 가면을 포함하여 보호 장비를 착용하고 화학 약품으로 처리하십시오. </li><li> o-Xylene을 재활용하십시오. </li><li> 슬라이드를 종이 위에 올려 건조시킵니다. </li><li> 빠른 경화, 크실렌 기반 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 닫습니다. </li><li> 광학 현미경으로 단면 배율을 10 배로 확인하십시오 ( 그림 3 참조) 참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 3. 손상된 근육 조직 섹션의 LC3 및 MyoD에 대한 면역 염색 <ol><li> 근육 조직 섹션의 고정. <ol><li> 종이를 적신 후 높은 파일을 유지하기 위해 닫을 수있는 플라스틱 상자의 바닥에 배치하여 부화 챔버를 준비하십시오챔버 내의 습도 (vel). 10 분 동안 1x PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 조직 절편을 고정시킨다. 참고 : 젖은 종이는 시료 건조를 방지하는 데 사용됩니다. 신선한 PFA를 준비하거나 -20 ° C에 보관 된 PFA를 사용하십시오. 주의. PFA는 독성이있다. 원액을 만들 때 파우더를 조심스럽게 다루어야합니다. 이 작업은 장갑, 실험용 코트 및 마스크와 같은 보호 장비가있는 화학 물질 후드에서 수행해야합니다. 또한 용액에있을 때 PFA는 조심스럽게 조작되어야합니다. </li><li> PFA를 제거하고 5-7 분 1X PBS로 섹션을 씻어; 이 단계를 3 번 ​​반복하십시오. </li></ol></li><li> 근육 조직 절편의 침투. <ol><li> pap 펜을 사용하여 조직 절편 주위에 소수성 장벽을 그립니다. 참고 :이 단계는 조직 절편 주위의 표면을 정의하고 3.4, 3.6, 3.7 및 3.9 단계에서 설명한 항체의 양을 최소화합니다. </li><li> 저온 (-20 ° C) 200 μL,메탄올로 옮기고 -20 ° C에서 5 분 동안 냉동기 안에 수평으로 배양 챔버를 놓습니다. </li><li> 냉동실에서 부화 챔버를 제거하고, 메탄올을 대기음, RT에서 5-7 분 동안 1X PBS로 섹션을 씻어 라. 이 단계를 3 번 ​​반복하십시오. </li></ol></li><li> 블로킹 <ol><li> PBS 1x에 4 % Bovine Serum Albumin (BSA)의 새로운 블록 용액을 준비하십시오. 참고 : BSA 용액은 4 ° C에서 1 주일 동안 저장할 수 있습니다. </li><li> RT에서 최소 60 분 동안 블록 솔루션으로 섹션을 품어. </li><li> 차단 용액을 제거하십시오. </li><li> 1x PBS에서 20 μg / mL anti-Fab를 희석하여 항 Fab 혼합물 100 μL를 준비합니다. 절편을 RT에서 1 시간 동안 항 - 마우스 IgG의 비 - 결합 친화도 - 정제 F (ab) 단편으로 인큐베이션한다. </li></ol></li><li> 일차 항체 배양. <ol><li> 1 배 PBS에서 4 % BSA에 LC3 및 MyoD 항체를 용해하여 각 슬라이드에 대한 기본 항체 믹스 100 μL를 준비합니다. 5 μg /mL의 항 -LC3 (토끼 폴리 클론 항체) 및 10mg / L의 항 -MyoD (마우스 모노클로 날 항체)를 첨가 하였다. 밤새 1 차 항체 혼합물을 4 ° C에서 인큐베이션하십시오. </li></ol></li><li> 세척. <ol><li> 일차 항체 혼합물을 제거합니다. </li><li> 10 분 1X PBS에서 1 % BSA로 섹션을 씻으십시오; 이 단계를 3 번 ​​반복하십시오. </li></ol></li><li> 이차 항체 배양. <ol><li> 각 슬라이드에 대한 보조 항체 믹스 100 μL를 준비합니다. 1x PBS에 4 % BSA에서 염소 안티 - 토끼 488 (5 μg / ML)과 염소 안티 - 마우스 594 (5 μg / ML)를 해산. 참고 : 형광 염색 표백을 방지하기 위해 빛에 과도한 노출을 피하십시오. 어둠 속에서 다음 단계를 수행하십시오. </li><li> RT에서 45 분 동안 보조 항체 믹스와 섹션을 품어. </li><li> 2 차 항체 혼합물을 제거하고 5-7 분 1x PBS로 섹션을 씻어; 이 단계를 3 번 ​​반복하십시오. </li></ol></li><li> 일차 항체 배양. <ol><li> 희석 층각 슬라이드에 대해 100 μL의 혼합물을 사용하여 1x PBS 중 4 % BSA에서 n-2 (α-2-chain) 단일 클론 항체 (0.33 μg / mL) RT에서 1 ~ 2 시간 동안 기본 항체 믹스의 섹션을 품어. </li></ol></li><li> 세척. <ol><li> 일차 항체 혼합물을 제거합니다. </li><li> 10 분 1X PBS에서 1 % BSA로 섹션을 씻으십시오; 이 단계를 3 번 ​​반복하십시오. </li></ol></li><li> 이차 항체 배양. <ol><li> 1X PBS에 4 % BSA에 염소 방지 쥐 647 (5 μg / ML)을 희석하여 각 슬라이드에 대한 보조 항체 믹스 100 μL를 준비합니다. RT에서 45 분 동안 보조 항체 믹스의 섹션을 품어. </li><li> 2 차 항체 혼합물을 제거하고 5-7 분 1x PBS로 섹션을 씻어; 이 단계를 3 번 ​​반복하십시오. </li></ol></li><li> 4 &#39;, 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌 (DAPI) 배양. <ol><li> 각 슬라이드에 1x PBS에 300nM DAPI 솔루션 200μL를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 품어 둡니다. 4 ℃에서 DAPI 용액을 보관하십시오.어두운. </li><li> 5-7 분 동안 1x PBS로 절편을 씻으십시오. 이 단계를 3 번 ​​반복하십시오. </li></ol></li><li> 마운트 스테인드 근육 섹션. <ol><li> 섹션에서 과량의 세척액을 제거하십시오. </li><li> 슬라이드 중간에 얼룩 섹션에 1x PBS (3시 1 분)에 글리세롤 10 μL를 넣고 공기 방울의 형성을 피하기 coverslip을 추가합니다. </li></ol></li></ol> 4. 공 촛점 현미경 수집 <ol><li> 이미지 캡처 시스템 및 분석 소프트웨어와 통합 된 4 레이저 공 촛점 현미경을 사용하여 이미지를 수집하십시오. 참고 : MyoD는 밝은 적색 형광 염료 인 594 염료와 함께 결합되어 594 nm 레이저 (여기 : 590 nm, 방출 : 617 nm)에 이상적으로 적합합니다. LC3는 밝은 녹색 형광 염료 인 488 염료와 결합되어 488 nm 레이저 라인 (여기 : 495 nm, 방출 : 519 nm)에 이상적으로 적합합니다. 라미닌은 647 염료와 결합되어 있습니다.647 nm 레이저 라인 (excitation : 650 nm, emission : 668 nm)에 이상적으로 적합한 여기에 밝은 원적외선 형광 염료입니다. </li><li> 현미경 트레이에 슬라이드를 놓고 핵 신호를 검출하기 위해 63 배 확대를 사용합니다. 근육 형태에 의존하는 활성 재생 분야를 중심으로 재생 영역에 수동으로 초점을 맞 춥니 다 ( 그림 4 참조). 참고 : 교란이없는 근육에서 근섬유의 크기는 거의 일정합니다 ( 그림 4A ). 상처가 매개되는 근육 재생은 재생 후 새로 형성된 섬유 인 작은 근육 섬유의 출현으로인지 할 수 있습니다. 또한, 활성 재생의 근육은 대 식세포, 섬유 - 지방 형성 전구 물질 및 손상된 근육에 국한되어 근육 재생을 조율하는 세포 ( 도 4B )로 이루어진 광범위한 침윤을 특징으로한다. </li><li> 재생에서 면역 형광 염색을 평가하십시오.myofibers의 기초 얇은 판 밑에 위치한 MuSCs에 초점을 맞춤으로써 비균진적인 영역을 발견 할 수 있습니다. </li><li> MyoD 염색에 양성이고 laminin 염색으로 표시된 myofibers 내에 위치하는 MuSC에 초점을 맞 춥니 다 ( 그림 4B , 흰색 화살표 참조). </li><li> 최소 3 마리의 실험용 그룹을 사용하고 현미경을 사용하여 각 실험 그룹에 대해 최소 7 개 필드의 63 배 확대 이미지를 얻습니다. </li><li> 재생 영역이 확인되면 DAPI 얼룩을 사용하여 초점을 맞춘 다음 다른 단일 채널을 조정하십시오. <ol><li> 다음과 같은 현미경 설정을 사용하십시오 : 채널 A594 핀홀 1.2 에어 유니트, 게인 791; 채널 A488 핀홀 1.6 에어 유니트, 게인 659; 채널 A647 핀홀 1.4 에어 유니트, 게인 719. </li></ol></li><li> 단일 채널의 초점을 조정 한 후 1,024 x 1,024 프레임 크기 및 12.61 μs 픽셀 거주지에서 이미지를 수집합니다. </li><li> MyoD 양성 세포의 백분율을 계산하십시오 (t그는 LC3 음성 인 MyoD 양성 세포의 백분율 및 LC3 음성 인 백판 아래의 정확한 위치). 참고 : LC3 염색을 나타내는 MyoD 양성 세포의 백분율은이 프로토콜의 판독 값입니다. </li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO3+promotes+quiescence+in+adult+muscle+stem+cells+during+the+process+of+self-renewal.">FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).</li><li>Tang, A. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+autophagy+supports+the+bioenergetic+demands+of+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation.</a> EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).</li><li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+maintains+stemness+by+preventing+senescence.">Autophagy maintains stemness by preventing senescence.</a> Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li></ol>

저자는 아무 것도 공개하지 않는다.

<html> 이 프로토콜은 보상 근육 재생 중에 골격 근육 줄기 세포에서 autophagy를 모니터링하는 방법을 설명합니다. LC3와 MyoD의 공동 염색을위한 몇 가지 항체가 시도되었으며, 마우스 조직 절편에서 작동하고 성공적인 결과를 창출하는 항체가 여기에 나열되어 있습니다 ( 재료 표 참조). 성공적인 염색을 위해서는 메탄올로 투과성을 높이는 것이 좋습니다 (3.2.2 절 참조). <p class="jove_cont...

골격근 재생은 성체 줄기 세포 (Muscle Satellite Cells, MuSCs)와 재생 과정에 관여하는 다른 세포 유형 사이의 상호 작용의 결과입니다. 근육의 항상성과 기능은 근육 틈새와 전신 신호 1 , 2 에서 발생하는 결합 된 신호에 의해 유지됩니다. 평생 동안 MuSC 기능, 근육 틈새 및 체계적 단서의 변화가보고되어 고령자의 기능적 능력이 저하됩니다 3 . MuSC는 기저 층 아래의 틈새에 설치되며, 근육 손상시 손상된 근육을 복구하기 위해 활성화됩니다 4 , 5 . 생산적인 재생 반응을 보장하기 위해서는 MuSC가 정지, 자기 재생 및 증식 단계에서 벗어나는 데 필요한 여러 과정을 조정하는 것이 중요합니다근원적 ​​인 차별화 6 . 노인과 근력 만성 질환에서 이러한 모든 기능이 손상되어 근육 기능이 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13으로 변경 됩니다. Macroautophagy (이하 autophagy 라 함)는 조직의 항상성 유지에 필수적인 중요한 생물학적 과정으로 부상하고 있습니다. autophagic 과정은 세포질, 세포 소기관 및 단백질의 일부가 최종적으로 lysosome 경로를 통해 분해되어 독성 분자의 제거와 거대 분자의 재생을 촉진시키는 소포로 삼켜지는 인신 매매 (trafficking) 메커니즘을 포함합니다cules. 이것은 스트레스 나 다른 악조건 하에서 세포 및 조직 적응을 돕기 위해 에너지가 풍부한 화합물을 제공합니다 15 , 16 . 그것의 세포 생존 활동과 함께, autophagy는 또한 세포 조직 문맥 ( 예를 들면, 정상 조직 대 암 조직) 및 긴장 자극 17,18 의 유형에 따라서 세포 죽음 유도자로 작동 할 수있다. 최근의 증거에 따르면 autophagy는 근육 질량과 근육 섬유 무결성을 유지하는 데 필요하며 Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27을 비롯한 다양한 근이영양증 21 , 22 , 23 에서 장애가 있다고보고되었습니다 </su32 , 33 , 34 , 35 , 근육 질량의 감소 (sarcopenia라고도 함) 32 , 33 , 34 (p&gt; , 28 , 29 , 30) 와 같은 노인에서 autophagic 과정의 점진적 감소가 관찰되었다. , 35 , 36 , 37 그리고 근전도 생존 38 . autophagy와 골격 근육의 재생 잠재력 사이의 밀접한 관계는 Wagers 실험실의 연구에서 칼로리 제한이 MuSC 가용성과 활동을 향상 시킨다는 것을 보여주었습니다 39 . 이 아니오기능은 Foxo3-Notch 축이자가 재생 과정에서 자아 식 과정을 활성화시키고 MuSC가 정지 상태에서 증식 상태로 전환된다는 최근 관찰에 의해 뒷받침되었다. 이 데이터는 노화 동안 MuSC의 수치 적 및 기능적 감소와 관련하여 젊은에서 노인 및 노인 성인 MuSC 로의 기저 autophagy의 점진적인 감소와 일치한다. 최근 논문에서, 우리는 DMDF 진행의 초기 단계를 구별하는 보상 근육 재생과 autophagy 사이의 밀접한 관계를 증명했습니다. 따라서, 우리는 근육 재생이 손상되고 섬유화 조직 침착이 발생하는 질병 진행의 후기 단계에서 감소 된자가 연쇄 플럭스를 관찰했다. 흥미롭게도 우리는 재생 조건에서 autophagy가 MuSC에서 활성화되고, autophagic 과정을 조절하는 것이 MuSC 활성화 및 fu의무 30 . 종합적으로, 이러한 데이터는 정상 및 병리학 적 조건에서 그리고 수명 전반에 걸쳐 근육 재생 동안 MuSC에서 자이 필드 과정을 탐색 할 긴급 성을 강조한다. 여기에서 우리는 autophagy 43 의 마커 인 미세 소관 연합 단백질 1A / 1B-L 鎖 사슬 3 (LC3)과 MyoD의 마커 인 in situ immunostaining을 수행함으로써 근육 재생 조건에서 MuSC에서의 autophagic 과정을 모니터링하는 프로토콜을 제공합니다. myogenic 혈통, 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편에서. 보고 된 방법론은 근육 재생을 조율하는 데 핵심적인 역할을하는 특정 세포 구획 인 MuSC에서자가 식사 과정을 모니터링 할 수있게합니다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>WT mice</td></tr><tr><td>Cardiotoxin 1</td><td>Latoxan</td><td>L8102</td><td></td></tr><tr><td>Millex-VV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td>Syringe Filter Unit, 0.1 &amp;micro;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628</td><td>Caution:&lt;br/&gt; Harmful if swallowed</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine + 0.5 mL</td><td>BD</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Intermediate</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin Solution, Harris Modified</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS32</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution, alcoholic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>o-Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1040</td><td>Caution:&lt;br/&gt; Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Caution:&lt;br/&gt; Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer</td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt - Quick-hardening mounting medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>LC3B Antibody</td><td>Cell signaling Technology</td><td>2775</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal mouse anti-MyoD&lt;br/&gt; (concentrated) clone 5.8A</td><td>DAKO - Agilent Pathology Solutions</td><td>M3512</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-2 (&amp;alpha;-2-chain) monoclonal antibody</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>4H8-2</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21248</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ immunofluorescent staining of autophagy in muscle stem cells

증가하는 증거는 조직 항상성을 보존하기위한 중요한 조절 과정으로서의 autophagy를 가리킨다. autophagy는 골격근 발달과 재생에 관여하며, autophagic 과정은 여러 가지 근육 병리학 및 연령 관련 근육 질환에 기술되어있는 것으로 알려져 있습니다. 근육 수리 중 위성 세포의 기능적 고갈과 관련이있는 최근에 설명 된 autophagic 과정의 블록은 활동적인 autophagy가 생산적인 근육 재생과 결합된다는 개념을지지합니다. 이 자료는 근이영양증과 같은 정상 및 병리학 적 조건 모두에서 근육 재생 중에 인공위성 세포 활성화에서의 autophagy의 중요한 역할을 밝힙니다. 여기, 우리는 근육 재생 조건 동안 성인 근육 줄기 세포 (MuSC) 구획에서 autophagic 과정을 모니터링하기위한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 LC3의 현장 면역 형광 이미징을 수행하는 설치 방법을 설명합니다.utophagy 마커, MyoD, 근원 계통 마커를 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편에서 관찰 하였다. 보고 된 방법론은 근육 재생을 조율하는 데 중심적인 역할을하는 특정 세포 구획 인 MuSC 구획에서자가 식사 과정을 모니터링 할 수있게합니다.

이 프로토콜은 근육 재생 중에 MuSCs에서 autophagy를 감지하는 효율적인 원위치 방법을 설명합니다. CTX In Vivo 치료법 : CT 근육을 사용하여 근육 손상을 유도하고 조절되지 않는 근육을 사용하십시오. autophagy가 매우 동적이기 때문에 CLQ ( 그림 1 )의 I...

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In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

활성 autophagy는 근육 줄기 세포 (MuSC) 활성화에 필수적인 생산적인 근육 재생과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 LC3의 현장 검출을위한 프로토콜을 제공합니다. LC3는 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편의 MyoD- 양성 MuSC에서의자가 작용 마커입니다.

근육 줄기 세포에서 Autophagy의 원위치 Immunofluorescent 얼룩

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

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Research

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Biology

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

10.1K 조회수.  Italian National Research Council.  활성 autophagy는 근육 줄기 세포 (MuSC) 활성화에 필수적인 생산적인 근육 재생과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 LC3의 현장 검출을위한 프로토콜을 제공합니다. LC3는 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편의 MyoD- 양성 MuSC에서의자가 작용 마커입니다. 

비디오: In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

생물학

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via the lysosome and are recycled. During autophagy, cytoplasmic LC3 protein is lipidated and recruited to the autophagosomal membranes. The autophagosome then fuses with the lysosome to form the autolysosome, where the breakdown of the autophagosome vesicle and its contents occurs. The ubiquitin-associated protein p62, which binds to LC3, is also used to monitor autophagic flux. Cells undergoing autophagy should demonstrate the co-localization of p62, LC3, and lysosomal markers. Immunofluorescence microscopy has been used to visually identify LC3 puncta, p62, and/or lysosomes on a per-cell basis. However, an objective and statistically rigorous assessment can be difficult to obtain. To overcome these problems, multispectral imaging flow cytometry was used along with an analytical feature that compares the bright detail images from three autophagy markers (LC3, p62 and lysosomal LAMP1) and quantifies their co-localization, in combination with LC3 spot counting to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Here, multispectral imaging flow cytometry with an analytical feature that compares bright detail images of 3 autophagy markers and quantifies their co-localization, along with LC3 spot counting, was used to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. Therapeutic options addressing the causes of muscular dystrophy pathogenesis are expected to alleviate muscle degeneration. Therefore, a method to assay and quantify the extent of cell death in muscle biopsies is needed. Conventional methods to observe myofiber degeneration in situ are either poorly quantitative or rely on the injection of vital dyes. In this article, an immunofluorescence protocol is described that stains necrotic myofibers by targeting immunoglobulin G (IgG) uptake by myofibers. The IgG uptake method is based on cell features characterizing the necrotic demise, including 1) the loss of plasma membrane integrity with the release of damage-associated molecular patterns and 2) the uptake of plasmatic proteins. In murine cross-sections, the co-immunolabelling of myofibers, extracellular matrix proteins, and mouse IgG allows clean and straightforward identification of myofibers with necrotic fate. This simple method is suitable for quantitative analysis and applicable to all species, including human samples, and does not require the injection of vital dye. The staining of necrotic myofibers by IgG uptake can also be paired with other co-immunolabelling.

Described here is a protocol for direct immunolabelling of necrotic myofibers in muscle cryosections. Necrotic cells are permeable to serum proteins, including immunoglobulin G (IgG). Revealing the uptake of IgG by myofibers allows the identification and quantification of myofibers that undergo necrosis regardless of muscle condition.

근육 생검에 있는 면역 표지하는 Myofiber 변성

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

줄기세포와 그 틈새를 배양하기 위한 쥐의 골격근 수확

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

저자 스포트라이트: Niche Components를 이용한 정지 근육 줄기 세포 배양을 위한 Ex Vivo 프로토콜 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...