The authors would like to thank Drs. Helene Salmon and Miriam Merad from Icahn School of Medicine at Mount Sinai for providing the B16-F10-YFP cells and for their expert advice on melanoma mouse models. The authors further thank the Animal Imaging Core Facility, the Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility, and the Molecular Cytology Core Facility at Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) for their support. This work was supported by National Institutes of Health grants NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) and P30 CA008748 (MSK Center Grant). The authors also thank the Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT) at MSK for their financial support (T.R.).

절차는 나노 입자의 이중 방사성 형광 라벨, 생체 내 PET-CT 영상, 생체 생체 분포를 측정하고, 생체 면역 구성 및 유세포 분석. 모든 동물 실험은 메모리얼 슬론 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 이중 표지 된 리포좀 1. 준비 주 : 동계 B16 흑색 종 종양은 2 % -isoflurane 함유 산소를 흡입 마취로부터 C57BL / 6 마우스의 후방 측면에 30 B16-F10 세포를 주입함으로써 발생 될 수있다. 수술 중 멸균 작업 공간에서 멸균 시약 및 도구를 사용합니다. 수술 후주의 깊게 마취에서 그들의 회복 될 때까지 동물을 관찰한다. 그들은 전체 의식과 이동성을 회복하는 경우에만 다시 자신의 새장에 동물을 넣습니다. 이종 이식 종양 동물 용 살균 객실을 수용. 크기와 종양300mm의 3에 의한 나노 입자의 축적을 증가시킬 수 있습니다 자신의 발음 향상된 투자율 및 유지 효과 (EPR)에 나노 입자의 특성에 적합하다. 자세한 프로토콜은 아래에 제공됩니다. <ol><li> 둥근 바닥 플라스크에 들어있는 클로로포름 1,2- dipalmitoyl- SN -glycero -3- phophocholine (DPPC), 콜레스테롤, 1,2- disearoyl- SN -glycero- 2 ㎖에 지질의 20 mg의 혼합물을 용해 3 phosphoethanolamine - 폴리 (에틸렌 글리콜) 2000 (PEG2000-DSPE) DSPE-데페 록 사민 (DSPE-DFO) 8 및 1,1- diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine -5,5- 디설 폰산 ( DiIC12 [5]는 각각 61.3 %, 33.4 %, 5, 0.2 % 및 0.1 %의 몰비로) -ds. 참고 :이 지질 조성물은 현재 임상 2에 사용 된 독소루비신의 리포좀 제형과 매우 유사합니다. 우리의 과정에서 생성 된 리포좀은 밀접하게 임상 nanomedic의 생체 성능을 모방합니다오프라인. </li><li> 유기 용매를 제거하고, 실온에서 얇은 지질막을 형성하는 회전 증발기를 사용한다. PBS 20 mL를 넣고 30 분 동안 초음파 처리 얼음에 충분한 냉각과 3.8 mm의 초음파 팁 30 W의 진폭을 이용하여 나노 리포좀을 생성한다. </li><li> 원심 분리기 집계를 제거하고 세척 PBS는 원심 여과 (분자량 컷 - 오프 (MWCO 사용과 나노 입자 10 분 동안 4,000 XG에 리포좀 용액 : 어떤 것, 리포좀 무료 지질 및 잔류 유기 용매를 제거하기 위해 100 kDa의)을 집중. 상부 챔버 내에서 유지되고 새로운 튜브로 옮긴다. 리포좀은 후속 단계 전에 1 주 동안 PBS에서 냉장고에 저장 될 수있다. </li><li> 품질 관리, 동적 광산란 (DLS)으로 리포좀을 특성화. 특히, PBS 950 μL와 리포좀의 50 μL를 혼합 한 다음 크기 조정 큐벳에 혼합물을 전송합니다. 분석기에 큐벳을 놓고 입자를 측정크기 및 크기 분포. 각각 0.2 - 120 nm이고, 0.1 - 입자 크기 및 크기 분포 (다 분산도 지수 (PDI)가) 90이 될 것으로 예상된다. </li><li> 방사성 표지의 경우, (1.5 ㎖의 튜브에서 2 시간 동안 37 ° C에서 1 mCi의 89 ZR-옥살산 6.9와 7.1 사이의 pH에서 총 부피를 PBS 지질 2 ㎎에 상응 정제 리포좀, 혼합 ~ 100 μL). 1.3 단계와 유사 원심 여과 (MWCO = 100 kDa의)에 의해 자유, 미 반응 89 ZR을 제거합니다. 멸균 PBS와 잔류 물을 씻고 원하는 볼륨에 희석. 95 % - 방사 화학적 수율은 80해야한다. 주의! 방사성 물질로 작업하는 것은 매우 조절된다. 금융 기관은 인증하고 필요한 시설, 인력 교육, 방사능 사용의 엄격한 모니터링을 제공해야합니다. 연구자들은 적절한 교육을 받고 방사능을 처리 할 때 개인 보호 장비 및 선량 반지 / 배지를 착용해야합니다. </li><li&gt; 일반적으로 98 % 10 이상이어야한다 크기 배제 라디오-HPLC에 의해 방사성 표지 된 리포좀의 방사 화학적 순도를 결정합니다. 95 %보다 낮은 방사 화학적 순도는 단계 1.5에 불충분 한 세척을 나타내는입니다. </li><li> 방사성 표지 한 후, 동적 광산란에 의한 나노 입자의 크기를 결정한다. 크기 및 PDI는 1.4 단계 (10)에서의 측정과 동일한 범위 내에있을 것으로 예상된다. 주 : 방사성 샘플을 유동 세포 계측기 또는 형광 현미경을 허용하지 않는 경우, 비 - 방사성 NAT ZR-옥살 단계 1.5 리포좀 라벨을 사용할 수있다. 이러한 비 방사성 리포좀은 방사성 유사체와 동일한 특성을 갖는다. 이 절차의 묘사는도 2에 제공된다. </li></ol> 이중 표지 된 리포좀의 생체 PET-CT 영상 및 생체 분포 2. <ol><li> w 이중 표지 리포좀의 약 100 μL를 주입i 번째 구속 흑색 종 쥐에 방사능의 약 300 μCi를 - 약 10 mCi의 89 ZR / 체중 kg에서 자신의 꼬리 정맥을 통해 (C57BL / 6, 여성, 1016 주 이전). </li><li> 반감기를 결정하기 위해, 28-G 인슐린 주사기를 사용하여 2 % 이소 플루 란 하에서 산소 - 함유 마취 동물의 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취. 2 분, 15 분, 1 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간, 및 주입 후 48 시간에서 미리 칭량 튜브 - (20 μL 10)에 혈액을 수집한다. , 차에 의해 피 계량 감마 계수기를 사용하여 방사능 콘텐츠를 결정하고, g 당 주입 도즈 (%의 ID / g)의 비율로 방사능 농도를 계산한다. 주 : 마취 시스템, 복구 케이지, 난방 및 생물 학적 후드가 장착 된 방에서 절차를 수행합니다. 동물이 완전히 복구하고 새장을 들고에 복구 케이지에서 그들을 전송하기 전에 시술 후 정상 이동성을 얻을 수 있는지 확인합니다. 하우스 투여 동물 지정된 객실에서 종양 베어링 동물방사성 물질. </li><li> 24 또는 48 시간의 주입 후 작은 동물 MicroPET-CT 스캐너 (10) 리포좀, 이미지 마우스. 그 배에 수평으로 마취 된 동물을 놓고 마취를 유지. 코 콘을 통해 2 % 이소 플루 란 산소를 관리 할 수 ​​있습니다. 건조에서 그들을 방지하기 위해 스캔 전에 눈 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 15 분의 대략적인 시간과 함께, 전신 PET 정적 스캔 기록 적어도 5000 만 일치하는 이벤트를 수행한다. 각각 350-700 keV의 6 ns의에서 에너지와 우연의 일치 타이밍 창을 설정합니다. 그 후, 5 분 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 검사를 수행합니다. 80 kV의 500 μA의 전류의 전압으로 X 선 튜브를 설정; 중부 표준시 스캔은 프레임 (10) 당 약 145 밀리로, 220도 총 120 회전 단계를 사용합니다. </li><li> 애완 동물-CT 검사 후 즉시 이산화탄소 질식하여 쥐를 희생하고 pinchi에 의해 죽음을 확인동물의 발을 ng를. 확인되면, 자궁 경부 전위를 수행합니다. </li><li> 먼저 좌심실에 20 mL의 PBS를 주입 한 후 우심방을 열고 절단하여 마우스 조직에서 혈액을 제거하고 이후 종양, 간, 비장, 폐, 신장, 근육, 등 16 관련 조직을 수집합니다. </li><li> 상기 조직 무게 (8, 9)를 계산하여 그 감마 방사능 함량을 측정하고, g 당 주입 도즈 (%의 ID / g)의 비율로 조직 방사능 축적량을 계산한다. </li></ol> 3. 예 생체 유동 세포 계측법 및 면역 염색 주 : 체중 kg 당 0.5 mg의 염료의 투여 량으로 꼬리 정맥을 통하여 마우스에 흑색 형광 리포좀 100 μL를 주입한다. 방사성 샘플을 유동 세포 계측기 및 형광 현미경으로 허용되지 않는 경우, 비 - 방사성 리포좀이 사용되어야한다. <ol><li> 단계 2.5에서와 같이, 마우스 24 시간 후 주입을 희생하고 차가운 PBS에 저장해야 종양를 수집합니다. </li><li> 유동 세포 계측법에 대해 다음 단계 17를 따르십시오 <ol><li> 0.5 % BSA 및 1 (PBS 완충액 유세포에서 정제 된 콜라게나 제 I 및 II (4 U / ㎖), 히알루로 (60 U / ㎖)의 DNase I (60 U / ㎖)의 혼합물로 이루어진 효소 칵테일 준비 mM의 EDTA). </li><li> 1.5 ㎖의 튜브에 효소 칵테일 버퍼 200 μL와 종양 조직 100 mg의 혼합 및 미세 가위로 작은 조각으로 조직을 주사위. 튜브에 효소 칵테일의 또 다른 1.3 mL를 넣고 및 6 웰 플레이트에 그 내용을 전송합니다. </li><li> 60 rpm에서 60 분 동안 37 ℃로 오븐 내부에 배치 수평 진탕 기에서 6 웰 플레이트를 흔들어. </li><li> 단일 세포 현탁액을 얻었다 유세포 버퍼로 3 회 조직 파쇄 액을 씻는다. </li><li> 특정 CD45, CD11b를, Ly6C, 중 CD11c 포함하는 바이오 마커에 대한 항체의 칵테일 세포를 얼룩,CD64, CD3, MHCII와 CD31 (1 : 모든 항체 (200) 희석, 복제 정보가 재료 스프레드 시트에서 제공된다). 중요한 세포 유형을 확인하고 (5) 분석 소프트웨어 계측법 적절한 흐름 각 세포 집단에서 -ds DiIC12들의 평균 형광 강도 (MFI)를 결정한다. </li></ol></li><li> 면역 염색의 경우, 다음 단계를 수행하십시오 : <ol><li> 최적의 절단 매체 OCT ()로 채워진 카세트에 종양을 놓고 드라이 아이스에 동결. </li><li> 종양 조직에서 6 μm의 냉동 섹션을 확인하고 조직학 유리 슬라이드에 배치; 섹션은 조직의 대표적인 정보를 제공하는 종양의 가장 큰 단면을 커버한다. </li><li> 바이오 마커를 얼룩 (예를 들어, 내피 세포에 대한 CD31)에 대응하는 항체 (예를 들어, 항 CD31, 복제 MEC13.3)에 관심. 파라 포름 알데히드와 섹션을 수정; 혈청 보조 항체의 종의 기원을 일치로를 차단; incub4 ° C에서 12 시간 동안 차 항체와 식사를 한 후 2 시간 동안 차 항체; 그리고 마지막으로, PBS로 씻어 커버 전표로 커버. 이미지 라이카 똑바로 공 촛점 SP5 현미경 (13), (16)와 스테인드 슬라이드. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have no disclosure to make.

프로토콜 내에서 중요한 단계 : 이중 표지 된 리포좀의 높은 품질이 장기간에 걸쳐 일관된 결과를 생성하는 열쇠이다. 무료 형광 염료 또는 (89) 지르코늄 이온은 완전히 다른 타겟팅 패턴을 생성 할 수있는 완전히 정제 단계 동안 제거되어야한다. 면역계는 훨씬 실험 암 나노 의학 성능에 영향을 미치는지 또한, 면역 적격 마우스 모델의 사용은이 프로토콜에서 사용 된 ...

나노 의학은 암 치료 개발 한 패러다임 시프트된다. 이러한 liposome- 및 알부민 기반 nanotherapies 2, 3 등의 이전 암 나노 의학의 엄청난 임상 적 충격에 의해 영감을 많은 새로운 제형은 지난 10 년간 생산되고있다. 그러나, 이들 나노 의학 암의 임상 변환 성공의 최근의 분석은 이들 중 일부만 임상 -4,5- 승인 된 것을 나타낸다. 새로운 암 나노 의학의 임상 번역 한 주요 장애물이없는 치료 학적 화합물 (6)의 직접 투여와 비교하여 치료 지수의 제한된 개량이다. 전임상 동물 모델에서 전신 조직에 나노 의학 및 세포 수준의 생체 내 성능 등 정확한 평가로서 IDENTIF에 필수적인Y 미래 임상 번역에 대한 최적의 치료 지수 가진 사람. 나노 물질은 모든 임상 이미징 양식 (7) 중 뛰어난 감도와 재현성을 가지고 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상으로 살아있는 동물에서 양적 특성에 대한 방사성 표지가 될 수 있습니다. 예를 들어, 89 나노 의학 암 (8, 9), (10)뿐만 아니라 다른 질병 모델 (11)에 대한 마우스 모델에서 특성화되었다 긴 순환 ZR은 표지. 또한, 나노 의학의 혈중 반감기 및 생체 분포는 광범위 개별 조직 8 생체 방사능을 측정하여 평가할 수있다. 따라서, 방사성 표지는 체계적이고 조직 수준에서 나노 의학의 정량적 평가를 할 수 있습니다. 중요한 것은, radiolabeleD 나노 의학은 일반적으로 인한 방사성 신호의 제한된 공간 해상도로 단일 세포 또는 세포 내 수준에서 분석 될 수 없다. 따라서, 형광 표식은 유동 세포 계측법 및 형광 현미경 (12)와 같은 광학 이미징 기술과 나노 입자의 평가 상보 양상 것을 안다. 이를 위해, 방사성 동위 원소 및 형광 태그로 표지 된 나노 입자는 정량적 핵 촬상하여 생체 내에서 평가 될 수 있고, 생체 방사능 계수에 의해, 이들은 광범위하게 결상에 의한 세포 수준에서 특성화 될 수있다. 이전에는, 고밀도 지단백질 (HDL) (11), 리포좀 (9), (10) 고분자 나노 입자, 항체 단편, 및 nanoemu 등 다양한 나노 입자에 방사성 형광 라벨을 포함하는 모듈 식 절차를 개발lsions 10, 13. 이 라벨이 나노 입자는 특정 응용 프로그램에 대해 이러한 나노 물질의 최적화를 유도 서로 다른 수준에서 관련 동물 모델에서 양적 특성 허용했다. 현재 연구에서, 그 목적은 가장 확립 나노 의학 플랫폼 14 이중 표지 된 나노 입자를 생성하는 광범위한 방법을 설명하는 일례를 가득 차거나 철저히 고전 동계 흑색 종 B16-F10의 마우스 모델 (15)을 특성화하는 리포좀 - 더 나노 입자를 사용하는 . 결과로부터, 우리는이 나노 입자를 특성화 방법 관련 마우스 모델에서 다른 암 나노 의학 평가하도록 구성 될 수 있다고 확신한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPPC</td>
			<td style="width:136px;">Avantilipids</td>
			<td align="right" style="width:119px;">850355</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DSPE-PEG2000</td>
			<td style="width:136px;">Avantilipids</td>
			<td style="width:119px;">880120P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DSPE-DFO</td>
			<td style="width:136px;">Home made</td>
			<td align="right" style="width:119px;">110634</td>
			<td>Perez-Medina et al, JNM, 2014</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DiIC12[5]-DS</td>
			<td style="width:136px;">AAT Bioquest</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:136px;">Vivaproducts</td>
			<td style="width:119px;">VS2061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td style="width:136px;">Buchi</td>
			<td style="width:119px;">R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Radio-HPLC</td>
			<td style="width:136px;">Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">89Zr-oxalate</td>
			<td style="width:136px;">MSKCC</td>
			<td style="width:119px;">Synthesized in house</td>
			<td>TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micro PET-CT</td>
			<td style="width:136px;">Siemens</td>
			<td style="width:119px;">Inveon Micro-PET/CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gamma counter</td>
			<td style="width:136px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">2470-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flow cytometry</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">Fortessa</td>
			<td>Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:136px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B16-YFP melanoma cells</td>
			<td style="width:136px;">Home made</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Salmon et al, Immunity, 2016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7</td>
			<td align="right" style="width:136px;">128025</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MHCII (M5/114/152)--APC</td>
			<td align="right" style="width:136px;">107613</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45 (30-F11)--BV510</td>
			<td align="right" style="width:136px;">103137</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7</td>
			<td align="right" style="width:136px;">139313</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11b (M1/70)--BV605</td>
			<td align="right" style="width:136px;">101237</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD3 (17A2)--BV711</td>
			<td align="right" style="width:136px;">100241</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD31 (13.3)--PE</td>
			<td align="right" style="width:136px;">561073</td>
			<td style="width:119px;">Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5</td>
			<td align="right" style="width:136px;">117327</td>
			<td style="width:119px;">BD Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD31 (13.3) no fluorophore</td>
			<td align="right" style="width:136px;">550274</td>
			<td style="width:119px;">BD Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comprehensive procedure to evaluate the in vivo performance of cancer nanomedicines

병원에서 이전 암 나노 의학의 성공에 의해 영감을, 연구진은 지난 10 년간 새로운 제형의 큰 숫자를 생성했다. 임상 개발중인 나노 의학의 대부분 실망스러운 결과를 생산하는 반면, 나노 의학의 단지 소수의 임상 사용이 승인되었다. 새로운 암 나노 의학의 성공적인 임상 번역 한 주요 장애물은 생체 내 성능의 정확한 이해의 부족이다. 이 문서는 양전자 방출 단층 촬영 - 컴퓨터 단층 촬영 (PET-CT), 방사능 정량 방법의 통합을 통해 조직, 조직, 단일 세포 및 세포 내 수준에서 종양 베어링 마우스의 나노 의학의 생체 내 동작을 특성화하기 위해 엄격한 절차를 제공합니다 , 유동 세포 계측법 및 형광 현미경. 이 방법을 사용하여, 연구자들은 정확하게 cance의 중요한 마우스 모델에서 신규 한 나노 조성물을 평가할 수있다아르 자형. 이러한 프로토콜은 높은 병진 전위 가장 유망한 암 나노 의학을 식별하거나 미래 번역 암 나노 의학의 최적화를 도울 수있는 능력을 가질 수있다.

그림 1은 절차의 개요를 보여줍니다. 도 2는 단계 1 내지 10에 기술 된 이중 표지 된 리포솜의 개략적 인 합성 방법을 제시한다. 그림에서 2 단계에 설명 된대로 3 표시 대표적인 PET-CT 이미지 (그림 3a), PET 영상 (그림 3B), 혈중 반감기 (도 3c), 방사성 나노 입자의 생체 분...

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

포괄적 인 절차를 평가하는<em&gt; 생체</em&gt; 암 나노 의학의 성능

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

8.8K 조회수.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

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Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트<em&gt; 다니오 레 리오</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

연구

암 연구학

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic probes to provide quantitative information on the chemical tumor microenvironment (TME), including pO2, pH, redox status, concentrations of interstitial inorganic phosphate (Pi), and intracellular glutathione (GSH). In particular, an application of a recently developed soluble multifunctional trityl probe provides unsurpassed opportunity for in vivo concurrent measurements of pH, pO2 and Pi in Extracellular space (HOPE probe). The measurements of three parameters using a single probe allow for their correlation analyses independent of probe distribution and time of the measurements.

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Low-field (L-band, 1.2 GHz) electron paramagnetic resonance using soluble nitroxyl and trityl probes is demonstrated for assessment of physiologically important parameters in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.

Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human central nervous system (CNS). However, both the cytological origin and the evolutionary process of HBs (including neovascularization) remain controversial, and anti-angiogenesis for VHL-HBs, based on classic HB angiogenesis, have produced disappointing results in clinical trials. One major obstacle to the successful clinical translation of anti-vascular treatment is the lack of a thorough understanding of neovascularization in this vascular tumor. In this article, we present a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in HBs, as well as its role in HBs. With this procedure, researchers can accurately understand the complexity of HB neovascularization and identify the function of this common form of angiogenesis in HBs. These protocols can be used to evaluate the most promising anti-vascular therapy for tumors, which has high translational potential either for tumors treatment or for aiding in the optimization of the anti-angiogenic treatment for HBs in future translations. The results highlight the complexity of HB neovascularization and suggest that this common form angiogenesis is only a complementary mechanism in HB neovascularization.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

This paper presents a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in hemangioblastomas (HBs) and its role in HBs. The results highlight the complexity of HB-neovascularization and suggest that this common form of angiogenesis is only a complementary mechanism in the HB-neovascularization.

분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ever-increasing number of studies have identified miRNAs as potential biomarkers for cancer diagnosis and prognosis, and also as therapeutic targets, adding an extra dimension to cancer evaluation and treatment. In the context of thyroid cancer, tumorigenesis results not only from mutations in important genes, but also from the overexpression of many miRNAs. Accordingly, the role of miRNAs in the control of thyroid gene expression is evolving as an important mechanism in cancer. Herein, we present a protocol to examine the effects of miRNA-inhibitor delivery as a therapeutic modality in thyroid cancer using human tumor xenograft and orthotopic mouse models. After engineering stable thyroid tumoral cells expressing GFP and luciferase, cells are injected into nude mice to develop tumors, which can be followed by bioluminescence. The in vivo inhibition of a miRNA can reduce tumor growth and upregulate miRNA gene targets. This method can be used to assess the importance of a determined miRNA in vivo, in addition to identifying new therapeutic targets.

This protocol describes xenograft and orthotopic mouse models of human thyroid tumorigenesis as a platform to test microRNA-based inhibitor treatments. This approach is ideal to study the function of non-coding RNAs and their potential as new therapeutic targets.

쥐에서 종양 성장을 감소 하는 MicroRNA의 생체 내 억제

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer growth and metastasis. Paracrine signals can involve cell-cell contact between different cell types, such as PD-L1 expressed on the surface of tumors interacting directly with PD-1 on the surface of T cells, or the secretion of ligands by a tumor cell to affect an immune cell. Here we describe a co-culture method to interrogate the effects of tumor-secreted ligands on immune cell (macrophage) activation. This straightforward procedure utilizes commercially available 0.4 &#181;m polycarbonate membrane permeable supports and standard tissue culture plates. In the process described, macrophages are cultured in the upper chamber and tumor cells in the lower chamber. The presence of the 0.4 &#181;m barrier allows for the study of intercellular signaling without the confounding variable of physical contact, because the two cell types share the same medium and exposure to paracrine ligands. This approach can be combined with others, such as genetic alterations of the macrophage (e.g., isolation from genetic knock-out mice) or tumor (e.g., CRISPR-mediated alterations) to study the role of specific secreted factors and receptors. The approach also lends itself to standard molecular biological analyses such as quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) or Western blot analysis, without the need for flow sorting to separate the two cell populations. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) can similarly be utilized to measure secreted ligands to better understand the dynamic interaction of cell signaling in the multiple cell type context. Duration of co-culture can also be varied for the study of temporally regulated events. This co-culture method is a robust tool that facilitates the study of tumor-secreted signals in the immune context.

Here, we present a method using permeable membrane supports to facilitate the study of non-contact paracrine signaling used by tumor cells to suppress the immune response. The system is amenable to studying the role of tumor-secreted factors in dampening macrophage activation.

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

두개 내 주입 및 자기 공명 이미징을 통해 뇌 전이를 모델링

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory cytokine interleukin-1 alpha (IL-1&#945;) has been evaluated as an anticancer agent in several preclinical and clinical studies. However, dose-limiting toxicities, including flu-like symptoms and hypotension, have dampened the enthusiasm for this therapeutic strategy. Polyanhydride nanoparticle (NP)-based delivery of IL-1&#945; would represent an effective approach in this context since this may allow for a slow and controlled release of IL-1&#945; systemically while reducing toxic side effects. Here an analysis of the antitumor activity of IL-1&#945;-loaded polyanhydride NPs in a head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) syngeneic mouse model is described. Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells were injected subcutaneously into the right flank of C57BL/6J mice. Once tumors reached 3-4 mm in any direction, a 1.5% IL-1a - loaded 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) nanoparticle (IL-1&#945;-NP) formulation was administered to mice intraperitoneally. Tumor size and body weight were continuously measured until tumor size or weight loss reached euthanasia criteria. Blood samples were taken to evaluate antitumor immune responses by submandibular venipuncture, and inflammatory cytokines were measured through cytokine multiplex assays. Tumor and inguinal lymph nodes were resected and homogenized into a single-cell suspension to analyze various immune cells through multicolor flow cytometry. These standard methods will allow investigators to study the antitumor immune response and potential mechanism of immunostimulatory NPs and other immunotherapy agents for cancer treatment.

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

A standard protocol is described to study the antitumor activity and associated toxicity of IL-1&#945; in a syngeneic mouse model of HNSCC.

폴리안하이드라이드 IL-1α 나노입자의 생체 내 항종양 활성 평가

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

포괄적 인 절차를 평가하는

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Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트

Vivo에서 PH, pO₂, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가