저자는 현미경으로 도움말에 대 한 핵심 시설을 이미징 DRI에서 마 샤 Boulina 감사 합니다. 이 작품은 NIH 교부 금 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 및 R56 DK084321 (AC)에 의해 지원 되었다.

마이애미 대학의 동물 윤리 위원회는 모든 실험을 승인 했습니다.
 1. 바이러스 성 감염의 그대로 고립 된 인간 또는 마우스 췌 장 독도 <ol><li>섬 문화: 섬 문화 미디어 준비: Connaught 의료 연구 실험실 (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS 및 2 m L-글루타민.
	<ol><li>인간 췌 장 독도 통합 섬 배포 프로그램 (NIDDK, NIH)에서 얻을 수 있습니다. 도착 시 전송는 독도 (~ 500 섬 등가물) 35 m m 비-조직 문화 취급 37 ° C에서 2 mL CMRL 문화 미디어, 바이러스 성 감염 하기 전에 24 시간을 위한 5%/95% CO 2 /O 2 접시.</li>
		<li>마우스 췌 장 독도 이전 설립된 프로토콜 16 다음 격리 될 수 있습니다. 절연, 다음 문화 ~ 200 섬 등가물에 35 m m 비-조직 문화 취급 37 ° C에서 2 mL CMRL 문화 미디어, 바이러스 성 감염 하기 전에 24 시간을 위한 5%/95% CO 2 /O 2 접시. 
		참고: NPY pHluorin와 형광 중복을 피하기 위해 독도 GFP 또는 YFP 기자 들과 유전자 변형 마우스를 사용 하지 마십시오.</li>
	</ol></li> <li>바이러스 준비 참고: NPY pHluorin 퓨전 pcDNA3 벡터 10으로 복제 되었고 adenoviral 생산 adenoviral vector에 subcloned [아 데 노비 루스 serotype 5 (DE1/E3)] 재조합 아 데 노 바이러스에 의해 제조 회사입니다. 바이러스는 aliquoted 및-80 ° c.에 저장 바이러스 성 재고 10 titers에서 회사에 의해 제공 됩니다 12 10 13 바이러스 성 입자 (~ 3 × 10 10-3 x 10 11 PFU).
	<ol><li>에 대 한 생체 외에서 섬, 사용 10 6 PFU/mL, 감염 (MOI)의 대략적인 다양성의 약 2 (자세한 토론 참조) 결과</li></ol></li>
	<li>췌 장 독도의 바이러스 성 감염 
	주의: 작업 adenoviruses Biosafety 수준 2 (BSL2) 절차와 인증을 요구 한다. 지도와 BSL2 절차에 대 한 교육 기관 Biosafety 장교와 확인 하십시오.
	<ol><li>위에서 설명한 대로 인간/마우스 독도 준비.</li>
		<li>추가 5-10 µ L 재고 바이러스의 인간/마우스 독도 CMRL 문화 미디어의 (10 %FBS 2 mM L-글루타민) 2 mL에 포함 된 각 35 mm 페 트리 접시. 
		참고: 바이러스 titer에 따라 사용 하는 회사 데이터 시트에서 제공 하는 바이러스의 볼륨 조절.</li>
		<li>포함 하는 바이러스에서 독도 문화 24 h. 위해 37 °C/5% CO 2 미디어</li>
		<li>후 24 h 발음 바이러스 포함 된 미디어 및 (와 함께 10 %FBS 2 mM L-글루타민) 2 mL CMRL 문화 미디어 바꿉니다.</li>
		<li>4-6 일 37 °C/5% CO 2, 대체 미디어 매 3 일에는 독도 문화.</li>
		<li>후 4-6 일 경작의 기대 주위 감염 되는 작은 섬 세포의 30%. 독도 라이브 이미징 실험에 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 2. Confocal 이미징의 감염 독도 참고: confocal 영상에 필요한 장비와 재료에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.
<ol><li>시 약 준비 및 실험적인 체제 <ol><li>준비 extracellular 솔루션: pH 7.4, 살 균 필터링 추가 125 mM NaCl, 5.9 m m KCl, 2.56 m m CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25mm HEPES, 0.1 %BSA. 
		참고:이 버퍼는 일반적으로 포도 당 없이 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 포도 당 원하는 최종 농도 도달 하는 실험의 날에 추가 됩니다.
		<ol><li>준비 기저 포도 (3mm) 매체: extracellular 솔루션 50 mL에 2 M 포도 당 재고의 75 µ L을 추가.</li>
			<li>Hyperglycemic (16mm) 매체: extracellular 솔루션 50 mL에 2 M 포도 당 재고의 400 µ L를 추가</li></ol>
		</li> <li>3mm 포도 당을 포함 하는 extracellular 해결책에 어떤 추가 자극 (예를 들어, KCl 또는 아데노신 3 인산 염 (ATP)) 희석.</li>
		<li>실험을 시작 하기 전에 1 h coverslip를 폴 리-D-리 솔루션 (1 mg/mL)의 30 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 H 2 o.와 그것을 rinsing 하 여 폴 리-D-리와 coverslips을 pretreat 
		참고: 폴 리 코팅 coverslips 저장할 수 있습니다 실 온에서 6 개월까지.</li>
		<li>1 mL 피 펫을 사용 하 여 실험 하기 전에 적어도 1 시간 35 mm 페 트리 접시 3 mM 포도 당을 세포 외 솔루션을 포함 하는 독도 전송 합니다. 37 ° C, 5% CO 2에 독도 유지. 
		참고: 필요한 경우, 원형질 막이이 단계에서 표시 수 있습니다. 원형질 막에 레이블을, 3 mM 포도 당을 세포 외 솔루션 2 µ M 디-8-ANEPP 염료를 추가 합니다. 37 °C/5% CO 2에서 1 시간을 위한 염료 해결책에서 독도 품 어. 488에서 원형질 막 염료를 흥분 수 nm와 620에서 nm.</li>
		<li>분 실험을 시작 하기 전에 부착는 coverslip 이미징 챔버를 진공 실리콘 그리스와 씰링 합니다. 이미징 플랫폼 이미징 챔버를 수정 합니다. 20 분에 대 한 표면에는 독도 준수 coverslip의 폴 리 D Lysine 치료 영역에 20-30 독도 배치를 피 펫을 사용 하 여 
		참고: 그것은 중요 coverslip 섬 손상을 피하기 위하여 완전히 건조 하 게 하지 않습니다.</li>
		<li>는 독도 coverslip 준수는 하는 동안 철저 하 게 물으로 헹 궈 서 관류 시스템을 준비 합니다. 다른 채널에 추가 하는 각 솔루션: 3 mM 포도 당 (1 채널), 16 mM 포도 당 (2 채널), 16 mM 포도 당 100 µ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)와 10 µ M 산림 (채널 3), 3 mM 포도 당 (채널 4), 3 mM 포도 당 (에서 10 µ M ATP에에서 25 m m KCl 채널 5)입니다. 각 채널을 개별적으로 열고 몇 분 동안 솔루션 흐름을 보내는 여 시스템에서 모든 거품을 제거 하 고 흐름 일관 (0.5 mL/min) 이며 튜브 유출 되지 않습니다 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>관류 콘센트 튜브에 단일 인라인 솔루션 히터를 연결 하 고 37 outflowing 버퍼의 온도 조정 ° c.</li>
		<li>흡입 펌프를 준비합니다. 시스템에서 모든 거품을 제거 하 고 흐름은 일관 되 고 튜브 유출 되지 않습니다 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>는 독도 coverslip 표면에 고착 되 면 부드럽게 채워 이미징 챔버를 3 mM 포도 당을 포함 하는 세포 외 솔루션. 독도 coverslip의 표면에서 세척 하지 마십시오.</li>
		<li>현미경 단계에 독도와 이미징 플랫폼을 배치 하 고 관류 시스템 및 흡입 펌프에 연결.</li>
		<li>차례 흐름에 그리고 끊임없이 perfuse 3 세대 extracellular 솔루션 독도. 시스템은 이제 confocal 영상에 대 한 준비.</li>
	</ol></li> <li>Confocal 영상 <ol><li>낮은 확대와 함께 현미경 분야에는 독도 찾습니다. 일단는 독도에 초점, 더 높은 확대 목표 전환 (예를 들어, 63 X 물 침수 목표 (63 X / 0.9 없음)).</li>
		<li>소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 인수를 열고 공명 스캐너 모드 활성화.</li>
		<li>XYZT 영상 모드를 선택 하 고 인수 설정을 다음과 같이 구성: <ol><li>설정에 아르곤 레이저와 488 nm 레이저 라인과 레이저 파워 pHluorin 여기에 대 한 50%를 조정.</li>
			<li>505-555 nm에 방출 수집.</li>
			<li>는 512 x 512 픽셀의 해상도 선택합니다. 보도 &#34; 라이브 &#34; 이미징 시작 (일반적인 이득은 약 600 V) 이득 레벨을 조정할을.</li>
			<li>설정 시작 및 z 스택의 끝:는 섬 위에 집중 하 고 선택 &#34; 시작 &#34; 마지막 집중 될 수 있는 선택 평면 이동 &#34; 끝 &#34;. 5 µ m의 z 단계 크기를 사용 합니다. 소프트웨어 자동으로 confocal 비행기의 수를 계산 합니다.</li>
			<li>1.5-2 s에 가까운 각 z 스택의 인수에 대 한 시간 간격을 설정 하 고 옵션 선택 &#34; 멈출 때까지 취득 &#34; 연속 이미징.</li>
			<li>보도 &#34; 시작 &#34; ini 버튼tialize.</li>
		</ol></li> <li>다양 한 자극 프로토콜을 사용 하 여 원하는 자극으로 독도 perfusing 하 여과 립 exocytosis를 유도. 자극 프로토콜 원하는 과학적 목적 (아래 참조)에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>자극 프로토콜 참고: 3 mM 포도 당을 포함 하는 extracellular 솔루션과 지속적인 관류 동안 섬 배경 활동의 적어도 2 분을 기록 하 여 시작 하는 모든 자극 프로토콜에서. 원하는 기간에 대 한 자극 제와 perfuse. 각성제의 순서, 자극의 지속 시간 녹음 기간 원하는 과학적 목적에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다. 새로운 자극을 시작 하기 전에 3 mM 포도 당을 포함 하는 extracellular 솔루션과 독도 씻어 있는지 확인 하십시오. 아래 샘플 자극 프로토콜 메서드 기능을 보여 주기 위해 사용 되었습니다을 찾아.
	<ol>PHluorin pH 감도 및 바이러스 감염 효율 ( 그림 3)에 대 한 긍정적인 제어로 염화 암모늄 (NH 4 Cl)와 <li>Stimulate: 3 mM 포도 당 (2 분) &#8594; 50mm NH 4 Cl (2 분)에 3 mM 포도 당 &#8594; 포도 당 3 m m (2 분) 참고: NH에서 4 Cl 솔루션, 아데닌 기초에 NaCl을 대체.</li>
		<li>Stimulate ( 그림 5 및 그림 6) 포도 당 농도 증가 시켜 인슐린과 립 exocytosis: 3 mM 포도 당 (2 분) &#8594; 16 m m 포도 당 (15-30 분) &#8594; 3 m m 포도 당 (2 분 
		참고: 적어도 15 분에 대 한 16 G 솔루션으로 지속적으로 독도 perfuse 활동의 몇몇 파열을 보려면 
		참고: 분 비 응답 17의 일관성을 증가 하기 위하여 사용자가 3g와 16 G 솔루션 캠프 모금 에이전트 (100 µ M IBMX 및 10 µ M 산림)를 추가할 수 있습니다. 이 립 분 비의 시간적 패턴을 변경 하지 않습니다. 내용은 15와 토론을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+insulin+granule+biogenesis+and+exocytosis.">Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis.</a> Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).</li><li>Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta-cell+identity,+glucose+sensing+and+the+control+of+insulin+secretion.">Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion.</a> Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).</li><li>Rorsman, P., Renstrom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+granule+dynamics+in+pancreatic+beta+cells.">Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).</li><li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet.">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).</li><li>Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vti1a+identifies+a+vesicle+pool+that+preferentially+recycles+at+rest+and+maintains+spontaneous+neurotransmission.">Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).</li><li>Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+insulin+vesicle+dynamics+during+pulsatile+secretion.">Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion.</a> Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).</li><li>Ohara-Imaizumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+exocytosis+and+endocytosis+of+insulin+secretory+granules+in+the+pancreatic+beta-cell+line+MIN6+using+pH-sensitive+green+fluorescent+protein+(pHluorin)+and+confocal+laser+microscopy.">Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy.</a> Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).</li><li>Whim, M. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature.">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 원고는 confocal 현미경 검사 법에 의해 exocytosis 그대로 췌 장 독도 내 베타 세포에서 인슐린 알갱이의 시각화를 사용할 수 있는 기술을 설명 합니다. 그것은 높은 transfection 효율을 보장 하기에 아 데 노비 루스 복제 형광 기자로 NPY-pHluorin를 사용 합니다.
방법은 우리 손에 고효율, 그것은 주로 두 개의 매개 변수 의존 하는 몇 가지 수정 해야 할 수도 있습니다: 1) 섬 준비, 및 ?...

인슐린은 췌 장의 작은 섬의 베타 세포에 의해 생산 하 고 포도 당 물질 대사1의 키 레 귤 레이 터 이다. 죽음 또는 베타 세포의 기능 장애 포도 당 항상성을 방해 하 고 당뇨병2리드. 인슐린은 캘리포니아2 +에서 출시 된 코어 조밀한과 립에 포장-종속 방식3. 인슐린과 립 exocytosis 규제 어떻게 elucidating 완벽 하 게 이해 어떤 인슐린 분 비를 결정 하 고 당뇨병의 치료에 대 한 새로운 치료 대상의 식별에 대 한 새로운 경로 열 며 필수적 이다.
인슐린 exocytosis는 광범위 하 게 연구 되었습니다 형광 분자와 함께에서 막 커패시턴스 측정 등 미세한 접근 electrophysiological 접근을 사용 하 여. 막 커패시턴스 측정 좋은 시간적 해상도 있고 단일 셀 레코딩을 허용. 그러나, 커패시턴스에 변경 셀의 net 표면 변화를 반영 고 할 하지 개별 퓨전 이벤트를 캡처 또는 다른 비 인슐린 분 비 소포3에서 인슐린과 립 퓨전을 구별. 형광 프로브 및 소포 화물 단백질와 함께 2 광자 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 등 미세한 방법을 추가 정보를 제공합니다. 이러한 기술은 단일 exocytotic 이벤트 및 사전 및 사후 exocytotic 단계를 캡처하고 셀3의 인구에 있는 exocytotic 패턴을 공부 하 고 사용할 수 있습니다.
형광 기자 세 가지 유형의 수: 1) extracellular, 2) 세포질, 또는 3) 나노미터. 1) extracellular 기자는 extracellular 환경4를 통해 소개 될 수 있는 폴라 추적기 (예를 들어, dextrans, sulforhodamine B (연료 부스터), 루시퍼 노란색, pyranine). 폴라 추적기를 사용 하 여 셀의 인구에는 퓨전의 조사 가능 하며 혈관 등 다양 한 세포 구조를 캡처합니다. 그러나, 그들은 소포 화물 동작에 보고 하지 않습니다. 2) 세포질 기자는 세포질 얼굴과 도킹 및 exocytosis에 참여 막 관련 단백질에 결합 하는 형광 프로브. 예는 신경 전달 물질 방출5공부에 대 한 신경 과학에서 성공적으로 사용 된 성 N-ethylmaleimide-민감한 요소 첨부 단백질 수용 체 (무) 가족 구성원을 포함 합니다. 이러한 여러 바인딩 파트너는 단백질과 인슐린과 립 하지 않습니다 특정. 3) 기공을 기자는 화물 전용 기 행동의 조사에 대 한 허용 하는 기공을 화물 단백질을 융합 하는 형광 프로브. 인슐린과 립 특정 화물 단백질 등이 인슐린, c-펩 티 드, 작은 섬 녹말 체 폴 리 펩 티 NPY 등6,7. NPY는 인슐린과 립, 포함에 이며 공동 출시, 인슐린과 형광 기자8에 대 한 우수한 파트너 만들기.
Exocytosis 신경 내 분 비 세포, 특정 synaptotagmin isoforms9,10 의 요구 등의 다양 한 측면을 연구 NPY 다른 형광 단백질의 융합 이전 고용 방법 방출의 시간-과정에 따라 다릅니다 말라 골격 myosin II11,12. 이 연구에서 우리는 비 형광은 수정 된 GFP가 형광 기자로 pHluorin를 선택 고밀도 코어 내부 산 성 pH에서과 립 하지만 된다 중립 extracellular pH13에 노출 되 면 밝은 형광. 성숙한 인슐린과 립 산 성 pH를 5.5 아래 있다. 일단은 립 원형질 막 및 열립니다 퓨즈, 그것의 화물 수 기자로 서 pH에 민감한 단백질 pHluorin 사용 하 여7,147.4의 extracellular 중립 pH에 노출 됩니다.
PH 민감한 성격의 pHluorin 그리고 인슐린과 립에 있는 NPY의 선택적 식에 비추어 NPY pHluorin 퓨전 구문 인슐린과 립 exocytosis의 다양 한 속성을 공부를 사용할 수 있습니다. 융해 구성의 바이러스 배달 높은 transfection 효율을 보장 하 고 고립 된 섬에 뿐만 아니라 기본 베타 셀 또는 셀 라인에 작동 합니다. 이 방법은 exocytosis NPY 포함 된 소포와 다른 세포 유형에서 공부에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 exocytosis에 어떤 유전자 변형 마우스 모델 연구 특정 조건 (knockdowns, overexpression, 등)의 효과를 결합할 수 있습니다. 이 기술은 이전 인간의 독도15베타 세포 인구에서 인슐린과 립 분 비의 공간 및 시간 패턴을 특성화 하기 위해 사용 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Upright laser-scanning confocal microscope</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>TCS-SP5</td><td>includes LAS AF, the image acquisition software</td></tr><tr><td>Imaging chamber</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Imaging chamber platform</td><td>Warner instruments</td><td>PH-1</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 glass coverslips</td><td>Daiggerbrand</td><td>G15972H</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum silicone grease</td><td>Sigma</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel perfusion system</td><td>Warner instruments</td><td>VC-8</td><td></td></tr><tr><td>Single inline solution heater</td><td>Warner instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>Warner instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Suction pump</td><td>Pharmacia</td><td>P-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish, non-tissue culture treated</td><td>VWR</td><td>10861-586</td><td></td></tr><tr><td>CMRL Medium, no glutamine</td><td>ThermoFisher</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl solution</td><td>Sigma</td><td>S5150</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl solution</td><td>Sigma</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td>1 M CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;solution</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;solution</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES solution</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filter</td><td>VWR</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANNEP</td><td>ThermoFisher</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td></td></tr></tbody></table>

confocal imaging of neuropeptide y-phluorin: a technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets

인슐린 분 비 뿐만 질병에서 정상적인 생리 적인 조건 하에서 포도 당 항상성에서 중심 역할을 한다. 전기 생리학 또는 현미경 형광 기자 들의 표현에 결합 하거나 사용 하는 인슐린과 립 exocytosis 공부를 현재 접근. 그러나 이러한 기술의 대부분 클론 세포 라인에 대 한 최적화 되었습니다 또는 췌 장 독도 해리 요구. 대조적으로, 여기에 제시 된 방법 그대로 췌 장 독도에 인슐린과 립 exocytosis의 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 인코딩하는 pH에 민감한 녹색 형광 단백질 (GFP), pHluorin, neuropeptide Y (NPY)에 결합 된 아 데 노 바이러스와 격리 된 췌 장 독도의 바이러스 성 감염을 설명 합니다. 둘째, 우리는 confocal 이미징 독도의 5 일 후에 바이러스 성 감염 및 인슐린과 립 분 비를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 간단히, 감염 된 독도 이미징 챔버에 coverslip에 배치 되며 지속적으로 다양 한 자극을 포함 하는 extracellular 솔루션과 끼얹는다 되 하는 동안 똑바로 레이저 검사 confocal 현미경 아래 몇 군데. 공초점 이미지는 섬의 50 µ m에 걸친 빠른 공명 스캐너를 사용 하 여 시간 경과 녹음으로 획득 됩니다. 시간이 지남에 따라 인슐린과 립 원형질 막으로 융합을 다음 수 있습니다. 이 절차 또한 단일 실험에서 자극의 배터리를 테스트 가능, 마우스와 인간의 독도 이며 기능적인 화상 진 찰 (예를 들어, 막 잠재력 또는 cytosolic 칼슘 염료)에 대 한 다양 한 염료와 결합 될 수 있다.

기술의 전체 워크플로 그림 1에 표시 됩니다. 간단히, 마우스 또는 인간의 독도 수 NPY pHluorin 인코딩 하는 아 데 노 바이러스에 감염 되며 문화, confocal 현미경 아래에서 몇 일 후 몇 군데. 과 립 원형질 막 및 오픈 퓨즈, 형광 증가 관찰 고 측정할 수 있습니다 (그림 1). NPY pHluorin 실제로 인슐린과 립 역학을 모니터링 하는 데 적합 ?...

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Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

우리는 pHluorin, pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용 하 여 그대로 독도에 인슐린 exocytosis의 시각화를 위한 프로토콜을 설명 합니다. 격리 된 독도 소포 화물 neuropeptide Y에 결합 하는 pHluorin를 인코딩 하는 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 인슐린과 립 퓨전 이벤트의 검출에 대 한 수 있습니다.

Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

confocal-imaging-neuropeptide-y-phluorin-technique-to-visualize

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K 조회수.  University of Miami. 우리는 pHluorin, pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용 하 여 그대로 독도에 인슐린 exocytosis의 시각화를 위한 프로토콜을 설명 합니다. 격리 된 독도 소포 화물 neuropeptide Y에 결합 하는 pHluorin를 인코딩 하는 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 인슐린과 립 퓨전 이벤트의 검출에 대 한 수 있습니다.

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Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

연구

의학

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

생체공학

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

면역학 및 감염병학

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

생물학

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Intracellular Signaling Events and Hormone Secretion in Human Pseudoislets(인간 가성섬에서 세포내 신호전달 사건과 호르몬 분비)

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

저자 스포트라이트: Investigating Islet Abnormalities and Function with a Pseudoislet Protocol (유사섬 프로토콜로 섬 이상 및 기능 조사) 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

섬 기능 연구를 위한 인간 췌장 절단

Generating Human Pancreatic Tissue Slices to Study Endocrine and Exocrine Pancreas Physiology

It is crucial to study the human pancreas to understand the pathophysiological mechanisms associated with type 1 (T1D) and 2 diabetes (T2D) as well as the pancreas endocrine and exocrine physiology and interplay. Much has been learned from the study of isolated pancreatic islets, but this prevents examining their function and interactions in the context of the whole tissue. Pancreas slices provide a unique opportunity to explore the physiology of normal, inflamed, and structurally damaged islets within their native environment, in turn allowing the study of interactions between endocrine and exocrine compartments to better investigate the complex dynamics of pancreatic tissue. Thus, the adoption of the living pancreas slice platform represents a significant advancement in the field. This protocol describes how to generate living tissue slices from deceased organ donors by tissue embedding in agarose and vibratome slicing as well as their utilization to assess functional readouts such as dynamic secretion and live cell imaging.

저자 스포트라이트: 혁신적인 췌장 절편 플랫폼을 사용한 제1형 당뇨병 연구 발전

This protocol describes how to generate human pancreas slices from deceased organ donors to study cell function under near-physiological conditions. This innovative approach enables the investigation of normal and structurally damaged islets and the intricate interplay between endocrine and exocrine compartments.

내분비 및 외분비 췌장 생리학을 연구하기 위해 인간 췌장 조직 절편 생성

It is crucial to study the human pancreas to understand the pathophysiological mechanisms associated with type 1 (T1D) and 2 diabetes (T2D) as well as the ...

Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법

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Lepr

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

내분비 및 외분비 췌장 생리학을 연구하기 위해 인간 췌장 조직 절편 생성