저자는이 프로토콜에 피드 백 및 개선에 대 한 변환 유전체학 그룹과 캐서린 J 핸 슨의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 프로젝트는 연구 그랜트 SAF2015-64500-R, 유럽 지역 개발 기금, R.A 정부의 드 Economia y Competitividad에 의해 수 여를 포함 실시 했다.

1. 고정 및 수 지 포함
<ol><li>이산화탄소 (CO2) 또는 저체온증 얼음 블록을 사용 하 여 통해 파리 anesthetize (전체 비행을 보고 낮은 확대)와 함께 해 현미경과가 위를 사용 하 여 다리, 날개, 머리와 복 부는 정착 액의 침투를 촉진 하기 위하여의 터미널 부분을 제거 하. 시체의 신중한 처리는 흉부의 변형 방지 하려면이 단계에서 필요 합니다. 참고: 프로시저의 끝에서 제대로 처리 된 개인의 충분 한 숫자를 보장 하기 위해 유전자 당 최소 12 파리와 시작.</li>
	<li>솔루션 1의 얼음 (관 당 6 개인의 최대 배치) 포함 200 µ L에 1.5 mL 튜브에 시체를 전송. 참고: 시체 20 분 이상에 대 한 솔루션 1에에서 남아 있을 수 없습니다.<ol>
<li>솔루션 1에 대 한 혼합이 볼륨 비율 구성 요소: ¼ 4 %paraformaldehyde, ¼ 8%도, ¼ 0.2 M 나2HPO4 및 ¼ 0.2 M NaH2포4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>솔루션 2의 200 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 품 어.<ol>
<li>해결 방법 2: 솔루션 1과 1:1 (v/v) 비율에 OsO4 혼합. 주의: OsO4 매우 독성이 있다. 적절 한 안전 및 폐기 조치 증기 두건에서 그것을 조작 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 액체를 제거 합니다. 솔루션 2의 200 µ L을 추가 하 고 1-2 h에 대 한 얼음에 품 어.</li>
	<li>솔루션을 제거 하 고 다음과 같이 등급된 에탄올 시리즈를 통해 샘플을 탈수: 한 번에 30%, 50%, 70%, 90%, 그리고 두 번에 절대 에타 놀; 5 분 각입니다. 샘플을 커버 하는 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 지금까지 조직 90% 에탄올에 배치 되 면에 후속 단계에서 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>각 인큐베이션 10 분에 대 한 프로필 렌 산화물에 두 번 샘플을 품 어. 주의: 프로필 렌 산화물 독성, 증기 두건에서 그것을 사용 하 여.</li>
	<li>1:1 (v/v) 혼합 에폭시 수 지 및 프로필 렌 산화물의 프로필 렌 산화물을 대체 하 고 하룻밤 실 온에서 품 어. 주의: 수 지는 액체 상태에서 매우 독성이 있다. 수 지는 4 개의 구성 요소 (A, B, C, D)의 집합으로 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>에폭시 수 지에 대 한 추가 일회용 비 커의 수 지 (A), 경화제의 44.5 g 54 g (B), 가속기의 (C)와 가소제의 10 g 2.5 g (D). 증기 두건에 모든 수 지 구성 요소를 결합 합니다. Aliquots (최대 6 개월) 동안-20 ° C 또는-80 ° C에서 (몇 년)에 수 지를 저장 합니다.</li>
		<li>수 지 폐기, 구워 그것 24 h 70 ° C에서 고체 수 지는 독성이 있기 때문에. 솔루션 OsO의 흔적을 포함 될 수 있으므로 적절 한 국제 절차에 따라 중 금속 그룹에 모든 이전 솔루션을 삭제4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>100% 수 지, 이전 혼합물을 장착 하 고 4 h에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>새로운 수 지 (금형의 각 우물에서 한 시체)를 포함 하는 플라스틱 금형에 시체를 전송. 날카롭게 나무 막대기 또는 바늘을 전송 하 고 우물에 시체를 방향을 두고 하룻밤 70 ° c.에 파스퇴르 오븐에 유해를 수 지 사용 참고: 후부 트리밍 및 단면 시체의 적절 한 방향을 위해 시체 해야 거짓말 그들의 긴 측에 우물의 가장자리 가까이 매우 시체의 앞쪽 부분.</li>
</ol>2. 정돈 하 고 블록의 단면
<ol><li>금형에서 생산 수 지 블록을 제거 합니다. 면도날을 사용 하 여 수 지를 떨어져 트림 하 고 시체를 둘러싼 사다리꼴 모양을 형성 하 고는 톰에 적절 한 방향 제공. 비교 결과 얻으려면 가로 봉합 후 모든 시체를 단면 시작 합니다. 참고: 섹션은 샘플을 제대로 트림 DLMs의 anteroposterior 축에 수직 해야 합니다. ( 그림 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> 그림 3 . Myotonic 영양 장애의 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션 모델 파리. (A), 샘플의 트리밍 섹션 이미지의 오른쪽 지 느 러 미 부분에는 근육을 완전히 횡단 잘못 되었습니다. 결과적으로, 오른쪽 상단에 3 개의 근육 뭉치는 왼쪽의 것 들 보다 더 큰 것. 이 실수 근육 영역의 귀 착될 것 이다. (B)는 제대로 트림된 수 지 블록에서 섹션. 눈금 막대: 200 µ m.
<ol><li>1.5 µ m는 ultramicrotome 두꺼운 섹션 잘라내어 gelatinized 슬라이드 위에 물 방울으로 섹션을 전송.<ol>
<li>비교 결과 얻기 위해 모든 샘플 mesothorax 세그먼트에서 섹션을 가져옵니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O 증발 될 때까지 70-80 ° C에가 열 블록에 대 한 섹션을 포함 하는 슬라이드를 놓습니다. 이 시점에서, 샘플 OsO4 대조 (그림 4A)와 함께 관찰할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 얼룩 IFM 섹션
<ol><li>충분 한 톨루이 약 30 블루와 섹션 커버 열 블록에 s.<ol>
<li>톨루이 블루 솔루션에 대 한 해산 톨루이 블루의 1%와 1% 붕 사 H2o.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O 헹 구 고 물을 증발 하는 따뜻한 접시에 슬라이드를 두고. 반복 하는 얼룩 톨루이와 블루 대비 해야 하는 경우 향상 된 (그림 4B).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> 그림 4 . 다른 대비 stainings와 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션. 두 패널 그림 2D로 Abp1를 품고 DM1 모델의 이미지를 표시 합니다. (A) 섹션 OsO4 대조의 이미지. (B) 섹션 톨루이 블루 물 근육 번들의 더 나은 시각화 수 있습니다. 눈금 막대: 200 µ m.
4. 장착 IFM 섹션
<ol><li>H2O 증발 될 때까지 난방 블록 슬라이드를 건조.</li>
	<li>섹션에 장착 매체의 1 또는 2 방울을 넣고는 coverslip에 넣어. 주의: 설치 매체는 독성 때문에 증기 두건에서이 단계를 실시 합니다.</li>
</ol>5. 이미지와 근육의 부 량 인수
<ol><li>DLM 근육의 전체 세트 초점에 되도록 낮은 확대에서 이미지를 받아. 우리는 일반적으로 10 배를 사용합니다.<ol>
<li>통계 분석에 대 한 비행 당 적어도 5 직렬 이미지 하 고 분석 하는 실험 그룹 당 적어도 5 파리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전체 근육 (그림 5A)를 포함 하는 이미지를 선택 합니다. 축 또는 섹션의 방향을 확인 하 고 결과 왜곡할 것 이다 부적 절 한 방향으로 샘플을 삭제 (비교 그림 3A / 3B 심하게 구분 하 고 잘 지향된 섹션, 각각).</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 선택 영역 (픽셀) DLMs (그림 5A/5B)를 포함 하. 다른 실험적인 그룹 간의 비교에 대 한 참조 영역을 사용할 수 항상 큰 근육과 비행 것입니다. 비교할 다른 genotypes의 모든 이미지에 DLMs 동일한 치수 참조 영역 (그림 5B)를의 포함 하는 영역을 선택 합니다.</li>
	<li>이미지-J 명령으로 이미지를 binarize: 프로세스/이진/확인 이진 분야 또는 관심 (그림 5C)의 근육에 일치 하지 않는 픽셀 삭제.<ol>
<li>Artefactual 검은 반점 근육 이외의 지역에 나타나는 경우, 명령 그리기 도구 와 그들을 삭제 하 고 지우개 기호를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> 그림 5 . 근육 지역 결정을 위한 분석 절차 이미지. (A) 횡단 부분의 Myotonic 영양 장애 유형 1 모델은 DLM을 포함 하는 사각형으로 흉부 비행. (만 간접 비행 근육과 내장 (*)와 B) 선택 된 영역입니다. (C) Binarized 이미지입니다. 검정 영역은 관심의 근육에 해당합니다. 소장이 근육의 정확한 정량화에 대 한 삭제 되었습니다. 눈금 막대: 200 µ m.
<ol start="5"><li>근육 조직 (검은 픽셀) 명령으로 총 중에 해당 하는 픽셀의 비율 계량: 분석/측정 및 선택 옵션 영역 분수. 지역의이 비율은 각의 DLM 근육 질량의 추정 이다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+Drosophila+Development.">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium.">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li><li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications.">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+Dystrophy+Type+1.">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li><li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model.">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscleblind,+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li><li>Garc&#237;a-L&#243;pez, A., Llamus&#237;, B., Orz&#225;ez, M., P&#233;rez-Pay&#225;, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models.">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li><li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature.">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223 (2014).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언.

초파리 melanogaster 인간의 신경 근육 학 질병7,,1011, Myotonic Dystrophies의 모양으로 특징을 포함 하 여 연구에 유용한 모델 임을 입증 되었습니다. 근육 위축입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 발병 또는 플라이 모델에서 특정 질병의 진행으로 인 한 근육 퇴보를 측정을 위한 유용한 도구입니다. 예를 들어 따라 다양 한 연령대?...

과일 파리의 흉부 비행 근육, 기능, 생리학 및 해부학 적 구분의 두 개의 서로 다른 클래스를 포함 합니다. 이 근육은: dorso 경도 (DLM)와 (DVM) dorso-복 부 근육 (그림 1), 및 동기 비행으로 구성 된 간접 비행 근육 (IFM), 제어 근육1,2. 이 근육은 함께 비행에 필요한 높은 기계적인 힘을 생성 합니다. 크기, 분포 및 rostro 꼬리 처리는 IFMs의 횡단 단면3 (그림 2A)에 대 한 쉬운 방향을 허용. 이러한 이유로, 우리는 이러한 근육 근육 위축 초파리 melanogaster에서 공부 하를 선택 했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> 그림 1입니다. 보여주는 간접적인 비행 근육 (IFMs) 배열 하는 과일 파리의 흉부의 도표. (왼쪽) 측면 보기 나타내고 (오른쪽) 가슴의 크로스 섹션을 나타냅니다. IFMs (레드)에서 Dorso 경도 (DLM) 근육의 구성 그리고 Dorso-복 부 (DVM) (녹색)에 근육.
조직 구조 및 조직학 섹션의 dorso 복 부 축 방향 제어할 보존 근육 단면적의 적절 한 평가 위해 중요 하다. 근육 구조를 유지 하기 위해 사용 하는 톰 린 슨 외 에서 수정 고정 혼합물 4 . 또한, 근육 내부 조직 이기 때문에, 초파리의 외 골격의 불 침투성 혼합물 대상 조직에 침투 수 없습니다 고정으로 문제를 이다. 이 문제를 회피, 비행 머리, 다리, 날개와 고정 혼합 입력을 허용 하는 구멍을 만드는 복 부의 마지막 2 개의 세그먼트를 제거 했습니다. 우리는 오스뮴 tetroxide (OsO4)5, 광범위 하 게 사용 되는 기능 지방을 수정 하는 치료를 포함 하는 고정 프로토콜의 일환으로 트리 글리세라이드를 포함 하 여. OsO4 cytological 수준에서 특히 매우 잘 대부분의 구조를 유지 하 고 동시에 이미지에 대 한 대비를 제공 합니다. 고정, 후 초파리 thoraces 횡단 반 얇은 단면 (1.5 µ m)에 대 한 수 지에 포함 했다. 향상 된 대비에 대 한 조직의 수 또한 얼룩이 질 톨루이와 블루. 완전 한 thoraces의 이미지 10 배에서 찍은 하 고 근육 지역 binarizing (같은 크기)의 이미지와 총 ImageJ 소프트웨어와 함께 근육 조직 (검은 픽셀)에 해당 하는 픽셀의 비율을 측정 하 여 계량 했다.
OsO4 와 솔루션 도입이 프로토콜의 농도의 증가 조직 준비 및 고정 혼합물에 수정 허용 근육 조직의 고유 보존. 이 프로토콜 저하 및 Myotonic 영양 장애 (DM) 등 신경 근육 퇴행 성 질환과 관련 된 매우 위축 한 조건에도 더 신뢰할 수 있는 샘플의 사후 분석을 만드는 조직의 변형 방지 때문입니다. 더 일반적인 형태로 DM 타입-1,이 희귀 한 유전적 장애 myotonic 영양 단백질 키 니 아 제 (DMPK) 성적표에 확장된 CUG 반복에 대 한 가져온입니다. 돌연변이 DMPK RNA 격리 Muscleblind 같은 핵 RNA 의무적인 단백질 (MBNL1-3; 폼 ribonuclear foci 집계 초파리에서 Muscleblind (Mbl))6. 근육 myosin 무거운 체인 발기인 (Mhc-Gal4)에서 250 CTG 반복 표현 하 여 Myotonic 영양의 초파리 모델을 생성 했습니다. 모델 파리 전형적인 최대 개최 '날개' 형으로 날지 되었고 심각한 근육 그들의 IFMs (그림 2B)에서 쇠 약 했다. 우리 연구실에서 수행 하는 이전 연구는 IFMs의 근육 영역의 결정이 모델 파리7근육 위축 증의 다른 화학 또는 유전 한정자의 효과 계량 하는 신뢰할 수 있는 방법을 나타났습니다. 예를 들어, C 250 CTG를 표현 하는 파리에는 근육에 반복 하는 Mbl isoform의 overexpression 격리 하 여 Mbl 고갈 DM1 pathogenesis8 (그림 2C) 트리거 요인으로, 근육의 구조를 달성. Abp1, 입증 된 안티-DM1 활동9 (그림 2D) hexapeptide와 파리 DM 모델 먹이 후에 근육 영역 구출 되었다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> 그림 2입니다. 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션 부 량이 고 (A-D) 표시 관련 genotypes 초파리 melanogaster 의 간접 비행 근육. (A) 제어 (영웅) 난다. (B) 비 코딩 CTG 250의 표정 근육에 반복 (UAS-CTG(250)x) 제어 파리에 비해 DLMs에서 근육의 감소를 발생. (C)이 근육 위축 형 Muscleblind (MblC)의 overexpression에 의해 구출 되었다 (UAS-CTG (250) UAS MblC x) 및 (D) 먹이 (UAS-CTG (250) x Abp1)에 hexapeptide Abp1와 모델의 파리. 모든 이미지에 지 면 위에. Transgenes는 Myosin 중 연쇄 발기인 (Mhc)를 사용 하 여 근육을 주도 했다-Gal4. (E) 제어 파리에 상대적으로 근육의 비율의 정량화 차이가 상당한 했다 확인 했다. 히스토그램 표시 수단 ± S.E.M. * *p< 0.01와 * p < 0.05 (Student´s t-검정). 눈금 막대: 200 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
여기 보고 방법은 근육 개발, 유지 보수 및 노화, 질병 병 리 및 마약 테스트 근육 조직 내 생 및 외부 요인에 응답 하는 방법에 대 한 신뢰할 수 있는 정보를 제공 하기 때문에 연구원에 게 관심이 될 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image-J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ6</td>
			<td>Bright field technique.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71970</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision World</td>
			<td>14003</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fluka (Sigma)</td>
			<td>49624</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>0972A</td>
			<td>Extremely toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td>Extremely toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resin (Durcupan)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44611-44614</td>
			<td>Carcinogenic when it is unpolymerized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>251176</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant Medium (DPX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44581</td>
			<td>Dangerous.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Harmful.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>122507</td>
			<td>0.2 M dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>121677</td>
			<td>0.2 M dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>3052</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical cross-sectional muscle area determination of drosophila melanogaster adult indirect flight muscles

근육 질량을 낭비 하 고, 근육 위축으로 알려진 신경 근육 학 질병의 초파리 모델에 일반적인 표현 형 이다. 우리는 파리, 특히 dorso 경도 근육 (DLM), 위축 형 다른 유전적 원인에 의해 초래 하는 측정 대상 실험으로 간접 비행 근육 (IFMs)를 사용 했습니다. 이 프로토콜에서 우리 반 얇은 단면에 대 한 비행 흉부 근육을 포함 하는 방법, 근육과 주위 조직 사이 좋은 대조를 방법 및 반자동 수집 가능한 데이터의 광학 현미경 이미지를 처리 하는 방법을 설명 하 고 분석입니다. 우리는 방법론 파이프라인의 세 가지 특정 응용 프로그램을 설명합니다. 첫째, 우리가 어떻게 방법 myotonic 영양 플라이 모델; 근육 퇴보를 계량에 적용할 수 있는 표시 둘째, 근육 단면적의 측정 홍보 하거나 근육 위축 및 근육 퇴보; 방지 유전자를 식별 하는 데 도움이 수 있습니다. 셋째,이 프로토콜 후보 화합물은 크게 질병 유발 돌연변이 의해 유도 된 주어진된 위축 한 표현 형을 수정할 수 있는지 여부를 결정에 적용할 수 있는또는 환경 방 아 쇠.

척도 MblC의 overexpression 또는 Abp1의 관리 Myotonic 영양 비행 모델의 위축 형에 어떤 영향을 미쳤다 여부를 우리가 IFMs (그림 1)의 일부인 DLMs에 집중 했다. 우리는 모델 파리는 Myosin 중 연쇄 발기인 (Mhc)에 의해 구동 하는 근육에 걸쳐 250 비 코딩 CTG 반복 표현 결정-Gal4, 파리 제어에 비해 근육의 50% 감소 했다. 반면, 동일한 드라이버 MblC 및 확장 된 CTG ...

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Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

초파리 Melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정

우리는 초파리 성인 근육 질량을 결정 하는 간접적인 방법 근육 영역을 측정 하는 방법을 보고 합니다. 간접 비행을 분석 하 여 우리의 방법론의 응용 근육 Myotonic 영양 질병의 초파리 모델에서 설명 합니다.

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

8.9K 조회수.  University of Valencia. 우리는 초파리 성인 근육 질량을 결정 하는 간접적인 방법 근육 영역을 측정 하는 방법을 보고 합니다. 간접 비행을 분석 하 여 우리의 방법론의 응용 근육 Myotonic 영양 질병의 초파리 모델에서 설명 합니다.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

연구

생물학

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

성인 Drosophila Melanogaster의 로코의 고해상도 비디오 추적

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Drosophila의 비행 중 시각 인한 악취 추적

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

성인에서 Oenocytes의 해부 Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

인슐린 주입 및 성인에서 인슐린 민감도를 측정하는 Hemolymph 추출 Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

절연 골격근의 수축성, Fatigability 및 Alternans의 예 VIVO 평가

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

의 수명 측정<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

(A)의 유지 보수<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 인구 케이지

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...