HAC 리 타 알 렌 재단 (http://www.ritaallenfoundation.org)의 밀 튼 중 카셀 학자 이었다. 이 작품 HAC 우수성 그랜트 P50 GM071508의 국립 연구소의 종합 의료 과학 센터에서 (탐정 데이비드 Botstein), PhRMA 재단 그랜트 2007RSGl9572, 국립 과학 재단 부여 OCI-1047879 데이비드 8 월에 교부 금에 의해 투자 되었다 일반 의료 과학 R01 GM081686, 국립 연구소의 종합 의료 과학 R01 GM0866465, Eli의 국립 연구소 &#38; 재생 의학의 Edythe 넓은 센터 &#38; 줄기 세포 연구, 아이리스 칸토어 여자 건강 센터/UCLA CTSI NIH 그랜트 UL1TR000124, 그리고 백혈병 림프 종 사회입니다. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P50CA092131에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. HAC는 Eli의 멤버인 &#38; Edythe 넓은 재생 의학 센터 &#38; 줄기 세포 연구, UCLA 분자 생물학 연구소와 UCLA 생물 정보학 각 부처간 프로그램.

설명 하는 모든 실험은 프린스턴 대학, 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스에서 제도적 검토 보드에 의해 승인 되었다.
1. ActD 시간 코스에 대 한 확산 및 접촉 저해 Fibroblasts 준비
참고:이 프로토콜 사용 하는 timecourse 4 timepoints입니다. 3 생물학으로 독립적인 샘플 timepoint 당 1 개의 실험에서 다른 조직 문화 접시를 수집 하 여 수집 될 수 있습니다 또는 실험 세포의 서로 다른 문화를 여러 번 반복 될 수 있다. 우리의 경험에서 한 10 cm (직경) 조직 문화 접시 (1 접시) 분석에 대 한 충분 한 RNA를 제공합니다. 필요한 경우 각 timepoint에 셀의 수를 늘리기 위해 각 샘플에 대 한 여러 조직 문화 요리를 풀링된 수 있습니다. 또한, 진정으로 독립적인 생물 복제로 다른 개인에서 격리 하는 섬유 아 세포와 같은 실험을 수행할 수 있습니다.
<ol>
	<li>대 본 부패 분석에 대 한 셀의 확산 및 무부하 문화를 설정 합니다. 확산 셀 분할 셀 마다 3 일 동안 접촉 저해 세포 접촉 저해 되 고 있다.
	<ol>
		<li>접촉 저해 셀에 대 한 매체를 7 일 동안 매 2 일 변경. 2 일 전에 접촉 저해 fibroblasts 컬렉션에 대 한 준비가 proliferating 셀을 분할 합니다. 셀 문화 체계의 예는 그림 1에 표시 됩니다. 이 섹션의 나머지 단계는 설정 하 고 셀 분할에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>13설립된 프로토콜 따르면 신생아 피부에서 기본 피부 섬유 아 세포를 격리 합니다. 균질 인구를 위해 통로 섬유 아 세포입니다. 참고: 섬유 아 세포 냉동 및 해 동, 필요한 경우 될 수 있습니다.</li>
	<li>해 동 또는 필요한 경우 섬유 아 세포, replate. 37 ° C, 5% CO2조직 문화 인큐베이터에서 무 균 조건 하에서 10% 세럼과 DMEM에 섬유 아 세포 성장. 10 미만 구절에 대 한 성장 된 섬유 아 세포를 사용 합니다. 섬유 아 세포 이어야 한다 &#60; 80% 합칠 확산 및 무부하 인구 수 있도록 셀 분할의 날에.</li>
	<li>조직 배양 접시를 여러 접시, prewarm PBS, 트립 신, 및 보통 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 혈 청으로 분할.</li>
	<li>발음 또는 피펫으로 replated 될 세포와 각 조직 배양 접시에서 매체를 제거를 사용 하 여.</li>
	<li>각 접시 (10 mL 150 m m, 100 m m 플레이트에 대 한 솔루션의 5 mL, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL에 대 한 솔루션의) 12 잘 접시의 우물 1 mL에 피펫으로 따뜻한 PBS.</li>
	<li>Aspirate 또는 피펫으로 각 조직 배양 접시에서 PBS를 제거 하려면.</li>
	<li>부드럽게 피펫으로 1 트립 신-EDTA 각 접시 (8 mL 150 mm 접시, 100 m m, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL 및 12 잘 접시의 우물 1 mL에 대 한 솔루션의 3 mL에 대 한 솔루션의)에 x. 참고: 확인 1 살 균 10 diluting 하 여 트립 신-EDTA x 트립 신-EDTA 무 균 PBS에 x. 마지막 1 x 솔루션 0.05 %trypsin 및 0.02 %EDTA 이어야 한다.</li>
	<li>5 분에 대 한 셀과 트립 신을 품 어.</li>
	<li>부드럽게 접시 꺼내 접시에서 셀을 누릅니다.</li>
	<li>피펫으로 세포를 단일 세포 현 탁 액으로 resuspend.</li>
	<li>10% 세럼 150 m m 플레이트, 100 mm 접시, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL에 대 한 솔루션의 3 mL에 대 한 솔루션의 (8 mL과 DMEM의 동일한 볼륨을 포함 하는 원뿔 튜브 셀 trypsin 솔루션에 전송 그리고 12의 우물 1 mL 잘 접시).</li>
	<li>트립 신을 제거 하려면 1000 x g 에서 5 분간 4 ° C에서 셀 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>매체와 카운트의 적절 한 볼륨에 셀 셀 농도 결정 하는 hemacytometer와 resuspend.</li>
	<li>확산에 대 한 100 m m 조직 문화 접시 당 씨앗 5 x 105 세포와 접촉 저해 셀.</li>
	<li>이 메서드를 사용 하 여 확산 하 고 접촉 저해 샘플 분석 (그림 1)에 필요한 설정 합니다.</li>
</ol>
2. ActD 시간 코스
<ol>
	<li>ActD 1 mg/mL (ActD, 살 균 PBS의 사용 950 µ L 및 살 균 DMSO의 50 µ L의에 대 한 1 밀리 그램)의 재고 농도에서 resuspend. 참고: ActD의 냉동된 재고 솔루션 안정 되어야 한 달-20 ° c.에 대 한 희석 솔루션은 무시 되 고 더 사용 하기 위해 저장 하지 해야 합니다.</li>
	<li>모든 생물 복제 세포 배양 접시를 위한 prewarmed 매체의 적절 한 볼륨 ActD 추가 0, 120, 240, 그리고 480 분 timepoints (그림 2) 설정 했다. ActD 매체의 mL 당 15 µ g의 농도에 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 오래 된 매체 떨어져 발음 ActD 포함 된 매체에 있는 셀에 추가.
	<ol>
		<li>1 mg/mL 주식에 대 한 추가 15 µ L 150 µ L을 추가 하는 매체, 예를 들어, 100 mm 접시에 대 한 매체의 10 ml의 각 ml ActD ActD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>제로 timepoint 샘플을 수집, 부드럽게 ActD 매체를 피펫으로 발음 하는 셀에 PBS를 prewarmed. 피펫으로 100 m m, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL 및 12 잘 접시의 우물 1 mL에 대 한 솔루션의 5 mL 150 mm 접시에 대 한 솔루션의 10 mL.</li>
	<li>부드럽게 발음 또는 피펫으로 PBS에서. 참고: RNA 격리를 포함 하는 모든 단계는 RNase 무료 물, RNase 무료 microcentrifuge 튜브, RNase 무료 펫과 수행 되어야 한다. 장갑 착용 하 고 RNA와 함께 작업 하는 경우에 자주 변경 해야 합니다.</li>
	<li>조직 문화 접시에 직접 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 (1 mL/10-cm 플레이트 4 x 105 4 x 107 셀)을 추가 합니다. 참고: 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션은 세포를 lysing 서로 다른 RNA, DNA, 그리고 단백질을 분리 하는 동안 RNA 품질을 유지 하는 monophasic 솔루션. 주의: 페 놀 및 guanidine isothiocyanate은 부식성. 적절 한 보호를 사용 합니다.</li>
	<li>피펫으로 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션-셀 혼합 균질 혼합물을 만들기 위해 여러 번 왔다 갔다. 참고: 또는 최대 1 년-20 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 lysate를 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>후 적절 한 양의 시간 단계 2.3-2.6에 설명 된 방법을 사용 하 여 각 시간 포인트를 수집 합니다.</li>
</ol>
3. 페 놀 guanidine Isothiocyanate 솔루션 Lysate에서 총 RNA 격리
<ol>
	<li>RNA-단백질 복합물의 완전 한 해체를 위해 5 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어. 참고: 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 프로토콜의 단계 다른 설명이 없는 한 상 온에서 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>방법론 사용으로 검출 될 수 있는 제어 스파이크에 녹취 록을 소개 합니다.</li></ol>알려진된 수량 및 농도에 각 샘플에 이러한 컨트롤을 소개 합니다. 참고: 외부 RNA 제어 컨소시엄 (ERCC) 스파이크 컨트롤 믹스14 특별히 설계 되었습니다 스파이크에서 컨트롤로 RNA-이 대 한 그것은 또한 북부 오 점 또는 실시간 정량에 대 한 사용할 수 있습니다. 스파이크에 컨트롤 microarray 기술을 위해 특별히 설계 된 제공 ( 테이블의 자료참조)도 있습니다.
	<li>Microcentrifuge 튜브 2.0 mL를 피펫으로에 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 혼합물을 전송. 사용 된 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션의 모든 1 mL에 대 한 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 혼합물에 0.2 mL 클로 프롬을 추가 (예를 들어, 1.5 mL 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 혼합물에 추가 하는 0.3 mL 클로 프롬).</li>
	<li>15 microcentrifuge 튜브를 적극적으로 흔들어 s 다음 3 분 동안 실 온에서 클로 프롬-페 놀-guanidine isothiocyanate 혼합물을 품 어 고.</li>
	<li>4 ° c.에 20 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 회전 참고: 초기 스핀 후 샘플 해야 별도 레이어로 3-상단 (그림 3)에 명확한 수성 층 그리고 바닥, 화이트/핑크 interphase, 중간에 빨간색 유기 층.</li>
	<li>수성 층 새로운 2.0 mL microcentrifuge 튜브는 micropipette를 사용 하 여 전송. 참고: 수이 과정 동안에 interphase를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 수 분수의 일부 떠날 괜찮습니다. 또한 interphase 레이어는 interphase 등의 일부를 포함 하도록 레이어 DNA와 RNA를 오염 시킬 것 보다는 수성 분수의 일부를 두고 하는 것이 낫다. 수성 층이 됩니다 약 절반 초기 볼륨, 그래서 약 0.9 mL의 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션/클로 프롬 혼합물은 1.8 mL.</li>
	<li>Interphase 및 유기 분수를 삭제 합니다.</li>
	<li>수성 분수 2-프로 판 올의 동일한 볼륨을 추가 하 고 반전 튜브 10 번. 수익률 10 미만6 셀 수집 때문에 낮을 것으로 예상 된다 하는 경우에 특히 샘플의 20 µ L 당 glycogen의 20 mg/mL 용액의 최대 1 µ L를 추가 합니다. 참고:이 조밀 하 고, 단단한 펠 릿 스핀 단계 후 모니터링을 쉽게 발생 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 실내 온도에 샘플을 품 어.</li>
	<li>4 ° c.에 20 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 회전 되도록,이 회전의 끝에, RNA는 튜브의 하단에 흰색 펠 릿을 형성 시 켰 던.</li>
	<li>피 펫, 제거와 상쾌한 화이트 RNA 펠 렛을 방해 하지 특별 한 주의가지고 삭제. 참고: 초과 에탄올을 제거 하는 손잡고 개최 하는 느슨한 피펫으로 팁을 사용할 수 있습니다. RNA 펠 릿 방해 하지만 삭제 하지 탐정 스핀을 반복 하 고 다시는 상쾌한을 제거 수 있습니다. 이 전체 절차를 반복 조사를 요구할 것 이다으로 펠 릿을 삭제 하지 마십시오.</li>
	<li>75% 에탄올과 물의 25 %nuclease 무료 솔루션을 준비 합니다. 펠 릿을 세척 하 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 시 약의 1 mL 당 75% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 회전</li>
	<li>제거한 후에 상쾌한의 대부분를 피펫으로 사용 하 여 여전히 복용 하지 않도록 주의 펠 렛을 방해 하는 동안 최대한 많은 에탄올을 제거. 참고: RNA 펠 릿이이 단계에서 적은 소형 이며 이동 하는 경향이 있다. RNA를 손실 되지 않도록 하려면이 시점에서 펠 릿을 처리할 때 특별히 주의 해야 합니다.</li>
	<li>펠 렛의 모든 초과 에탄올을 실 온에서 2 분에 대 한 샘플 12000 x g 회전.</li>
	<li>사용 하는 펠 렛을 방해 하지를 돌보는 micropipette 튜브에서 모든 초과 에탄올을 제거 합니다.</li>
	<li>RNA 펠 릿 어 5 분 동안 건조 하자.</li>
	<li>RNA 펠 릿을 nuclease 무료 물 50 µ L을 추가 하 고 resuspend nuclease 무료 물 속에서 펠 릿.</li>
	<li>샘플 1 µ L 치료 DNase (2 단위 / µ L) DNA를 제거 하 고 다음 비활성화 DNase 및 양이온 ( 재료의 표참조)를.</li>
	<li>-80 ° c.에 2.0 mL microcentrifuge 튜브에 RNA 샘플 저장</li>

4입니다. 성적 풍부의 분석
<ol>
	<li>RNA를 계량 하 고 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여에 대 한 RNA를 확인 합니다. 참고: 260에서 흡 광도의 비율 280 nm nm RNA에 대 한 약 2.0 이어야 한다.</li>
	<li>1 %agarose 젤 또는 저하의 정도 시각화 하는 해당 기술 RNA를 분석 합니다. 참고: 두 취소 18S를 대표 하는 밴드 그리고 28S rRNA 명확 하 게 보이는 (그림 4)를 해야 한다. 이러한 밴드 표시 되지 않는 경우 RNA 저하 될 수 있습니다. 문제 촬영 팁 RNA 저하에 대 한 토론에 제공 됩니다.</li>
	<li>모니터 대 본 풍부한 RNA의 수집된 aliquots에 비해 아군에 내부 표준 microarrays15, RNA-Seq16,17, 실시간 정량 Pcr 사용 하 여 또는 북부 몰아내고18.
	<ol>
		<li>알려진 풍요의 제어 아군에 비해 각 시간 지점에서 각 사본에 대 한 풍부를 결정 합니다. 참고: microarrays, 값 형광 강렬 될 것입니다. 북부 오 점, x 선 필름에 밴드를 측정할 수 있습니다. 실시간 정량 pcr, 2-σσCT 방법19알려진된 표준 비교해보면 사본 풍부를 확인할 수 있습니다. RNA-Seq에 대 한 정규화 된 값은 FPKM 또는 kilobase 백만 읽기 매핑된 당 exon의 당 조각으로 확인할 수 있습니다. Isoform 특정 감소율에 대 한 RNA-Seq 데이터 DEXSeq20같은 isoform 인식 방법론을 사용 하 여 분석 수 있습니다. Isoform 특정 감소율은 최고의 RNA이 결정 Microarray 데이터 결정 될 경우, 유전자에 의해 유전자 단위가 아닌 프로브, 프로브 기초 데이터를 분석 해야 합니다. 애 널 리스트는 감지기의 제한 된 수의 정보를 해석할 때 주의 해야 합니다. 예를 들어, 5 이하의 프로브 특정 isoform에 대해 유익 하지 않은 있을 수 있습니다. 이 경우에, 분석 결과 신뢰할 수 있는 이러한 프로브 동작 충분히 일관 되는지 확인 해야 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C-Myc 및 자신감을 요금을 정확 하 게 감지 했다 그 성적 부패를 GAPDH 처럼 천천히 부패 유전자 처럼 급속 하 게 부패 유전자 분석에 수집 된 샘플에서 격리 된 RNA17 에 실시간 정량 Pcr을 수행 합니다. 참고: 추가 확인에 대 한 isoform 특정 실시간 정량 프로브 개발 고21동안 특정 isoforms의 풍부를 모니터링 하는 데 사용.</li>
</ol>
5입니다.감퇴 속도 상수 결정
<ol>
	<li>각 timepoint에 대 한 로그-변환 (유전자 또는 isoform 특정) 각 사본에 대 한 풍부한 값입니다. 참고: 로그 변환 값으로 변환 됩니다 지 수 감퇴 곡선 선형 감퇴 모델22로 들어갈 수 있는 라인.</li>
	<li>각 대 본 (유전자 또는 isoform 특정) 선형 감퇴 모델에 대 한 식 프로 파일에 맞게. 이러한 모델에 대 한 공식은 f (t) = C-r * t. 이 방정식에 C는 녹취 록의 시작을 나타냅니다 상수, r의 감소, 속도 이며 t는 시간 실험의 처음부터. 이 방정식에서 r*ln(10)와 감퇴 속도 결정 (참조11참조). 참고: maSigPro 소프트웨어 패키지는 회귀 기반 접근 시간 코스 데이터23에 중요 한 유전자 식 프로필 차이 탐지 하도록 설계 되었습니다. 샘플 코드 및 maSigPro에 대 한 결과에 사용할 수 있습니다: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.</li>
	<li>필터 로그 선형 감퇴 모델에 맞게 실패 하는 유전자를. 이 ANOVA F-검정을 수행할 수 있습니다. 참고: F 검정은 유사로 정의 되는 F-통계, 기반 샘플 의미 샘플 내에서 변이 나눈 사이. 선형 스텝 업 Benjamini 및 Hochberg 거짓 발견 절차24를 적용 하 여 여러 비교에 대 한 p 값을 수정 합니다. Q 값 F-검정 0.05 보다 큰 로그 선형 감퇴 모델에 맞게 실패 하는 유전자는 컷오프로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>여 지 없이 세포 주기 상태와 시간 사이 중요 한 상호 작용 기간 성적을 결정 하는 ANOVA F-검정을 수행 (틀린 발견 비율, 루즈벨트 &#60; 0.05).</li>
</ol>

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저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.

정지는 mitogens 또는 혈 청의 철수, 세포 접착 및 접촉 금지의 부족을 포함 하는 외부 신호에 의해 유도 될 수 있다. 접촉 금지, 정지, 유도 대 한 여러 가지 방법 중 하나는 세포 증식 세포 주기 세포 세포 접촉에 대 한 응답에서 종료 매우 진화론 보존된 과정 이다. 우리는 정지를 유도 하는 방법의 예를 들어 접촉 저해에 여기 초점. 이전 연구 보고가 셀 셀 문의 예측에 관한 속25에 ?...

성적 증명서의 정상 상태 수준 반영 성적 종합과 성적 부패의 기여. 규제 및 조정된 대 본 부패는 제어 생물 학적 과정1,2,,34중요 한 메커니즘입니다. 예를 들어 성적 감소율 염증 성 cytokine 종양 괴 사 인자5활성화 다음 이벤트의 시간 시리즈에 기여할 표시 되었습니다.
우리는 이전 확산 및 기본 인간 섬유 아 세포에 정지 사이 과도 많은 유전자6의 증명서 수준에 변화와 관련 된 나타났습니다. 이러한 변화 중 일부 녹음 방송 요인의 활동에 이러한 두 상태 사이의 차이 반영합니다.
녹취 록의 부패 속도 변화 또한 두 개의 서로 다른 상태7,8대 본 식 수준에 변화에 기여할 수 있다. 확산 및 정지 사이 과도 여러 microRNAs9의 수준에 변화와 관련 된 우리의 이전 연구 결과 바탕으로, 우리는 또한 변화에 차동 성적 부패에서 기여 여부 요청 무부하 fibroblasts 대 확산에 진 식입니다.
사본을 안정성을 모니터 하기 위해 우리는 성적 무부하 셀 대 확산에 게놈 넓은 감퇴의 속도 결정. 이를 위해, 우리는 새로운 전사의 억제제를 소개 하 고는 개별 성적표 사라진 시간이 지남에 속도 모니터링 하 여 무부하 fibroblasts 대 확산에 감소율 모니터링. 이 방법의 장점은, 단순히 새로운 사본 합성을 억제 함으로써 전체적인 유전자 발현을 모니터링 하는 방법에 비해 우리가 된다는 것에서 그들은 속도는 별도로이 성적에 대 한 부패 속도 확인할 수 복사할 수 있습니다.
새로운 전사를 억제 하 여 사본 감소율을 결정 ActD 치료 여러 이전의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. ActD 프로 염증 성 cytokines5치료에 기인 하는 사본 풍부에서에 RNA 안정성의 중요성을 해 부에 사용 되었습니다. 유사한 접근은 또한 그들은 차별화 된 근육 형10채택 차별화 된 C2C12 셀 대 확산 성적 부패 속도 차이 해 부하 사용 되었습니다. 또 다른 예로, 글로벌 mRNA 반감기 또한 만능에서 발견 된 하 고 차별화 된 마우스 배아 줄기 세포11. 이 예제에서 mRNA 감퇴 사본 풍부 규제에 대 한 및 다른 셀 상태를 셀의 변환에 대 한 중요 한 표시 되었습니다.
아래 설명 된 방법을 적용, 섬유 아 세포 확산 및 무부하 상태12에 비교할 때 약 500 유전자의 사본 감소율에 변화를 발견 우리. 특히, 우리는 예측에 관한 미르 29, downregulated 무부하 셀에는 대상 셀 전환 정지 때 안정화는 발견 했다. 여기 우리 확산 및 무부하 셀에 감소율을 결정 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법론은 급속 하 게 부패 유전자에 대 한 정보는 때 두 비슷한 조건 하지만 뚜렷한 글로벌 mRNA 감퇴 속도 비교 유용 합니다. 그것은 또한 2 차원 3 차원 문화 대에서 성적 부패, 예를 들어, 셀 문화 조건의 효과 등 다른 질문을 해결 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 감소율 등 microarrays RNA 시퀀스 또는 실시간 정량 Pcr 방법 결정된 게놈 넓은 수 또는 북부 blotting 유전자, 유전자 또는 isoform에 의해 isoform 기준 감소율을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 요금은 각 모니터링된 유전자의 반감기를 계산 하 고 부패 속도 두 가지 조건에 다른 유전자를 식별 하 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4&amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment for running agarose gels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile tissue culture plates and conical tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>VWR</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>For decontaminating work surfaces from RNase</td></tr><tr><td>2.0 ml eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&amp;nbsp; Solution 10X</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-07</td><td></td></tr><tr><td>Sterile PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1410-2 mg</td><td>inhibits transcription</td></tr><tr><td>Sterile DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>31-761-00ML</td><td>solvent for actinomycin D</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN19400225</td><td>MP Biomedicals, Inc product</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618500</td><td>molecular biology grade</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td>molecular biology grade</td></tr><tr><td>RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>carrier for RNA precipitation</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1907</td><td>removes DNA with DNase, then, in a subsequent step,&amp;nbsp; inactivates DNA and removes divalent cations</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN820721</td><td>MP Biomedicals, Inc product</td></tr><tr><td>Loading dye for RNA gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>suitable even for denaturing electrophoresis</td></tr><tr><td>Millenium RNA markers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7150</td><td>RNA ladder</td></tr><tr><td>One-color RNA Spike-in Kit</td><td>Agilent Technology</td><td>5188-5282</td><td>Example spike-in control for Agient microarray analysis</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>molecular biology grade, for TAE buffer</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>for TAE buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>electrophoresis grade, for gels</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7637</td><td>for molecular biology</td></tr><tr><td>External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4456740</td><td>Spike-in control for RNA Seq</td></tr><tr><td>TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes)</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td>for RNA Seq</td></tr><tr><td>96-well 0.3 ml PCR plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0600</td><td>for real-time qPCR</td></tr><tr><td>Microseal B adhesive seals</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>for real-time qPCR</td></tr><tr><td>Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs</td><td>VWR</td><td>89094-662</td><td>for real-time qPCR</td></tr><tr><td>Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12230</td><td>for real-time qPCR</td></tr><tr><td>SuperScript Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td>for real-time qPCR</td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>for real-time qPCR</td></tr></tbody></table>

determining genome-wide transcript decay rates in proliferating and quiescent human fibroblasts

정지는 임시, 가역 상태 셀 세포 분열을 중지 해야 하지만 증식 하는 능력을 유지. 우리를 포함 한 여러 연구 정지 관련 유전자 발현에 광범위 한 변화 된가 설명 했다. 이러한 변화 중 일부는 수준 또는 확산 관련 된 녹음 방송 요인 E2F MYC 등의 활동에 변화를 통해 발생합니다. 우리 mRNA 감퇴 확산 및 무부하 셀 사이의 유전자 발현에서 변화에도 기여할 수 있다 설명 했다. 이 프로토콜에서 우리 인간의 피부 포 피 섬유 아 세포의 증식 및 무부하 문화를 설정 하기 위한 절차를 설명 합니다. 우리는 다음 악티노마이신 d (ActD) 확산 및 무부하 셀에 새로운 전사를 억제 하는 절차를 설명 합니다. ActD 치료 성적 부패에서 새로운 전사 해리를 간단 하 고 재현성 접근을 나타냅니다. ActD 치료의 단점은 ActD 세포 생존 능력에 영향을 하기 때문에 시간 코스는 짧은 시간 프레임에 제한 되어야 한다입니다. 대 본 수준 사본 감소율을 확인 하려면 시간이 지남에 모니터링 된다. 이 절차는 유전자와 무부하 fibroblasts 대 확산에 차동 부패 하는 isoforms의 식별에 대 한 수 있습니다.

우리 이전 8 시간 코스12통해 확산 및 접촉 저해 기본 인간 섬유 아 세포에서 사본 감소율의 microarray 분석의 결과 보고 있다. 확산 및 접촉 저해 fibroblasts 비교 성적 안정성에 중요 한 변화는 유전자 목록이 보충 표 1에 제공 됩니다. 형광 강도 ActD 치료 후 시간 코스 이상과 시간 0에 제공 됩니다. 유전자는 ANOVA F-검정을 사용 하 여 확산 하 고 접?...

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Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

우리 성적 감소율, 모니터링 및 차동 부패 유전자 식별 생성 확산 및 무부하 기본 인간 피부 섬유 아 세포 프로토콜을 설명 합니다.

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

6.2K 조회수.  University of California, Los Angeles. 우리 성적 감소율, 모니터링 및 차동 부패 유전자 식별 생성 확산 및 무부하 기본 인간 피부 섬유 아 세포 프로토콜을 설명 합니다.

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Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

연구

유전학

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in production or degradation of RNA. This protocol describes a method for measurement of RNA production, using 5-Bromouridine labelling of RNA followed by immunoprecipitation, which enables investigation of RNA synthesized within a short timeframe (e.g., 1 h). The advantage of 5-Bromouridine-labelling and immunoprecipitation over the use of toxic transcriptional inhibitors, such as &#945;-amanitin and actinomycin D, is that there are no or very low effects on cell viability during short-term use. However, because 5-Bromouridine-immunoprecipitation only captures RNA produced within the short labelling time, slowly produced as well as rapidly degraded RNA can be difficult to measure by this method. The 5-Bromouridine-labelled RNA captured by 5-Bromouridine-immunoprecipitation can be analyzed by reverse transcription, quantitative polymerase chain reaction, and next generation sequencing. All types of RNA can be investigated, and the method is not limited to measuring mRNA as is presented in this example.

This method can be used to measure RNA synthesis. 5-Bromouridine is added to cells and incorporated into synthesized RNA. RNA synthesis is measured by RNA extraction immediately after labelling, followed by 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation of labelled RNA and analysis by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction.

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis and metabolism. Indeed, fluctuations in transcript expression could modify the translation efficiency and ultimately the cellular activity of a transcript. Several experimental approaches have been developed to investigate the half-life of mRNA although some of these methods have limitations that prevent the proper study of posttranscriptional modulation. A promoter induction system can express a gene of interest under the control of a synthetic tetracycline-regulated promoter. This method allows the half-life estimation of a given mRNA under any experimental condition without disturbing cell homeostasis. One major drawback of this method is the necessity to transfect cells, which limits the use of this technique in isolated primary cells that are highly resistant to conventional transfection techniques. Alveolar epithelial cells in primary culture have been used extensively to study the cellular and molecular biology of the alveolar epithelium. The unique characteristics and phenotype of primary alveolar cells make it essential to study the posttranscriptional modulations of genes of interest in these cells. Therefore, our aim was to develop a novel tool to investigate the posttranscriptional modulations of mRNAs of interest in alveolar epithelial cells in primary culture. We designed a fast and efficient transient transfection protocol to insert a transcriptionally controlled plasmid expression system into primary alveolar epithelial cells. This cloning strategy, using a viral epitope to tag the construct, allows for the easy discrimination of construct expression from that of endogenous mRNAs. Using a modified &#916;&#916; quantification cycle (Cq) method, the expression of the transcript can then be quantified at different time intervals to measure its half-life. Our data demonstrate the efficiency of this novel approach in studying posttranscriptional regulation in various pathophysiological conditions in primary alveolar epithelial cells.

Here, we present a tool that can be used to study the posttranscriptional modulation of a transcript in primary alveolar epithelial cells by using an inducible expression system coupled to a pipette electroporation technique.

1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 mRNA 전사체의 안정성의 조사를 위한 능률적으로 통제된 플라스미드 발현 시스템

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used approaches to determine protein half-life are either limited to population averages from lysed cells or require the use of protein synthesis inhibitors. This protocol describes a method to measure protein half-lives in single living adherent cells, using SNAP-tag fusion proteins in combination with fluorescence time-lapse microscopy. Any protein of interest fused to a SNAP-tag can be covalently bound by a fluorescent, cell permeable dye that is coupled to a benzylguanine derivative, and the decay of the labeled protein population can be monitored after washout of the residual dye. Subsequent cell tracking and quantification of the integrated fluorescence intensity over time results in an exponential decay curve for each tracked cell, allowing for determining protein degradation rates in single cells by curve fitting. This method provides an estimate for the heterogeneity of half-lives in a population of cultured cells, which cannot easily be assessed by other methods. The approach presented here is applicable to any type of cultured adherent cells expressing a protein of interest fused to a SNAP-tag. Here we use mouse embryonic stem (ES) cells grown on E-cadherin-coated cell culture plates to illustrate how single cell degradation rates of proteins with a broad range of half-lives can be determined.

This protocol describes a method to determine protein half-lives in single living adherent cells, using pulse labeling and fluorescence time-lapse imaging of SNAP-tag fusion proteins.

부착 세포 배양에서 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 단백질 저하의 단일 셀 정량화

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

발생학

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of the RNA produced during a brief period of labelling. This is done by attaching a biotin moiety to the incorporated thio group and affinity purifying, using streptavidin coated beads. Achieving a good yield of pure, newly synthesized RNA that is free of pre-existing RNA makes shorter labelling times possible and permits increased temporal resolution in kinetic studies. This is a protocol for very specific, high yield purification of newly synthesized RNA. The protocol presented here describes how RNA is extracted from the yeast Saccharomyces cerevisiae. However, the protocol for purification of thiolated RNA from total RNA should be effective using RNA from any organism once it has been extracted from the cells. The purified RNA is suitable for analysis by many widely used techniques, such as reverse transcriptase-qPCR, RNA-seq and SLAM-seq. The specificity, sensitivity and flexibility of this technique allow unparalleled insights into RNA metabolism.

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

The use of thiolated uracil to sensitively and specifically purify newly transcribed RNA from the yeast Saccharomyces cerevisiae.

4-티우라실(Ers4tU)을 가진 생체내 RNA의 매우 신속하고 특정한 대사 라벨링

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

생화학

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases. Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest that typically occurs in response to exposure to sub-lethal stresses. However, like other non-dividing cells, senescent cells remain metabolically active and carry out many functions that require unique transcriptional and translational demands and widespread changes in the intracellular and secreted proteomes. Understanding how protein synthesis and decay rates change during senescence can illuminate the underlying mechanisms of cellular senescence and find potential therapeutic avenues for diseases exacerbated by senescent cells. This paper describes a method for proteome-scale evaluation of protein half-lives in non-dividing cells using pulsed stable isotope labeling by amino acids in cell culture (pSILAC) in combination with mass spectrometry. pSILAC involves metabolic labeling of cells with stable heavy isotope-containing versions of amino acids. Coupled with modern mass spectrometry approaches, pSILAC enables the measurement of protein turnover of hundreds or thousands of proteins in complex mixtures. After metabolic labeling, the turnover dynamics of proteins can be determined based on the relative enrichment of heavy isotopes in peptides detected by mass spectrometry. In this protocol, a workflow is described for the generation of senescent fibroblast cultures and similarly arrested quiescent fibroblasts, as well as a simplified, single-time point pSILAC labeling time-course that maximizes coverage of anticipated protein turnover rates. Further, a pipeline is presented for the analysis of pSILAC mass spectrometry data and user-friendly calculation of protein degradation rates using spreadsheets. The application of this protocol can be extended beyond senescent cells to any non-dividing cultured cells such as neurons.

This protocol describes the workflow for metabolic labeling of senescent and non-dividing cells with pulsed SILAC, untargeted mass spectrometry analysis, and a streamlined calculation of protein half-lives.

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

생물학

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this yeast model is relevant to many organisms, including humans, since DNA repair and DNA damage response factors are well conserved across diverse species. However, S. cerevisiae has not yet been used to fully address whether the rate of accumulating mutations changes with increasing replicative (mitotic) age due to technical constraints. For instance, measurements of yeast replicative lifespan through micromanipulation involve very small populations of cells, which prohibit detection of rare mutations. Genetic methods to enrich for mother cells in populations by inducing death of daughter cells have been developed, but population sizes are still limited by the frequency with which random mutations that compromise the selection systems occur. The current protocol takes advantage of magnetic sorting of surface-labeled yeast mother cells to obtain large enough populations of aging mother cells to quantify rare mutations through phenotypic selections. Mutation rates, measured through fluctuation tests, and mutation frequencies are first established for young cells and used to predict the frequency of mutations in mother cells of various replicative ages. Mutation frequencies are then determined for sorted mother cells, and the age of the mother cells is determined using flow cytometry by staining with a fluorescent reagent that detects bud scars formed on their cell surfaces during cell division. Comparison of predicted mutation frequencies based on the number of cell divisions to the frequencies experimentally observed for mother cells of a given replicative age can then identify whether there are age-related changes in the rate of accumulating mutations. Variations of this basic protocol provide the means to investigate the influence of alterations in specific gene functions or specific environmental conditions on mutation accumulation to address mechanisms underlying genome instability during replicative aging.

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Mutation rates in young Saccharomyces cerevisiae cells measured through fluctuation tests are used to predict mutation frequencies for mother cells of different replicative ages. Magnetic sorting and flow cytometry are then used to measure actual mutation frequencies and age of mother cells to identify any deviations from predicted mutation frequencies.

어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...