HAC 리 타 알 렌 재단 (http://www.ritaallenfoundation.org)의 밀 튼 중 카셀 학자 이었다. 이 작품 HAC 우수성 그랜트 P50 GM071508의 국립 연구소의 종합 의료 과학 센터에서 (탐정 데이비드 Botstein), PhRMA 재단 그랜트 2007RSGl9572, 국립 과학 재단 부여 OCI-1047879 데이비드 8 월에 교부 금에 의해 투자 되었다 일반 의료 과학 R01 GM081686, 국립 연구소의 종합 의료 과학 R01 GM0866465, Eli의 국립 연구소 &#38; 재생 의학의 Edythe 넓은 센터 &#38; 줄기 세포 연구, 아이리스 칸토어 여자 건강 센터/UCLA CTSI NIH 그랜트 UL1TR000124, 그리고 백혈병 림프 종 사회입니다. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P50CA092131에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. HAC는 Eli의 멤버인 &#38; Edythe 넓은 재생 의학 센터 &#38; 줄기 세포 연구, UCLA 분자 생물학 연구소와 UCLA 생물 정보학 각 부처간 프로그램.

설명 하는 모든 실험은 프린스턴 대학, 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스에서 제도적 검토 보드에 의해 승인 되었다.
1. ActD 시간 코스에 대 한 확산 및 접촉 저해 Fibroblasts 준비
참고:이 프로토콜 사용 하는 timecourse 4 timepoints입니다. 3 생물학으로 독립적인 샘플 timepoint 당 1 개의 실험에서 다른 조직 문화 접시를 수집 하 여 수집 될 수 있습니다 또는 실험 세포의 서로 다른 문화를 여러 번 반복 될 수 있다. 우리의 경험에서 한 10 cm (직경) 조직 문화 접시 (1 접시) 분석에 대 한 충분 한 RNA를 제공합니다. 필요한 경우 각 timepoint에 셀의 수를 늘리기 위해 각 샘플에 대 한 여러 조직 문화 요리를 풀링된 수 있습니다. 또한, 진정으로 독립적인 생물 복제로 다른 개인에서 격리 하는 섬유 아 세포와 같은 실험을 수행할 수 있습니다.
<ol>
	<li>대 본 부패 분석에 대 한 셀의 확산 및 무부하 문화를 설정 합니다. 확산 셀 분할 셀 마다 3 일 동안 접촉 저해 세포 접촉 저해 되 고 있다.
	<ol>
		<li>접촉 저해 셀에 대 한 매체를 7 일 동안 매 2 일 변경. 2 일 전에 접촉 저해 fibroblasts 컬렉션에 대 한 준비가 proliferating 셀을 분할 합니다. 셀 문화 체계의 예는 그림 1에 표시 됩니다. 이 섹션의 나머지 단계는 설정 하 고 셀 분할에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>13설립된 프로토콜 따르면 신생아 피부에서 기본 피부 섬유 아 세포를 격리 합니다. 균질 인구를 위해 통로 섬유 아 세포입니다. 참고: 섬유 아 세포 냉동 및 해 동, 필요한 경우 될 수 있습니다.</li>
	<li>해 동 또는 필요한 경우 섬유 아 세포, replate. 37 ° C, 5% CO2조직 문화 인큐베이터에서 무 균 조건 하에서 10% 세럼과 DMEM에 섬유 아 세포 성장. 10 미만 구절에 대 한 성장 된 섬유 아 세포를 사용 합니다. 섬유 아 세포 이어야 한다 &#60; 80% 합칠 확산 및 무부하 인구 수 있도록 셀 분할의 날에.</li>
	<li>조직 배양 접시를 여러 접시, prewarm PBS, 트립 신, 및 보통 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 혈 청으로 분할.</li>
	<li>발음 또는 피펫으로 replated 될 세포와 각 조직 배양 접시에서 매체를 제거를 사용 하 여.</li>
	<li>각 접시 (10 mL 150 m m, 100 m m 플레이트에 대 한 솔루션의 5 mL, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL에 대 한 솔루션의) 12 잘 접시의 우물 1 mL에 피펫으로 따뜻한 PBS.</li>
	<li>Aspirate 또는 피펫으로 각 조직 배양 접시에서 PBS를 제거 하려면.</li>
	<li>부드럽게 피펫으로 1 트립 신-EDTA 각 접시 (8 mL 150 mm 접시, 100 m m, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL 및 12 잘 접시의 우물 1 mL에 대 한 솔루션의 3 mL에 대 한 솔루션의)에 x. 참고: 확인 1 살 균 10 diluting 하 여 트립 신-EDTA x 트립 신-EDTA 무 균 PBS에 x. 마지막 1 x 솔루션 0.05 %trypsin 및 0.02 %EDTA 이어야 한다.</li>
	<li>5 분에 대 한 셀과 트립 신을 품 어.</li>
	<li>부드럽게 접시 꺼내 접시에서 셀을 누릅니다.</li>
	<li>피펫으로 세포를 단일 세포 현 탁 액으로 resuspend.</li>
	<li>10% 세럼 150 m m 플레이트, 100 mm 접시, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL에 대 한 솔루션의 3 mL에 대 한 솔루션의 (8 mL과 DMEM의 동일한 볼륨을 포함 하는 원뿔 튜브 셀 trypsin 솔루션에 전송 그리고 12의 우물 1 mL 잘 접시).</li>
	<li>트립 신을 제거 하려면 1000 x g 에서 5 분간 4 ° C에서 셀 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>매체와 카운트의 적절 한 볼륨에 셀 셀 농도 결정 하는 hemacytometer와 resuspend.</li>
	<li>확산에 대 한 100 m m 조직 문화 접시 당 씨앗 5 x 105 세포와 접촉 저해 셀.</li>
	<li>이 메서드를 사용 하 여 확산 하 고 접촉 저해 샘플 분석 (그림 1)에 필요한 설정 합니다.</li>
</ol>
2. ActD 시간 코스
<ol>
	<li>ActD 1 mg/mL (ActD, 살 균 PBS의 사용 950 µ L 및 살 균 DMSO의 50 µ L의에 대 한 1 밀리 그램)의 재고 농도에서 resuspend. 참고: ActD의 냉동된 재고 솔루션 안정 되어야 한 달-20 ° c.에 대 한 희석 솔루션은 무시 되 고 더 사용 하기 위해 저장 하지 해야 합니다.</li>
	<li>모든 생물 복제 세포 배양 접시를 위한 prewarmed 매체의 적절 한 볼륨 ActD 추가 0, 120, 240, 그리고 480 분 timepoints (그림 2) 설정 했다. ActD 매체의 mL 당 15 µ g의 농도에 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 오래 된 매체 떨어져 발음 ActD 포함 된 매체에 있는 셀에 추가.
	<ol>
		<li>1 mg/mL 주식에 대 한 추가 15 µ L 150 µ L을 추가 하는 매체, 예를 들어, 100 mm 접시에 대 한 매체의 10 ml의 각 ml ActD ActD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>제로 timepoint 샘플을 수집, 부드럽게 ActD 매체를 피펫으로 발음 하는 셀에 PBS를 prewarmed. 피펫으로 100 m m, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL 및 12 잘 접시의 우물 1 mL에 대 한 솔루션의 5 mL 150 mm 접시에 대 한 솔루션의 10 mL.</li>
	<li>부드럽게 발음 또는 피펫으로 PBS에서. 참고: RNA 격리를 포함 하는 모든 단계는 RNase 무료 물, RNase 무료 microcentrifuge 튜브, RNase 무료 펫과 수행 되어야 한다. 장갑 착용 하 고 RNA와 함께 작업 하는 경우에 자주 변경 해야 합니다.</li>
	<li>조직 문화 접시에 직접 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 (1 mL/10-cm 플레이트 4 x 105 4 x 107 셀)을 추가 합니다. 참고: 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션은 세포를 lysing 서로 다른 RNA, DNA, 그리고 단백질을 분리 하는 동안 RNA 품질을 유지 하는 monophasic 솔루션. 주의: 페 놀 및 guanidine isothiocyanate은 부식성. 적절 한 보호를 사용 합니다.</li>
	<li>피펫으로 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션-셀 혼합 균질 혼합물을 만들기 위해 여러 번 왔다 갔다. 참고: 또는 최대 1 년-20 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 lysate를 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>후 적절 한 양의 시간 단계 2.3-2.6에 설명 된 방법을 사용 하 여 각 시간 포인트를 수집 합니다.</li>
</ol>
3. 페 놀 guanidine Isothiocyanate 솔루션 Lysate에서 총 RNA 격리
<ol>
	<li>RNA-단백질 복합물의 완전 한 해체를 위해 5 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어. 참고: 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 프로토콜의 단계 다른 설명이 없는 한 상 온에서 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>방법론 사용으로 검출 될 수 있는 제어 스파이크에 녹취 록을 소개 합니다.</li></ol>알려진된 수량 및 농도에 각 샘플에 이러한 컨트롤을 소개 합니다. 참고: 외부 RNA 제어 컨소시엄 (ERCC) 스파이크 컨트롤 믹스14 특별히 설계 되었습니다 스파이크에서 컨트롤로 RNA-이 대 한 그것은 또한 북부 오 점 또는 실시간 정량에 대 한 사용할 수 있습니다. 스파이크에 컨트롤 microarray 기술을 위해 특별히 설계 된 제공 ( 테이블의 자료참조)도 있습니다.
	<li>Microcentrifuge 튜브 2.0 mL를 피펫으로에 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 혼합물을 전송. 사용 된 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션의 모든 1 mL에 대 한 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 혼합물에 0.2 mL 클로 프롬을 추가 (예를 들어, 1.5 mL 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 혼합물에 추가 하는 0.3 mL 클로 프롬).</li>
	<li>15 microcentrifuge 튜브를 적극적으로 흔들어 s 다음 3 분 동안 실 온에서 클로 프롬-페 놀-guanidine isothiocyanate 혼합물을 품 어 고.</li>
	<li>4 ° c.에 20 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 회전 참고: 초기 스핀 후 샘플 해야 별도 레이어로 3-상단 (그림 3)에 명확한 수성 층 그리고 바닥, 화이트/핑크 interphase, 중간에 빨간색 유기 층.</li>
	<li>수성 층 새로운 2.0 mL microcentrifuge 튜브는 micropipette를 사용 하 여 전송. 참고: 수이 과정 동안에 interphase를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 수 분수의 일부 떠날 괜찮습니다. 또한 interphase 레이어는 interphase 등의 일부를 포함 하도록 레이어 DNA와 RNA를 오염 시킬 것 보다는 수성 분수의 일부를 두고 하는 것이 낫다. 수성 층이 됩니다 약 절반 초기 볼륨, 그래서 약 0.9 mL의 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션/클로 프롬 혼합물은 1.8 mL.</li>
	<li>Interphase 및 유기 분수를 삭제 합니다.</li>
	<li>수성 분수 2-프로 판 올의 동일한 볼륨을 추가 하 고 반전 튜브 10 번. 수익률 10 미만6 셀 수집 때문에 낮을 것으로 예상 된다 하는 경우에 특히 샘플의 20 µ L 당 glycogen의 20 mg/mL 용액의 최대 1 µ L를 추가 합니다. 참고:이 조밀 하 고, 단단한 펠 릿 스핀 단계 후 모니터링을 쉽게 발생 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 실내 온도에 샘플을 품 어.</li>
	<li>4 ° c.에 20 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 회전 되도록,이 회전의 끝에, RNA는 튜브의 하단에 흰색 펠 릿을 형성 시 켰 던.</li>
	<li>피 펫, 제거와 상쾌한 화이트 RNA 펠 렛을 방해 하지 특별 한 주의가지고 삭제. 참고: 초과 에탄올을 제거 하는 손잡고 개최 하는 느슨한 피펫으로 팁을 사용할 수 있습니다. RNA 펠 릿 방해 하지만 삭제 하지 탐정 스핀을 반복 하 고 다시는 상쾌한을 제거 수 있습니다. 이 전체 절차를 반복 조사를 요구할 것 이다으로 펠 릿을 삭제 하지 마십시오.</li>
	<li>75% 에탄올과 물의 25 %nuclease 무료 솔루션을 준비 합니다. 펠 릿을 세척 하 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 시 약의 1 mL 당 75% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 회전</li>
	<li>제거한 후에 상쾌한의 대부분를 피펫으로 사용 하 여 여전히 복용 하지 않도록 주의 펠 렛을 방해 하는 동안 최대한 많은 에탄올을 제거. 참고: RNA 펠 릿이이 단계에서 적은 소형 이며 이동 하는 경향이 있다. RNA를 손실 되지 않도록 하려면이 시점에서 펠 릿을 처리할 때 특별히 주의 해야 합니다.</li>
	<li>펠 렛의 모든 초과 에탄올을 실 온에서 2 분에 대 한 샘플 12000 x g 회전.</li>
	<li>사용 하는 펠 렛을 방해 하지를 돌보는 micropipette 튜브에서 모든 초과 에탄올을 제거 합니다.</li>
	<li>RNA 펠 릿 어 5 분 동안 건조 하자.</li>
	<li>RNA 펠 릿을 nuclease 무료 물 50 µ L을 추가 하 고 resuspend nuclease 무료 물 속에서 펠 릿.</li>
	<li>샘플 1 µ L 치료 DNase (2 단위 / µ L) DNA를 제거 하 고 다음 비활성화 DNase 및 양이온 ( 재료의 표참조)를.</li>
	<li>-80 ° c.에 2.0 mL microcentrifuge 튜브에 RNA 샘플 저장</li>

4입니다. 성적 풍부의 분석
<ol>
	<li>RNA를 계량 하 고 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여에 대 한 RNA를 확인 합니다. 참고: 260에서 흡 광도의 비율 280 nm nm RNA에 대 한 약 2.0 이어야 한다.</li>
	<li>1 %agarose 젤 또는 저하의 정도 시각화 하는 해당 기술 RNA를 분석 합니다. 참고: 두 취소 18S를 대표 하는 밴드 그리고 28S rRNA 명확 하 게 보이는 (그림 4)를 해야 한다. 이러한 밴드 표시 되지 않는 경우 RNA 저하 될 수 있습니다. 문제 촬영 팁 RNA 저하에 대 한 토론에 제공 됩니다.</li>
	<li>모니터 대 본 풍부한 RNA의 수집된 aliquots에 비해 아군에 내부 표준 microarrays15, RNA-Seq16,17, 실시간 정량 Pcr 사용 하 여 또는 북부 몰아내고18.
	<ol>
		<li>알려진 풍요의 제어 아군에 비해 각 시간 지점에서 각 사본에 대 한 풍부를 결정 합니다. 참고: microarrays, 값 형광 강렬 될 것입니다. 북부 오 점, x 선 필름에 밴드를 측정할 수 있습니다. 실시간 정량 pcr, 2-σσCT 방법19알려진된 표준 비교해보면 사본 풍부를 확인할 수 있습니다. RNA-Seq에 대 한 정규화 된 값은 FPKM 또는 kilobase 백만 읽기 매핑된 당 exon의 당 조각으로 확인할 수 있습니다. Isoform 특정 감소율에 대 한 RNA-Seq 데이터 DEXSeq20같은 isoform 인식 방법론을 사용 하 여 분석 수 있습니다. Isoform 특정 감소율은 최고의 RNA이 결정 Microarray 데이터 결정 될 경우, 유전자에 의해 유전자 단위가 아닌 프로브, 프로브 기초 데이터를 분석 해야 합니다. 애 널 리스트는 감지기의 제한 된 수의 정보를 해석할 때 주의 해야 합니다. 예를 들어, 5 이하의 프로브 특정 isoform에 대해 유익 하지 않은 있을 수 있습니다. 이 경우에, 분석 결과 신뢰할 수 있는 이러한 프로브 동작 충분히 일관 되는지 확인 해야 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C-Myc 및 자신감을 요금을 정확 하 게 감지 했다 그 성적 부패를 GAPDH 처럼 천천히 부패 유전자 처럼 급속 하 게 부패 유전자 분석에 수집 된 샘플에서 격리 된 RNA17 에 실시간 정량 Pcr을 수행 합니다. 참고: 추가 확인에 대 한 isoform 특정 실시간 정량 프로브 개발 고21동안 특정 isoforms의 풍부를 모니터링 하는 데 사용.</li>
</ol>
5입니다.감퇴 속도 상수 결정
<ol>
	<li>각 timepoint에 대 한 로그-변환 (유전자 또는 isoform 특정) 각 사본에 대 한 풍부한 값입니다. 참고: 로그 변환 값으로 변환 됩니다 지 수 감퇴 곡선 선형 감퇴 모델22로 들어갈 수 있는 라인.</li>
	<li>각 대 본 (유전자 또는 isoform 특정) 선형 감퇴 모델에 대 한 식 프로 파일에 맞게. 이러한 모델에 대 한 공식은 f (t) = C-r * t. 이 방정식에 C는 녹취 록의 시작을 나타냅니다 상수, r의 감소, 속도 이며 t는 시간 실험의 처음부터. 이 방정식에서 r*ln(10)와 감퇴 속도 결정 (참조11참조). 참고: maSigPro 소프트웨어 패키지는 회귀 기반 접근 시간 코스 데이터23에 중요 한 유전자 식 프로필 차이 탐지 하도록 설계 되었습니다. 샘플 코드 및 maSigPro에 대 한 결과에 사용할 수 있습니다: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.</li>
	<li>필터 로그 선형 감퇴 모델에 맞게 실패 하는 유전자를. 이 ANOVA F-검정을 수행할 수 있습니다. 참고: F 검정은 유사로 정의 되는 F-통계, 기반 샘플 의미 샘플 내에서 변이 나눈 사이. 선형 스텝 업 Benjamini 및 Hochberg 거짓 발견 절차24를 적용 하 여 여러 비교에 대 한 p 값을 수정 합니다. Q 값 F-검정 0.05 보다 큰 로그 선형 감퇴 모델에 맞게 실패 하는 유전자는 컷오프로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>여 지 없이 세포 주기 상태와 시간 사이 중요 한 상호 작용 기간 성적을 결정 하는 ANOVA F-검정을 수행 (틀린 발견 비율, 루즈벨트 &#60; 0.05).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+reveals+multiple+pathways+for+unique+regulation+of+mRNA+decay+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).</li><li>Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. 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E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+mRNA+decay:+methodologies,+pathways,+and+links+to+other+stages+of+gene+expression.">Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression.</a> J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).</li><li>Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+half-life+measurements+in+mammalian+cells.">Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells.</a> Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).</li><li>Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay.">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).</li><li>Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells.">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li><li>Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+dynamics+of+microRNAs+revealed+by+a+novel+pulse-chase+approach.">Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach.</a> Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.

정지는 mitogens 또는 혈 청의 철수, 세포 접착 및 접촉 금지의 부족을 포함 하는 외부 신호에 의해 유도 될 수 있다. 접촉 금지, 정지, 유도 대 한 여러 가지 방법 중 하나는 세포 증식 세포 주기 세포 세포 접촉에 대 한 응답에서 종료 매우 진화론 보존된 과정 이다. 우리는 정지를 유도 하는 방법의 예를 들어 접촉 저해에 여기 초점. 이전 연구 보고가 셀 셀 문의 예측에 관한 속25에 ?...

성적 증명서의 정상 상태 수준 반영 성적 종합과 성적 부패의 기여. 규제 및 조정된 대 본 부패는 제어 생물 학적 과정1,2,,34중요 한 메커니즘입니다. 예를 들어 성적 감소율 염증 성 cytokine 종양 괴 사 인자5활성화 다음 이벤트의 시간 시리즈에 기여할 표시 되었습니다.
우리는 이전 확산 및 기본 인간 섬유 아 세포에 정지 사이 과도 많은 유전자6의 증명서 수준에 변화와 관련 된 나타났습니다. 이러한 변화 중 일부 녹음 방송 요인의 활동에 이러한 두 상태 사이의 차이 반영합니다.
녹취 록의 부패 속도 변화 또한 두 개의 서로 다른 상태7,8대 본 식 수준에 변화에 기여할 수 있다. 확산 및 정지 사이 과도 여러 microRNAs9의 수준에 변화와 관련 된 우리의 이전 연구 결과 바탕으로, 우리는 또한 변화에 차동 성적 부패에서 기여 여부 요청 무부하 fibroblasts 대 확산에 진 식입니다.
사본을 안정성을 모니터 하기 위해 우리는 성적 무부하 셀 대 확산에 게놈 넓은 감퇴의 속도 결정. 이를 위해, 우리는 새로운 전사의 억제제를 소개 하 고는 개별 성적표 사라진 시간이 지남에 속도 모니터링 하 여 무부하 fibroblasts 대 확산에 감소율 모니터링. 이 방법의 장점은, 단순히 새로운 사본 합성을 억제 함으로써 전체적인 유전자 발현을 모니터링 하는 방법에 비해 우리가 된다는 것에서 그들은 속도는 별도로이 성적에 대 한 부패 속도 확인할 수 복사할 수 있습니다.
새로운 전사를 억제 하 여 사본 감소율을 결정 ActD 치료 여러 이전의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. ActD 프로 염증 성 cytokines5치료에 기인 하는 사본 풍부에서에 RNA 안정성의 중요성을 해 부에 사용 되었습니다. 유사한 접근은 또한 그들은 차별화 된 근육 형10채택 차별화 된 C2C12 셀 대 확산 성적 부패 속도 차이 해 부하 사용 되었습니다. 또 다른 예로, 글로벌 mRNA 반감기 또한 만능에서 발견 된 하 고 차별화 된 마우스 배아 줄기 세포11. 이 예제에서 mRNA 감퇴 사본 풍부 규제에 대 한 및 다른 셀 상태를 셀의 변환에 대 한 중요 한 표시 되었습니다.
아래 설명 된 방법을 적용, 섬유 아 세포 확산 및 무부하 상태12에 비교할 때 약 500 유전자의 사본 감소율에 변화를 발견 우리. 특히, 우리는 예측에 관한 미르 29, downregulated 무부하 셀에는 대상 셀 전환 정지 때 안정화는 발견 했다. 여기 우리 확산 및 무부하 셀에 감소율을 결정 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법론은 급속 하 게 부패 유전자에 대 한 정보는 때 두 비슷한 조건 하지만 뚜렷한 글로벌 mRNA 감퇴 속도 비교 유용 합니다. 그것은 또한 2 차원 3 차원 문화 대에서 성적 부패, 예를 들어, 셀 문화 조건의 효과 등 다른 질문을 해결 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 감소율 등 microarrays RNA 시퀀스 또는 실시간 정량 Pcr 방법 결정된 게놈 넓은 수 또는 북부 blotting 유전자, 유전자 또는 isoform에 의해 isoform 기준 감소율을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 요금은 각 모니터링된 유전자의 반감기를 계산 하 고 부패 속도 두 가지 조건에 다른 유전자를 식별 하 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:809px;" width="809">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4&#176;C</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Equipment for running agarose gels</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Sterile tissue culture plates and conical tubes</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-118</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">35-010-CV</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:291px;">Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td style="width:237px;">For decontaminating work surfaces from RNase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">2.0 ml eppendorf tubes</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Trypsin-EDTA&#160; Solution 10X</td>
			<td style="width:163px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002-07-07</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:291px;">Sterile PBS</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-250</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Trizol</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15596018</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:163px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1410-2 mg</td>
			<td style="width:237px;">inhibits transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Sterile DMSO</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31-761-00ML</td>
			<td style="width:237px;">solvent for actinomycin D</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN19400225</td>
			<td style="width:237px;">MP Biomedicals, Inc product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2618500</td>
			<td style="width:237px;">molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ethanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP28184</td>
			<td style="width:237px;">molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution)</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0551</td>
			<td style="width:237px;">carrier for RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:291px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1907</td>
			<td style="width:237px;">removes DNA with DNase, then, in a subsequent step,&#160; inactivates DNA and removes divalent cations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Agarose</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN820721</td>
			<td style="width:237px;">MP Biomedicals, Inc product</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Loading dye for RNA gel</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0641</td>
			<td style="width:237px;">suitable even for denaturing electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Millenium RNA markers</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM7150</td>
			<td style="width:237px;">RNA ladder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">One-color RNA Spike-in Kit</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technology</td>
			<td style="width:119px;">5188-5282</td>
			<td style="width:237px;">Example spike-in control for Agient microarray analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Tris base</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td style="width:237px;">molecular biology grade, for TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A38-500</td>
			<td style="width:237px;">for TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">EDTA</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td style="width:237px;">electrophoresis grade, for gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:163px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td style="width:237px;">for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4456740</td>
			<td style="width:237px;">Spike-in control for RNA Seq</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">RS-122-2101</td>
			<td style="width:237px;">for RNA Seq</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">96-well 0.3 ml PCR plate</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AB-0600</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Microseal B adhesive seals</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MSB1001</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89094-662</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM12230</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">SuperScript Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18090010</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining genome-wide transcript decay rates in proliferating and quiescent human fibroblasts

정지는 임시, 가역 상태 셀 세포 분열을 중지 해야 하지만 증식 하는 능력을 유지. 우리를 포함 한 여러 연구 정지 관련 유전자 발현에 광범위 한 변화 된가 설명 했다. 이러한 변화 중 일부는 수준 또는 확산 관련 된 녹음 방송 요인 E2F MYC 등의 활동에 변화를 통해 발생합니다. 우리 mRNA 감퇴 확산 및 무부하 셀 사이의 유전자 발현에서 변화에도 기여할 수 있다 설명 했다. 이 프로토콜에서 우리 인간의 피부 포 피 섬유 아 세포의 증식 및 무부하 문화를 설정 하기 위한 절차를 설명 합니다. 우리는 다음 악티노마이신 d (ActD) 확산 및 무부하 셀에 새로운 전사를 억제 하는 절차를 설명 합니다. ActD 치료 성적 부패에서 새로운 전사 해리를 간단 하 고 재현성 접근을 나타냅니다. ActD 치료의 단점은 ActD 세포 생존 능력에 영향을 하기 때문에 시간 코스는 짧은 시간 프레임에 제한 되어야 한다입니다. 대 본 수준 사본 감소율을 확인 하려면 시간이 지남에 모니터링 된다. 이 절차는 유전자와 무부하 fibroblasts 대 확산에 차동 부패 하는 isoforms의 식별에 대 한 수 있습니다.

우리 이전 8 시간 코스12통해 확산 및 접촉 저해 기본 인간 섬유 아 세포에서 사본 감소율의 microarray 분석의 결과 보고 있다. 확산 및 접촉 저해 fibroblasts 비교 성적 안정성에 중요 한 변화는 유전자 목록이 보충 표 1에 제공 됩니다. 형광 강도 ActD 치료 후 시간 코스 이상과 시간 0에 제공 됩니다. 유전자는 ANOVA F-검정을 사용 하 여 확산 하 고 접?...

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Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

우리 성적 감소율, 모니터링 및 차동 부패 유전자 식별 생성 확산 및 무부하 기본 인간 피부 섬유 아 세포 프로토콜을 설명 합니다.

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

6.1K 조회수.  University of California, Los Angeles. 우리 성적 감소율, 모니터링 및 차동 부패 유전자 식별 생성 확산 및 무부하 기본 인간 피부 섬유 아 세포 프로토콜을 설명 합니다.

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siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

연구

유전학

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

ATAC Seq에 의해 기본 인간 T 림프 톨에 게놈 넓은 접근 Chromatin 매핑

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Bemisia tabaci Cytogenetic 기술을 사용 하 여 계란 수정 속도 결정

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...