HAC fu lo studioso di Milton E. Cassel della Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni per HAC dal National Institute of General Medical Sciences centro della sovvenzione di eccellenza GM071508 P50 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 ad agosto David, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Istituto nazionale di scienze mediche generali R01 GM0866465, Eli &#38; Edythe Broad centro di medicina rigenerativa &#38; ricerca sulle cellule staminali, centro salute/UCLA CTSI NIH delle donne Iris Cantor Grant UL1TR000124 e alla Leukemia Lymphoma Society. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Cancer Institute del National Institutes of Health, sotto Premio numero P50CA092131. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. HAC è un membro della Eli &#38; Edythe Broad centro di medicina rigenerativa &#38; Stem Cell Research, l'Istituto di biologia molecolare di UCLA e il programma interdipartimentale di bioinformatica di UCLA.

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati da Institutional Review Boards presso la Princeton University e la University of California, Los Angeles.
1. preparare fibroblasti proliferanti e contatto-inibito ActD tempo corso
Nota: Questo protocollo utilizza un timecourse con quattro punti temporali. Tre campioni biologicamente indipendenti possono essere raccolti al timepoint raccogliendo le piastre di coltura di tessuti diversi in un esperimento, o l'esperimento può essere ripetuto più volte con diverse culture di cellule. Nella nostra esperienza, un piatto di coltura del tessuto di 10 cm (diametro) (una piastra) fornisce sufficiente RNA per l'analisi. Se necessario, più piatti di coltura del tessuto possono essere pool per ogni campione aumentare il numero delle cellule presso ogni timepoint. Inoltre, lo stesso esperimento può essere eseguito con fibroblasti isolati da diversi individui come replica biologico veramente indipendente.
<ol>
	<li>Stabilire proliferanti e quiescenti culture di cellule per l'analisi di decadimento di trascrizione. Per le cellule di proliferazione, dividere le celle ogni tre giorni mentre le cellule di contatto-inibito stanno diventando contatto-inibita.
	<ol>
		<li>Per le cellule di contatto-inibito, cambiare il mezzo ogni 2 giorni per 7 giorni. Dividere le cellule proliferanti 2 giorni prima che i fibroblasti hanno inibito contatto sono pronti per il ritiro. Nella Figura 1è riportato un esempio di un sistema di coltura cellulare. I passaggi rimanenti in questa sezione forniscono un protocollo dettagliato per stabilire e spaccare le cellule.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Isolare i fibroblasti cutanei primari da neonatale pelle secondo protocolli stabiliti13. Fibroblasti di passaggio per garantire una popolazione omogenea. Nota: I fibroblasti possono essere congelati e scongelati, se necessario.</li>
	<li>Scongelare o replate fibroblasti, se necessario. Crescere i fibroblasti in DMEM con 10% siero in condizioni sterili in una coltura tissutale incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Utilizzare fibroblasti che sono state coltivate per meno di 10 passaggi. Fibroblasti dovrebbero essere &#60; 80% confluenti il giorno della scissione alle cellule di produrre popolazioni proliferanti e quiescenti.</li>
	<li>Per dividere una piastra di coltura del tessuto in piastre multiple, preriscaldare PBS, tripsina e mezzo con siero in bagnomaria a 37 ° C per 20 min.</li>
	<li>Aspirare o utilizzare una pipetta per rimuovere il mezzo da ciascuna piastra di coltura del tessuto con le cellule per essere replated.</li>
	<li>Dispensare caldo PBS su ogni piatto (10 mL di soluzione per un piatto di 150 mm, 5 mL di soluzione per un piatto di 100 mm, 2 mL per un pozzetto di una piastra ben 6) e 1 mL per un pozzetto di una piastra ben 12.</li>
	<li>Aspirato o una pipetta per rimuovere PBS da ciascuna piastra di coltura del tessuto.</li>
	<li>Delicatamente dispensare 1 x tripsina-EDTA su ogni piatto (8 mL di soluzione per un piatto di 150 mm, 3 mL di soluzione per un piatto di 100 mm, 2 mL per un pozzetto di una piastra ben 6 e 1 mL per un pozzetto di una piastra ben 12). Nota: Fare 1 x tripsina-EDTA diluendo sterile 10 x tripsina-EDTA in PBS sterile. La soluzione finale 1 x dovrebbe essere 0.05% tripsina e 0,02% EDTA.</li>
	<li>Incubare la tripsina con le cellule per 5 min.</li>
	<li>Picchiettare delicatamente la piastra per sloggiare le cellule dalla piastra.</li>
	<li>Pipetta per risospendere le cellule in sospensione unicellulare.</li>
	<li>Trasferire le cellule in soluzione di tripsina in una provetta conica contenente lo stesso volume di DMEM con 10% siero (8 mL di soluzione per un piatto di 150 mm, 3 mL di soluzione per un piatto di 100 mm, 2 mL per un pozzetto di una piastra ben 6 e 1 mL per un pozzo di un 12 ben piatto).</li>
	<li>Rotazione verso il basso le cellule a 4 ° C per 5 minuti a 1.000 x g per rimuovere tripsina.</li>
	<li>Risospendere le cellule in un volume adeguato di medie e totali con un emocitometro per calcolare la concentrazione cellulare.</li>
	<li>Seme 5x105 per piastra di coltura del tessuto di 100 mm per la proliferazione e ha inibito contatto cellule.</li>
	<li>Utilizzando questo metodo, stabilire i campioni proliferanti e inibito di contatto necessari per l'analisi (Figura 1).</li>
</ol>
2. ActD tempo corso
<ol>
	<li>Risospendere ActD in stock concentrazione di 1 mg/mL (per 1 mg di ActD, uso 950 µ l di PBS sterile e 50 µ l di DMSO sterile). Nota: Soluzioni di riserva congelati di ActD dovrebbero essere stabile per un mese a-20 ° C. Soluzioni diluite dovrebbero essere scartati e non memorizzati per un ulteriore uso.</li>
	<li>Aggiungere ActD il volume appropriato di mezzo preriscaldata per tutta la cultura biologica delle cellule replica piastre che per circa 0, 120, 240 e 480 min punti temporali (Figura 2). Aggiungere ActD ad una concentrazione di 15 µ g / mL di terreno. Mescolare bene, aspirate fuori il vecchio mezzo e aggiungere il terreno ActD-contenente le celle.
	<ol>
		<li>Per un 1 mg/mL di brodo, aggiungere 15 µ l ActD per ogni mL di terreno, ad esempio, per 10 mL di terreno per un piatto di 100 mm, aggiungere 150 µ l ActD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Per raccogliere il campione di timepoint zero, delicatamente aspirate fuori ActD medio e dispensare preriscaldata PBS sulle celle. Pipettare 10 mL di soluzione per un piatto di 150 mm, 5 mL di soluzione per un piatto di 100 mm, 2 mL per un pozzetto di una piastra ben 6 e 1 mL per un pozzetto di una piastra ben 12.</li>
	<li>Aspirare delicatamente o una pipetta il PBS. Nota: Tutti i passaggi che comportano isolamento del RNA devono essere eseguiti con acqua RNAsi-libera, RNAsi-libera per microcentrifuga e pipette RNAsi-libera. Guanti devono essere indossati e cambiati frequentemente quando si lavora con RNA.</li>
	<li>Aggiungere soluzione di fenolo-guanidina isotiocianato (1 mL/10 cm piastra con 4 x 105 a 4 x 107 cellule) direttamente alla piastra di coltura del tessuto. Nota: Fenolo-guanidina isotiocianato soluzione è una soluzione monofasica che mantiene la qualità di RNA durante la lisi di cellule e che separa il RNA, DNA e proteine da altro. Attenzione: Fenolo e guanidina isotiocianato sono corrosivi. Utilizzare una protezione appropriata.</li>
	<li>Miscela a dispensare il fenolo-guanidina isotiocianato soluzione-cella su e giù più volte per ottenere un impasto omogeneo. Nota: Fenolo-guanidina isotiocianato soluzione lisato può essere conservata a 4 ° C durante la notte o a-20 ° C per fino a un anno.</li>
	<li>Raccogliere ogni punto di tempo dopo la giusta quantità di tempo è passato usando il metodo descritto in passaggi 2.3-2.6.</li>
</ol>
3. isolamento di RNA totale da fenolo-guanidina isotiocianato soluzione lisato
<ol>
	<li>Incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 min garantire la completa dissoluzione dei complessi RNA-proteina. Nota: Se non specificato diversamente, i passaggi del protocollo fenolo-guanidina isotiocianato soluzione possono essere eseguiti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Introdurre le trascrizioni di spike-a controllo che possono essere rilevate con la metodologia utilizzata.</li></ol>Introdurre questi controlli in ogni campione a una quantità nota e concentrazione. Nota: L'esterno RNA controllo Consorzio (ERCC) spike-in controllo mix14 è stato specificamente progettato come un controllo di spike per RNA-seq. Può essere utilizzato anche per le macchie nordiche o qPCR in tempo reale. Spike-in controlli progettati specificamente per le tecnologie di microarray sono anche disponibili (Vedi Tabella materiali).
	<li>Trasferire la miscela di soluzione di fenolo-guanidina isotiocianato ad un tubo del microcentrifuge 2,0 mL con una pipetta. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio per la miscela di soluzione fenolo-guanidina isotiocianato per ogni 1 mL di soluzione di fenolo-guanidina isotiocianato utilizzata (ad esempio, aggiungere 0,3 mL di cloroformio per 1,5 mL fenolo-guanidina isotiocianato soluzione miscela).</li>
	<li>Agitare il tubo del microcentrifuge vigorosamente per 15 s e poi incubare fenolo-cloroformio-guanidina isotiocianato miscela a temperatura ambiente per 3 min.</li>
	<li>Spin di campioni a 12.000 x g per 20 minuti a 4 ° C. Nota: Dopo la rotazione iniziale, il campione dovrebbe separare in 3 strati - un strato organico rosso presso il fondo, un interfase bianco/rosa nel mezzo e uno strato acquoso limpida in alto a sinistra (Figura 3).</li>
	<li>Trasferire lo strato acquoso ad un nuovo tubo del microcentrifuge 2,0 mL utilizzando una micropipetta. Nota: Fare attenzione a non disturbare l'interfase durante questo processo. Va bene a lasciare alcuni della frazione acquosa. È meglio lasciare alcuni della frazione acquosa che includendo anche alcuni degli strati interfase, come comprendente l'interfase strato sarebbe contaminare il RNA con il DNA. Lo strato acquoso sarà circa la metà del volume iniziale, così circa 0,9 mL se la miscela di soluzione/cloroformio fenolo-guanidina isotiocianato era 1,8 mL.</li>
	<li>Eliminare l'interfase e frazioni organiche.</li>
	<li>Aggiungere un volume equivalente di 2-propanolo per la frazione acquosa e capovolgere la provetta 10 volte. Aggiungere fino a 1 µ l di 20 mg/mL di soluzione acquosa di glicogeno a 20 µ l di campione, soprattutto se il rendimento dovrebbe essere basso perché meno di 106 cellule sono stati raccolti. Nota: Questo si tradurrà in un pellet denso, tinta che è facile da monitorare dopo la procedura di selezione che seguono.</li>
	<li>Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 min.</li>
	<li>Spin di campioni a 12.000 x g per 20 minuti a 4 ° C. Garantire che, alla fine di questo giro, il RNA ha precipitato per formare una pallina bianca nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Con una pipetta, rimuovere e scartare il surnatante prestando particolare cura per non disturbare il pellet di RNA bianco. Nota: Un suggerimento di dispensare sciolto tenuto in mano può essere utilizzato per eliminare l'etanolo in eccesso. Se la pallina del RNA è disturbata, ma non eliminata, lo sperimentatore può ripetere lo spin e rimuovere il surnatante nuovamente. Evitare scartando il pellet come questo richiederà l'investigatore a ripetere l'intera procedura.</li>
	<li>Preparare una soluzione di acqua esente da nucleasi etanolo e 25% 75%. Aggiungere 1 mL di etanolo al 75% a 1 mL di fenolo-guanidina isotiocianato soluzione reagente a lavare la pallina.</li>
	<li>Spin di campioni a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Dopo aver rimosso la maggior parte del surnatante, utilizzare una pipetta per rimuovere quanto più etanolo come possibile, mentre ancora avendo cura di non disturbare il pellet. Nota: La pallina del RNA è meno compatta in questa fase e tende a spostarsi. Fate molta attenzione quando si maneggia il pellet a questo punto per evitare di perdere il RNA.</li>
	<li>Girare i campioni 12.000 x g per 2 min a temperatura ambiente a pellet tutti etanolo in eccesso.</li>
	<li>Rimuovere tutti i etanolo in eccesso dalla provetta utilizzando una micropipetta avendo cura di non disturbare il pellet.</li>
	<li>Lasciare asciugare per 5 min l'aria di pellet di RNA.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di acqua priva di nucleasi alla pallina del RNA e risospendere il pellet in acqua privo di nucleasi.</li>
	<li>Trattare i campioni con 1 µ l della dnasi (2 unità / µ l) per rimuovere il DNA e quindi inattivare DNasi e cationi (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Conservare i campioni di RNA in microcentrifuga 2,0 mL a-80 ° C.</li>

4. analisi dell'abbondanza di trascrizione
<ol>
	<li>Quantificare il RNA e verifica RNA per purezza utilizzando uno spettrofotometro. Nota: Il rapporto di assorbanza a 260 nm a 280 nm dovrebbe essere circa 2.0 per RNA.</li>
	<li>Analisi del RNA con un gel di agarosio all'1% o un'equivalente tecnologia per visualizzare la misura della degradazione. Nota: Due chiari bande che rappresentano 18S e 28S rRNA dovrebbe essere chiaramente visibile (Figura 4). Se queste bande non sono visibili, il RNA potrebbe essere compromesse. Difficoltà tiro suggerimenti per degradazione del RNA sono forniti nella discussione.</li>
	<li>Abbondanza di trascrizione di monitor nelle aliquote raccolte di RNA rispetto a spillo-in standard interno utilizzando microarrays15, RNA-Seq16, in tempo reale qPCR17, o Northern blots18.
	<ol>
		<li>Determinare l'abbondanza per ogni trascrizione in ciascun punto di tempo rispetto a un controllo a spillo-in abbondanza noto. Nota: Per i microarrays, i valori saranno intensità di fluorescenza. Per le macchie nordiche, bande sulla pellicola di raggi x possono essere quantificati. Per qPCR in tempo reale, abbondanza di trascrizione può essere determinato dal confronto con standard noti con il 2- σσCT metodo19. Per RNA-Seq, valori normalizzati possono essere determinati come FPKM o frammenti per kilobase dell'essone per milione letture mappato. Per i tassi di decadimento isoforma-specifici, RNA-Seq dati possono essere analizzati utilizzando metodologie isoforma-consapevole come DEXSeq20. I tassi di decadimento isoforma-specifici sono meglio determinati con RNA-seq. Se sono da determinarsi con dati di microarray, quindi i dati devono essere analizzati su una base di sonda, piuttosto che una base di gene di gene. L'analista deve essere attento quando si interpretano le informazioni da un numero limitato di sonde. Per esempio, ci possono essere 5 o meno sonde che sono ben informative su una particolare isoforma. In questo caso, l'analista sarà necessario determinare se il comportamento di queste sonde è sufficientemente coerenza in modo che i risultati sono affidabili.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eseguire in tempo reale qPCR il RNA isolato17 in campioni raccolti per analizzare i geni rapidamente decadente, come c-Myc e un gene lentamente decadente come GAPDH, conquistare la fiducia quello deperimento di trascrizione tariffe sono state rilevate con precisione. Nota: Per ulteriore conferma, isoforma-specifici in tempo reale qPCR sonde possono essere sviluppati e utilizzati per monitorare l'abbondanza di isoforme specifiche nel tempo21.</li>
</ol>
5.Determinazione costante del tasso di decadimento
<ol>
	<li>Per ogni timepoint, registro-trasformare i valori di abbondanza per ogni trascrizione (gene-specifico o isoforma-specifici). Nota: Log-trasformando i valori convertirà curve di decadimento esponenziale alle linee che possono essere in forma con un decadimento lineare modello22.</li>
	<li>Misura il profilo di espressione per ogni trascrizione (gene-specifico o isoforma-specifici) per un modello di decadimento lineare. La formula di tale modello è f (t) = C - r * t. In questa equazione, C è una costante che rappresenta l'importo di partenza di una trascrizione, r è il tasso di declino e t è il tempo dall'inizio dell'esperimento. Da questa equazione, determinare il tasso di decadimento come r*ln(10) (Vedi riferimento11). Nota: Il pacchetto di software di maSigPro è un approccio basato su regressione progettato per rilevare differenze di profilo di espressione gene significativo nel tempo corso dati23. Codice di esempio e i risultati per maSigPro sono disponibili presso: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.</li>
	<li>Filtrare i geni che non riescono a montare un modello log-lineare decadimento. Questa operazione può essere eseguita con un test ANOVA F. Nota: il test F si basa sulla statistica F, che è definita come la variazione tra campioni si intende diviso per la variazione all'interno di campioni. Correggere i valori di p per i confronti multipli applicando il lineare step-up Benjamini e Hochberg falsi scoperta procedura24. Un q-valore maggiore di 0,05 con il F-test può essere utilizzato come un cut-off per i geni che non riescono a montare un modello log-lineare decadimento.</li>
	<li>Eseguire un test ANOVA F per determinare le trascrizioni con un termine di interazione significativa tra una condizione di ciclo cellulare categorico e tempo (tasso di falsi scoperta, FDR &#60; 0.05).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+reveals+multiple+pathways+for+unique+regulation+of+mRNA+decay+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).</li><li>Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. 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E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+mRNA+decay:+methodologies,+pathways,+and+links+to+other+stages+of+gene+expression.">Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression.</a> J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).</li><li>Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+half-life+measurements+in+mammalian+cells.">Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells.</a> Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).</li><li>Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+diversifies+post-transcriptional+regulation+by+selective+RNA-protein+interactions.">Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions.</a> Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).</li><li>Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+isoform+half-lives+reveals+stabilizing+and+destabilizing+elements+in+yeast.">Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast.</a> Cell. 156 (4), 812-824 (2014).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay.">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).</li><li>Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells.">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li><li>Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+dynamics+of+microRNAs+revealed+by+a+novel+pulse-chase+approach.">Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach.</a> Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.

Quiescenza può essere indotta da segnali esterni, tra cui il ritiro di mitogeni o del siero, la mancanza di adesione cellulare e l'inibizione del contatto. Inibizione da contatto, uno dei più possibili metodi per indurre la quiescenza, è un processo altamente evolutivamente conservato in cui cellule uscire il ciclo proliferativo cellulare in risposta al contatto della cellula--cellula. Qui ci concentriamo sulla inibizione da contatto come un esempio di un metodo per indurre la quiescenza. Gli studi precedenti hanno se...

Livelli allo stato stazionario di trascrizioni riflettono il contributo di sintesi di trascrizione e di decadimento di trascrizione. Regolato e coordinato trascrizione decadimento è un importante meccanismo per il controllo dei processi biologici1,2,3,4. Ad esempio, tassi di decadimento di trascrizione hanno dimostrati di contribuire per la serie temporale di eventi che seguono l'attivazione dalla citochina infiammatoria fattore di necrosi tumorale5.
Precedentemente abbiamo indicato che la transizione tra proliferazione e quiescenza in fibroblasti umani primari è associata con i cambiamenti dei livelli di trascrizione di molti geni6. Alcuni di questi cambiamenti riflettono le differenze nell'attività dei fattori di trascrizione tra questi due Stati.
Cambiamenti nel tasso di decadimento di una trascrizione possono anche contribuire ai cambiamenti del livello di espressione di un trascritto in due diversi stati7,8. Basato sui nostri risultati precedenti che la transizione tra proliferazione e quiescenza è associata con i cambiamenti nei livelli di più microRNA9, abbiamo chiesto se c'è anche un contributo dal decadimento di differenziale trascrizione nei cambiamenti espressione genica in proliferazione contro fibroblasti quiescenti.
Al fine di monitorare la stabilità di trascrizione, abbiamo determinato il tasso di decadimento delle trascrizioni genoma in proliferazione contro cellule quiescenti. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo monitorato tassi di decadimento in proliferazione contro fibroblasti quiescenti introducendo un inibitore della trascrizione nuovo e monitoraggio della frequenza in cui singole trascrizioni scomparse nel tempo. Il vantaggio di questo approccio è che, rispetto ai metodi che consentono di monitorare semplicemente espressione genica globale, inibendo la sintesi di nuova trascrizione, saremo in grado di determinare il tasso di decadimento per queste trascrizioni separatamente dal prezzo al quale sono trascritti.
ActD trattamento per inibire la trascrizione di nuovo e determinare i tassi di decadimento di trascrizione è applicato con successo in molteplici studi precedenti. ActD è stato usato per sezionare l'importanza della stabilità di RNA nei cambiamenti in abbondanza di trascrizione che derivano dal trattamento con citochine pro-infiammatorie5. Un approccio simile è stato utilizzato anche per sezionare le differenze nel tasso di decadimento di trascrizione in proliferazione contro cellule C2C12 differenziate come essi adottano un muscolo differenziato fenotipo10. Come altro esempio, global mRNA emivite inoltre sono state rilevate in pluripotenti e cellule staminali embrionali del mouse differenziato11. In questi esempi, la degradazione del mRNA ha dimostrato di essere importante per la regolazione di abbondanza di trascrizione e per la transizione delle cellule agli Stati differenti delle cellule.
Applicare i metodi descritti di seguito, abbiamo scoperto le variazioni nei tassi di decadimento di trascrizione in circa 500 geni quando si confrontano i fibroblasti proliferanti e quiescenti stati12. In particolare, abbiamo scoperto che gli obiettivi del microRNA miR-29, che è downregulated in cellule quiescenti, sono stabilizzati quando le cellule di transizione di quiescenza. Qui descriviamo la metodologia che abbiamo usato per determinare i tassi di decadimento in cellule proliferanti e quiescenti. Questa metodologia è utile per confrontare i tassi di decadimento mRNA globali in due distinti ma simili condizioni quando sono cercati informazioni rapidamente decadente geni. Potrebbe essere utilizzato anche per affrontare altre questioni, quali l'effetto delle condizioni di coltura delle cellule sul decadimento di trascrizione, per esempio, in due dimensioni contro tre culture dimensionale. Tassi di decadimento possono essere determinato genoma con metodi come microarrays o RNA-seq. in alternativa, in tempo reale qPCR o Macchiarsi nordico può essere utilizzato per determinare i tassi di decadimento su base gene di gene o isoforma di isoforma. Queste tariffe quindi possono essere utilizzate per calcolare il tempo di dimezzamento di ciascun gene monitorato e per identificare geni con i tassi di decadimento che sono diversi in due condizioni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:809px;" width="809">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4&#176;C</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Equipment for running agarose gels</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Sterile tissue culture plates and conical tubes</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-118</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">35-010-CV</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:291px;">Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td style="width:237px;">For decontaminating work surfaces from RNase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">2.0 ml eppendorf tubes</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Trypsin-EDTA&#160; Solution 10X</td>
			<td style="width:163px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002-07-07</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:291px;">Sterile PBS</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-250</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Trizol</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15596018</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:163px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1410-2 mg</td>
			<td style="width:237px;">inhibits transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Sterile DMSO</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31-761-00ML</td>
			<td style="width:237px;">solvent for actinomycin D</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN19400225</td>
			<td style="width:237px;">MP Biomedicals, Inc product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2618500</td>
			<td style="width:237px;">molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ethanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP28184</td>
			<td style="width:237px;">molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution)</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0551</td>
			<td style="width:237px;">carrier for RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:291px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1907</td>
			<td style="width:237px;">removes DNA with DNase, then, in a subsequent step,&#160; inactivates DNA and removes divalent cations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Agarose</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN820721</td>
			<td style="width:237px;">MP Biomedicals, Inc product</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Loading dye for RNA gel</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0641</td>
			<td style="width:237px;">suitable even for denaturing electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Millenium RNA markers</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM7150</td>
			<td style="width:237px;">RNA ladder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">One-color RNA Spike-in Kit</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technology</td>
			<td style="width:119px;">5188-5282</td>
			<td style="width:237px;">Example spike-in control for Agient microarray analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Tris base</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td style="width:237px;">molecular biology grade, for TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A38-500</td>
			<td style="width:237px;">for TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">EDTA</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td style="width:237px;">electrophoresis grade, for gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:163px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td style="width:237px;">for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4456740</td>
			<td style="width:237px;">Spike-in control for RNA Seq</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">RS-122-2101</td>
			<td style="width:237px;">for RNA Seq</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">96-well 0.3 ml PCR plate</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AB-0600</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Microseal B adhesive seals</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MSB1001</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89094-662</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM12230</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">SuperScript Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18090010</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining genome-wide transcript decay rates in proliferating and quiescent human fibroblasts

Quiescenza è uno stato temporaneo, reversibile, in cui le cellule hanno cessato la divisione cellulare, ma conservano la capacità di proliferare. Gli studi multipli, compreso il nostro, hanno dimostrato che la quiescenza è associato con diffuse cambiamenti nell'espressione genica. Alcuni di questi cambiamenti si verificano attraverso i cambiamenti nel livello o attività di fattori di trascrizione associati a proliferazione, come E2F e MYC. Abbiamo dimostrato che la degradazione del mRNA può anche contribuire a cambiamenti nell'espressione genica tra cellule proliferanti e quiescenti. In questo protocollo, descriviamo la procedura per stabilire la proliferazione e quiescenti colture di fibroblasti cutanei umani del prepuzio. Descriviamo quindi le procedure per l'inibizione di nuova trascrizione nelle cellule proliferanti e quiescenti con actinomicina D (ActD). ActD trattamento rappresenta un approccio semplice e riproducibile per dissociare nuova trascrizione dal decadimento di trascrizione. Uno svantaggio di ActD trattamento è che il corso di tempo deve essere limitato a un breve lasso di tempo perché ActD colpisce la vitalità cellulare. Livelli della trascrizione sono monitorati nel tempo per determinare i tassi di decadimento di trascrizione. Questa procedura permette l'identificazione di geni e isoforme che presentano decadimento differenziale in proliferazione contro fibroblasti quiescenti.

Precedentemente abbiamo riferito i risultati delle analisi di microarray dei tassi di decadimento di trascrizione in fibroblasti umani primari proliferanti e inibito a contatto sopra un corso di 8 ore tempo12. Una lista di geni con un significativo cambiamento nella stabilità di trascrizione confrontando fibroblasti proliferanti e contatto-inibito è fornita nella tabella supplementare 1. Le intensità di fluorescenza in tempo zero e sopra un cors...

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Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Descriviamo un protocollo per la generazione di proliferazione e fibroblasti cutanei umani primari quiescenti, monitoraggio tassi di decadimento di trascrizione e l'individuazione di geni differenzialmente decadente.

Determinazione dei tassi di decadimento di trascrizione del genoma in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

determining-genome-wide-transcript-decay-rates-proliferating

Research

JoVE Journal

Genetics

6.1K Views.  University of California, Los Angeles. Descriviamo un protocollo per la generazione di proliferazione e fibroblasti cutanei umani primari quiescenti, monitoraggio tassi di decadimento di trascrizione e l'individuazione di geni differenzialmente decadente.

Video: Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

siRNA Transfection e l&#39;EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Ricerca

Genetica

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell&#39;ormone in colture cellulari primarie umane

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Generazione di Genome-wide cromatina conformazione cattura librerie da strettamente in fasi precoce embrioni della drosofila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotore cattura Ciao-c: Ad alta risoluzione, Genome-wide profilatura delle interazioni del promotore

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Determinare il tasso di fertilizzazione dell'uovo di Bemisia tabaci utilizzando una tecnica citogenetica

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

Isolamento dei fibroblasti papillari e reticolari dalla pelle umana mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Determinazione dei tassi di decadimento di trascrizione del genoma in fibroblasti umani proliferanti e quiescenti

Riepilogo

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siRNA Transfection e l'EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell'ormone in colture cellulari primarie umane