그래서 우리의 모형은 1 차적인 배양및 그들의 생리적 및 병리학 조건에 있는 폐포 상피 세포에 있는 특정 전사체의 전사 후 변조의 연구를 허용합니다. 따라서 1차 폐포 상피 세포의 일시적인 전환은 세포 생리학 및 신진 대사에 최소한의 영향을 미치며, 이는 전사 억제제를 사용하여 고전적인 프로토콜에 비해 명확한 이점을 제공합니다. 관심 있는 유전자를 발현하는 응답 플라스미드의 생성을 위해, 유도성 벡터의 서열 및 다중 복제 부위를 분석하여 유전자내에 내부적으로 존재하지 않는 다중 복제 부위에서 인식 서열을 식별하도록 분석되어야 한다.
높은 충실도 taq 폴리머라제 및 표준 중첩 PCR 기술을 사용하여 디자이너 프라이머를 사용하여 두 개의 선택된 제한 효소 인식 사이트와 관심 있는 유전자를 측면. 관심 있는 유전자의 V5 에피토프 상류를 코딩하는 서열은 내인성 발현으로부터 전감염된 유전자의 발현을 구별하기 위해 포함되어야 한다. 돌연변이는 번역되지 않은 영역의 3개의 주요 끝을 점진적으로 삭제하는 폴리아데닐레이션 부위를 코딩하는 역프라이머를 사용하여 유전자의 mRNA의 안정성에 대한 상이한 3개의 주요 번역되지 않은 영역의 효과를 연구하기 위해 순차적 결실에 의해 생성될 수 있다.
궁극적으로, 관심 있는 유전자의 삽입은 제한 분석에 의해 확인될 수 있다. 유전자 방향 및 rtPCR 도중 잠재적으로 소개된 돌연변이의 부재는 시퀀싱에 의해 확인될 수 있습니다. 1차 쥐 폐 형 2형 폐피상피세포의 트랜스포핑을 위해, 완전한 최소 필수 배지가 있는 100밀리미터 페트리 접시에서 100밀리미터 페트리 접시에서 10~6세포로 세포를 1회 10회 10시에 종자한다.
습도가 있는 이산화탄소 5%에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 새로운 12 웰 플레이트의 각 우물에 항생제없이 완전한 매체의 500 마이크로 리터를 추가하고 30 분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 미리 데워. 이 잠복식 동안, 응답 플라스미드의 마이크로그램 1개와 조절 벡터 1마이크로그램을 웰당 1.5 밀리리터 튜브에 추가한다.
칼슘이나 마그네슘없이 37섭씨 PBS의 우물 당 10 밀리리터로 폐포 상피 세포를 세척하고 세포 배양 인큐베이터에서 2 ~4 분 동안 섭씨 37도 당 5 밀리리터로 세포를 치료하십시오. 세포가 분리되면 항생제없이 완전한 배지의 웰 당 10 밀리리터로 트립신을 중화시키고 새로운 50 밀리리터 튜브로 세포를 수집합니다. 신선한 배지의 4 밀리리터로 접시를 씻어 나머지 세포와 퇴적물을 원심분리에 의해 세포를 수집합니다.
계산및 원심분리세포를 위해 PBS의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 분리합니다. 재서스펜션 버퍼의 밀리리터 당 7번째 세포에 4회 10번의 밀도로 펠릿을 재중단하고 부드러운 혼합을 가진 플라스미드 및 벡터의 각 튜브에 제5 세포에 4회 10번을 추가한다. 전기 기화 장치에 하나의 튜브를 놓고 전해질 버퍼의 3.5 밀리리터로 튜브를 채웁니다.
피스톤을 완전히 우울하게 하여 금도금 전극 팁을 파이펫에 삽입하고 튜브 내용기를 부드럽게 섞습니다. 조심스럽게 파이펫으로 세포를 흡인하고 클릭 소리가 들릴 때까지 전기 기공 스테이션에 파이펫을 삽입합니다. 폐포 상피 세포에 적합한 전기 기립 프로토콜을 선택하고 터치 스크린에서 시작을 누릅니다.
배분 직후, 파이펫을 제거하고 세포를 미리 데운 12웰 플레이트의 우물로 옮킨다. 모든 세포가 전극 및 도금되었을 때, 2 일 후에 항생제로 완전한 배지로 각 우물의 상체를 대체하는 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 형광 현미경 또는 유동 세포측정에 의해 관찰된 EGFP의 발현에 의해 형광의 성공은 대조군 벡터를 이용하여 확인할 수 있다.
관심 있는 유전자의 전사를 억제하기 위해, 72시간 후 형질전환은 새로 준비된 아옥시사이클린의 밀리리터 당 1마이크로그램으로 보충된 완전한 매체의 웰당 1밀리리터로 대체한다. 관심 있는 유전자의 mRNA 반감기를 평가하기 위하여는, 15 분에서 6 시간 까지 세포 배양 인큐베이터로 판을 반환합니다. 시판되는 페놀 클로로폼 RNA 추출 키트에서 500 마이크로리터의 용액 버퍼로 세포를 리싱하기 전에 얼음 차가운 PBS 1 밀리리터로 잘 세척하고 각 실험 시점에서 부드러운 흔들림을 제공합니다.
이어서, 키트 지침에 따라 RNA를 분리하고 230, 260 및 280 나노미터에서 분광측법에 의한 RNA 수율 및 순도를 결정한다. 격리된 RNA의 안정성을 결정하기 위하여는, 먼저 어떤 플라스미드 DNA 흔적을 제거하기 위하여 RNase 무료 DNase를 가진 각 견본에서 총 RNA의 1개의 마이크로그램을 취급합니다. 제조 업체의 지시에 따라 DNA고갈기 총 RNA를 cDNA로 전사하는 역전사 효율을 향상시키기 위해 올리고 dT 및 임의의 hexomer 프라이머의 혼합과 함께 시판가능한 cDNA 합성 키트를 사용합니다.
분자 생물학 등급 물 180마이크로리터를 반응 혼합물의 20마이크로리터에 첨가하여 마이크로리터 농도당 5나노그램으로 cDNA 반응을 희석시키고, 마이크로리터 농도당 1.25 나노그램에 도달하기 위해 신선한 분자 생물학 등급물과 cDNA 믹스를 즉시 희석시한다. 5개의 마이크로리터와 분자 생물학 급수0.1 마이크로리터, 7.5 마이크로몰러 포워드 프라이머의 0.45 마이크로리터, 7.5 마이크로몰러 역프라이머의 0.45 마이크로리터, cDNA의 마이크로리터 당 1.25 나노그램의 4개의 마이크로리터를 결합하여 총 10마이크로리터의 반응량을 얻을 수 있습니다. qPCR 써모사이클러에 샘플을 배치하고 QPCR 조건을 사용하여 관심 있는 V5 태그 유전자를 증폭시키고 고해상도 용융 곡선을 생성하여 원하는 앰플리콘의 특정 용융 온도를 평가하고 노이즈 앰플턴 피크의 부재를 보장한다.
이 파이펫 전기 기화 기술은 형광 현미경 및 유동 세포측정에 의해 검출된 EGFP 세포의 비율에 의해 관찰된 바와 같이 25~ 30%의 경질 효율 속도를 용이하게 한다. 독시사이클린의 밀리리터당 1마이크로그램을 함유한 폐포 상피 세포의 치료는 치료 기간 동안 언제든지 내인성 알파 ENaC mRNA의 발현에 큰 영향을 미치지 않는다. 입증된 바와 같이 전사적으로 제어된 플라스미드 발현 시스템을 사용하여, V5 알파 ENaC 신호는 이중 델타 정량화 주기 방법을 사용하여 트랜스페션의 효율을 결정하기 위해 테트라사이클린 트랜스액티바이터 고급 신호에 따라 정규화될 수 있다.
알파 ENaC mRNA의 반감기는 actinomycin D의 존재에 비해 테트라 사이클린 오프 시스템의 존재에서 최대 7 배 짧아, actinomycin D는 관절 알파 ENaC mRNA 안정화에 이르게 것을 확인. 또한, 사이클로헥사미드 및 종양 괴사 인자 알파 치료는 리포폴리사카라이드가 그렇지 않으면 서술체의 안정성을 현저히 감소시킨다. V5 알파 ENaC mRNA 안정성의 변조에 있어 유의한 변화는 3개의 주요 번역되지 않은 영역의 삭제 및 포함 된 영역에 따라 유도 될 수 있다.
또한, 특정 RNA 결합 단백질의 과잉 발현은 빈 pcDNA 3플라스미드를 통한 트랜스포이션에 비해 5알파 ENaC mRNA의 안정성을 감소시킨다. 이 도구는 폐포 상피의 기능과 생리적 또는 병리학적 조건에 관여하는 주요 유전자의 전사 후 조절에 대한 새로운 통찰력을 쿼리하는 데 유용할 것입니다.
