우리는 실험 재료 준비에서 그녀의 지원을 Gauri Datta 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 베티 Wittler과 제임스만 원고의 중요 한 검토를 위해 감사입니다. 이 작품은 NSF 보조금 DBI-1049341 인 m c B-1143813에 의해 지원 되었다.

1. Skoog (MS)와 村 重 매체 x 1의 준비 <ol><li>추가 4.31 g 10 g 자당 기저 소금 혼합물 MS, 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic의 0.5 g의 산 (MES) 증류수와 해산 저 어 0.8 L를 포함 하는 비 커. 확인 하 고 1m 수산화 칼륨 (KOH)를 사용 하 여 5.7에 pH를 조정. 1 수 있도록 증류수를 추가 L.</li>
	<li>1 L 병, 500ml 각 미디어를 나눕니다. 각 병에의 한 천 5 g을 추가 합니다. 뚜껑을 느슨하게 유지.</li>
	<li>121 ° C, 병에 자기 볶음 바 15 psi에서 20 분 압력솥.</li>
	<li>압력가 마로 소독, 후 병 낮은 속도로 저 어 접시에 놓고 (때까지 병 맨 손으로 개최 될 수 있습니다) 45-50 ° C에 냉각 MS 매체 허용.</li>
	<li>층 류 두건에 있는 메 마른 조건에서 모든 단계를 수행 하는이 단계에서 시작 하십시오. 500 µ L를 추가 Gamborg &#39; s 각 병을 균일 하 게 배포 비타민 솔루션 MS 매체를 저 어 비타민 솔루션.</li>
	<li>약 접시의 깊이의 절반을 커버 하는 접시로 충분 한 미디어를 부 어.</li>
	<li>허용을 공고히 한 천 수 있도록 약 1 시간에 대 한 실 온에서 냉각 판. 
	참고: 경우 판 하지 즉시 사용할 수, 플라스틱에 그들을 포장 하 고 4 ° C (냉장고 온도)에서 저장 합니다. 커버 플레이트, 상자, 또는 응고 한 튜브를 밀폐 용기에 4 ° C에서 몇 주 동안 저장 될 수 있다.</li>
</ol> 2. 살 균 표 백제와 애기 씨의 <ol><li>섹션 1 프로토콜의 준비는 MS 판. MS 미디어로 동시에 증류수 100 mL 압력솥. 사용 하 여이 나중에 린스 물과 씨앗을 중단할 수 있도록 도금에 도움. 
	참고: 원하는 경우 0.8 %agar 블렌드 (w/v) (예: phytagar) 또한 수 압력가 마로 소독이 단계에서. 한 천 혼합 도금 동안 증류수에 대 한 교체 될 수 있습니다 (단계 2.5.3.). 한 혼합의 추가 점도 쉽게 접시 또는 공장에 공간 씨 행에 필요한 경우.</li>
	<li>준비 50% (v/v) 씨앗을 살 균 하는 데 사용할 솔루션을 표 백제. 표 백제를 희석, 백제의 100 mL 증류수 100 mL를 추가 합니다. 50 µ L 트윈 20 세제의 표 백제 솔루션에 추가. 
	참고: 준비 표 백제 솔루션에 대 한 저장 될 수 있다 그것은 단지 무 균 조건에서 열로 한 달에 최대.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브에 aliquot 100 씨.</li>
	<li>50% 표 백제 솔루션을 사용 하 여 씨앗 소독.
	<ol><li>층 류 두건에 추가 50% 표 백제 솔루션의 500 µ L 씨를 포함 하는 microcentrifuge 튜브. 표 백제 솔루션에서 씨앗을 중단 튜브의 아래쪽을 누릅니다. 
		참고: 또는, 회전 또는 플랫폼 통 사용할 수 있습니다 중단 씨앗을 유지.</li>
	</ol></li> <li>튜브에서 표 백제 솔루션을 씻어 내어 주세요.
	<ol><li>10 분 후에 피 펫 또는 끝에 피 펫 팁을 장착 한 흡 인기를 사용 하 여 microcentrifuge 튜브에서 표 백제 솔루션 제거.</li>
		<li>추가 500 µ L의 무 균 튜브에 증류수. 튜브를 닫고 혼합을 반전 합니다. 씨앗은 튜브의 하단에 정착을 허용 합니다. 일단 씨앗 신중 하 게 튜브의 하단에 정착 pipetting으로 표 백제 솔루션을 제거 합니다. 반복이 6 번 과정을 rinsing.</li>
		<li>씨앗 중단 튜브에 압력가 증류수 1 mL을 추가.</li>
	</ol></li> <li>MS 접시에 소독된 씨앗 판.
	<ol><li>층 흐름 후드에서 재고 이름과 현재 날짜와 MS 판의 하단 라벨.</li>
		<li>MS 플레이트에 microcentrifuge 튜브에서 씨앗을 부 어. 멸 균, 일회용 inoculating 루프 또는 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 MS 플레이트 주위 씨앗을 확산. 
		참고: 지금까지 씨앗 행에 뿌려 져야 하는, 경우에 200 µ L 팁 피펫은 개별적으로 원하는 위치에 씨앗을 배치 하 사용할 수 있습니다. 씨앗의 흐름을 개선 하기 위해, 피 펫 팁의 끝 3-5 m가 위를 사용 하 여 트리밍 수 있습니다. 어떤 잘못된 씨앗이 나 씨앗의 클러스터 다음 위치를 변경할 수 또는 멸 균 일회용 inoculating 루프를 사용 하 여 분리.</li>
		<li>배치 MS 격판덮개의 뒤에 층 류 두건 절반 닫힌 뚜껑의. MS 판에서 증발을 초과 하는 물을 허용.</li>
		<li>MS 접시에 뚜껑을 배치. 인감 외과 미소 한 구멍이 있는 종이 접시를 포장 하 여 MS 판 테이프 (재료의 표 참조).</li>
	</ol></li></ol> 3. 염소 가스와 애기 씨의 살 균 <ol><li>섹션 1 프로토콜의 준비는 MS 판. 압력솥 MS 미디어; 동시에 증류수 100 mL 이 나중 도금에 도움 씨앗을 일시 중단 하려면 사용 됩니다. 
	참고: 원하는 경우 0.8 %agar 블렌드 (w/v) (예: phytagar) 또한 수 압력가 마로 소독이 단계에서. 한 천 혼합 도금 동안 증류수에 대 한 교체 될 수 있습니다 (단계 3.6.2.). 한 혼합의 추가 점도 쉽게 접시 또는 공장에 공간 씨 행에 필요한 경우.</li>
	<li>시작 하기 전에 살 균, 염소 가스를 생산 하는 데 필요한 표 백제 및 염 산 (HCl)의 양을 계산.
	<ol><li>6.1% Cl 2 살 균을 위한 필요를 생산 하기 위해 필요한 HCl의 양을 계산.</li>
		<li>다음 수식을 사용 하 여: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg" /> 6.1% Cl 2;로 살 균 컨테이너의 볼륨으로 7000 mL와 HCl의 볼륨은 계산 3 mL. 
		참고: 컨테이너 및 % Cl 2의 다른 볼륨에 대 한 계산을 수행 하는 프로그램 스프레드시트 추가 표 1로 제공 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>0.5 mL microcentrifuge 튜브에 aliquot 100 씨앗. 각 유리병의 뚜껑을 닫고, 튜브에 플라스틱 랙 하 고 따로 설정. 
	참고: 씨앗 만큼 그들은 적절 한 조건에 저장 된이 시점에서 시간의 오랜된 기간 동안 저장할 수 있습니다. 저장 조건 Rivero, 동료 4 섹션 3.3.2 프로토콜의에서 찾을 수 있습니다. 96 잘 접시 포맷을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>염소 가스 살 균을 수행 하는 데 필요한 자료를 준비.
	<ol><li>표 백제와 HCl 저장소 위치에서 얻기.</li>
		<li>대형 파라핀의 스트립 영화 (재료의 표 참조) 단계 3.5.3에서에서 사용 하는 컷. 살 균 컨테이너를 봉인 하.</li>
		<li>있는 살 균 열린다 증기 두건 안쪽 뚜껑을 가진 플라스틱 컨테이너를 놓습니다. 모든 씨앗 튜브에 열고 플라스틱 컨테이너 안에 전체 씨앗 랙 배치.</li>
	</ol></li> <li>수행 상 온에서 염소 가스 살 균. 
	주의: 표 백제와 산 별도로 작동 합니다. 유출의 위험을 줄이기 위해 세척제 중 병을 두지 마십시오. 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) 장갑과 실험실 외 투를 포함 하 여 사용 합니다. 표 백제 또는 산 장갑에 밝아진, 다른 자료를 취급 하기 전에 장갑을 변경 합니다. 항상 장갑의 경우에 표 백제 또는 산 오염 증기 두건에서 제거.
	<ol><li>컨테이너 안에 250 mL 비 커를 배치 하 고 백제의 100ml 추가. 
		참고: 표 백제와 HCl 사이의 반응 백제의 적어도 22 볼륨 초과를 필요합니다. 반응은 HCl을 사용 하 고 부산물으로 염화 나트륨 (NaCl)와 물 Cl 2 가스를 방출 하 여 표 백제. 블리치의 큰 과잉을 사용 하면 추가 HCl d의 소비uring 나트륨 중 탄산염 (NaHCO 3) 양이 감소 배기 기간 처리를 위한 솔루션을 무력화 하는 데 필요한. 
		주의: 비 커 표 백제 + HCl의 총 액체 볼륨을 두 번 이상 이어야 한다. 그러면 씨앗 손상, 옷, 표 백제 또는 노출 된 피부를 구울 수 있는 다음 단계는 비 커를 탈출 밝아진.</li>
		<li>표 백제를 포함 하는 비이 커에 HCl 3 mL을 추가. 
		주의: 초기 반응 가스 농도 보다 높은 6.1%에서 특히 거품을 생산할 예정 이다. 긴 팔 랩 코트는이 단계에 대 한 필요.</li>
		<li>살 균 컨테이너를 닫고 즉시 파라핀 영화와 함께 인감.</li>
		<li>가스 축적 되도록 살 균 시간 동안 살 균 컨테이너 모니터링, 염소 가스의 축적은 컨테이너 안의 희미 한 노란색 연 무로 표시 되어야 합니다. 
		주의: 정기적으로 확인 하는 내부 압력 뚜껑 대통령직 하지는 보장 하기 위해 살 균 컨테이너 또는 파라핀 영화. 뚜껑 unseated 왔다 또는 파라핀 영화 느슨한 왔다, 뚜껑 닫고 파라핀 영화의 추가 층으로 컨테이너를 신중 하 게 포장.</li>
		<li>1 후 h-살 균 기간, 파라핀 필름을 제거 하 고 한 모서리에 뚜껑을 열고 여 컨테이너를 엽니다. 3 h 반응 완료 하 고 염소 가스 제거를 위한 환기 컨테이너 허용.</li>
		<li>닫고는 모든 microcentrifuge 튜브의 씨앗 랙에 모자. 
		참고: 멸 균된 씨는 건조 상태에서 저장으로 도금의 시간까지 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>시드 랙 제거 하 고 층 류 두건에.</li>
		<li>염소 가스 반응 <ol><li>추가 1.5 g NaHCO 3 분말 표 백제/HCl 솔루션을 포함 하는 비이 커에 천천히 중화 고 NaHCO 3 솔루션으로 분해 하는 유리 막대와 저 어. NaHCO 3 때까지 계속 추가 이산화탄소 (CO 2) 가스 거품 형성 중지. 
			주의: 천천히 밝아진을 방지 하기 위해 추가 합니다. 장갑 및 실험실 외 투를 포함 하 여 적절 한 보호구를 사용 하 여.</li>
			<li>산도 스트립 또는 pH 미터를 사용 하 여 솔루션의 산도 테스트 합니다. 솔루션의 pH까지 필요한 중립 이면 추가 NaHCO 3 추가 (pH 7.0). 솔루션을 증기 두건에서 제거 하 고 모든 적용 가능한 처리 지침에 따라 폐기 수 있습니다이 시점에서. 
			주의: 처리 하는 동안 어떤 냄새를 발견 하는 경우 다음 솔루션 즉시에 반환 되어야 증기 두건.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>MS 접시에 소독된 씨앗 판.
	<ol><li>층 흐름 후드에서 재고 이름과 현재 날짜와 MS 판의 하단 라벨.</li>
		<li>추가 500 µ L 씨를 일시 중단 하려면 각 microcentrifuge 튜브에 멸 균된 증류수의. MS 판에 씨앗을 부 어 하 고 멸 균, 일회용 inoculating 루프 또는 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 접시 주위에 균등 하 게 씨앗을 확산.</li>
		<li>배치 MS 격판덮개의 뒤에 층 류 두건 절반 닫힌 뚜껑의. MS 판에서 증발을 초과 하는 물을 허용.</li>
		<li>MS 접시에 뚜껑을 배치. 미소 한 구멍이 있는 종이 수술 테이프와 플레이트를 포장 하 여 MS 접시를 봉인.</li>
	</ol></li></ol> 4. MS 판에 애기의 성장 <ol><li>4 ˚C와 주위 습도에서 3 일 동안 위에 뚜껑 접시를 놓습니다. 
	참고:이 프로세스 계층 이라고 하 고 개별 씨앗의 발 아를 동기화 하는 역할.</li>
	<li>성장 환경에 격판덮개 전송.
	<ol>23 ° C에서 유지 온도 빛의 강도 120-150 µ / m 2 s 16 h 빛 / 8 h 어두운 <li>photoperiod. 뿌리 성장 매체에 접시 위에 뚜껑 성장 환경에 평면 배치.</li>
	</ol></li> <li>접시에 모 종 8 일 동안 성장 하자. 
	참고: 8 주 성장 기간 늦게 발 아 씨앗을 출 수 있습니다. 모든 씨는 출 아 했다 경우 접시 8 일 보다 빨리 득점 될 수 있습니다.</li>
	<li>발 아 속도 점수.
	<li>레코드 수가 씨를 출 아 했다 그리고 그가 안 출 아 했다 <ol>. 출 아 했다 종자의 수를 분할 하 여 발 아 율을 계산 판에 씨앗의 총 수. 
		주: 발 아는 radicle 씨 코트 밖에 서 예상은 하 고 두 cotyledons 표시 계산 됩니다.</li>
		<li>종자 살 균 조건의 효과 결정 하는 형에 의해 영향을의 수를 계산 하는 또한.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis: a laboratory manual. , (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>The Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana."> Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+analysis+of+transcriptional+activity+in+the+Arabidopsis+genome.">Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome.</a> Science. 302 (5646), 842-846 (2003).</li><li>Alonso, J. 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저자는 공개 없다.

메 마른 매체에 애기 씨, 성장 하는 때 살 균의 일종이 적용 되어야 한다. 표 백제와 염소 가스 살 균 치료 결과 비슷한 발 아 율 및 금형 성장 저해. 어느 살 균 방법 잠재적인; 높은 발 아 씨앗 발 아 율에 상당한 감소를 발생 그러나, 표 백제 살 균 것이 좋습니다 줄 때문에 소형, 낮은 발 아 가능성 (20-70%), 비-중요 한, 발 아 율 향상 (그림 3A) 가스 살 균에 비해 이기는 하지만.
애기 씨 최대 10 분 동안 40-100%에서 표 백제 농도와 살 균 만족 발 아 비율 및 효과적인 몰드 억제를 제공 한다. 비록 40% 미만 표 백제 농도 40%의 농도 또는 제비 조차 무 겁 게 오염 된 씨앗의 높은 보장 효과적인 살 균을 사용 하 여 대부분 씨앗 많은 대 한 적절 한 살 균을 제공. 그것은 살 균의 10 분을 초과 하는 표 백제 농도 동등한을 사용 하는 경우 중요 또는 높은 씨 사망률과 종묘 개발에 결함을 피하기 위해 80% 보다 더 높은.
6.1% 나 높은 발 아 속도 적절 한 금형 제거에 1 h 결과 16.5%의 염소 가스 농도와 애기 씨를 치료. 살 균 3 h의 기간을 증가 시켜 낮은 염소 가스 농도 (2.1%)을 성공적으로 사용할 수 있습니다.
몇 줄 소독 될 필요가 있다, 10 분에 대 한 50% 표 백제의 솔루션에 액체 살 균 것이 좋습니다. 라인의 큰 숫자, 1 h 6.1%의 가스 농도와 살 균 가스 때문에 많은 라인 수 멸 균 수 신속 하 고 쉽게 적은 조작으로 더 나은 옵션입니다.
우리의 결과 다른 genotypes의 씨앗의 많은 수와 잠재적인 낮은 발 아 된 씨앗을 살 균에 대 한 표준화 조건을 제공 합니다. 이러한 살 균 기술에 대 한 유일한 제한은 그들이 씨앗 발 아 률 광범위 한 씨 사망으로 인해 20% 미만에 적용할 수 없습니다입니다. 쥡니다17, 살 균의 부재에 발 아 율을 높이기 위해 같은 대체 방법, 이러한 경우에 도움이 될 수 있습니다.

애기 thaliana (애기) 식물 생물학1,,23기초 및 응용 연구에 대 한 주요 모델 생물 이다. 동안 애기 성장에 대 한 표준 조건 잘 설립된4, 씨앗 씨앗 생존에 살 균의 효과 엄격 하 게 테스트 되지. 단단한 미디어 판 또는 상자에 정기적으로 레이어에서 인구, 초기에 촬영 및 루트 고기의 관찰에서에서 homozygous 치명적인 돌연변이의 식별 등 많은 실험적인 응용 프로그램에 대 한 애기 묘의 성장을 촉진 하 사용 단계, 병원 체 자유로운 조직, 많은 양의 묘 종 조직, transformants 또는 약물 내성 식물의 선택과 발 아1,2,3,4의 평가의 컬렉션의 격리 . 온실에서 자란 식물에서 수확 한 씨앗 또는 성장 챔버는 때때로 미생물과 먼지 오염. 메 마른 매체의 종류에 애기 묘의 성장 이전 종자 살 균을 곰 팡이 씨앗 표면에 박테리아 등 미생물 오염 물질을 제거 하 요구 한다. 효과적인 종자 살 균 정권의 사용이 높은 발, 최소 오염, 그리고 활기찬 식물의 성장을의 균형에 대 한 중요 합니다.
애기 씨 살 균을 위해 사용 하는 두 가장 일반적인 방법 상업적인 표 백제 (액체 상)와 염소 가스 (기상)를 기반으로 합니다. 다양 한 절차 두 액체 단계 살 균1,4,5,6,7,,89 고용 되었습니다. , 애기의 10 및 증기 위상 살 균 씨8,10,11,12,13,,1415 16. 그러나,이 절차 사용된 genotypes의 종자 살 균 달성에 효과가 있다, 하는 동안 다른 genotypes의 씨앗에 다른 살 균 처리의 효과 대 한 상세한 분석 되지 보고 되었습니다. 따라서, 이러한 살 균 절차의 최적화 효율적인 살 균 높은 발 아 속도와 결합 하는 조건을 정의 해야 합니다.
애기 생물 자원 센터 (ABRC)는 고유) 테스트의 다양 한 다른 genotypes 씨 생존 컬렉션 및 b) 활용 품질 관리 절차를 내부적으로 적용 및 사용자 피드백에 대응에서 하는 위치 씨 발 아에 대 한. 여기에 제시 된 실험의 목표 범위의 애기 genotypes의 종자 발 아에는 다양 한 살 균 방법의 효과 확인 했다. 최소한의 병원 체 오염 유지 하면서 높은 종자 발 아 율에서을 최적화 된 살 균 절차는 표 백제와 염소 가스 살 균에 대 한 표시 됩니다.

standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds

애기 thaliana (애기) 묘는 종종 메 마른 매체에 성장 될 필요가 있다. 이 사전 종자 소독 씨앗 표면에 오염 물질을 미생물의 성장을 방지 하기 위해 필요 합니다. 현재, 애기 씨는 실험실 사이 다를 약간 하 고 표준화 되지 조건에서 두 가지 살 균 기술을 사용 하 여, 자주 발생 하는 과도 한 씨 사망 또는 유일 하 게 부분적으로 효과적인 살 균에 살 균. 이러한 방법 중 대부분은도 쉽게 확장 가능한 다양 한 genotypes의 씨앗 라인의 다 수 없습니다. 애기의 높은 처리량 분석을 위한 기술 확산을 계속, 다 수 다른 genotypes의 씨앗의 살 균에 대 한 표준화 된 기술을 이러한 유형의 실험 수행을 위한 필수 되고있다. 두 개의 다른 살 균 기술 애기 줄 수의 응답 종자 발 아 율 및 씨앗 오염 미생물와 다른 병원 체의 수준에 따라 평가 했다. 치료 요원과 결합 애기 씨 살 균에 대 한 최적의 조건을 확인 하 여 노출의 시간을 살 균의 다른 농도 포함. 최적화 된 프로토콜 개발 되었으며, 두 가지 다른 살 균 방법: 표 백제 (액체 상)과 염소 (Cl2) 가스 (기상), 둘 다의 결과로 높은 씨앗 발 아 속도 최소한의 미생물 오염. 이러한 프로토콜의 유틸리티 야생 유형 및 돌연변이 씨앗의 발 아 전위의 범위 테스트를 통해 설명 했다. 우리의 결과 씨앗 수 있습니다 효과적으로 살 균 될 과도 한 씨 사망 하지 않고 메서드 중 하나를 사용 하 여 살 균의 해로운 효과와 최적의 발 아 가능성 보다는 더 낮은 씨를 위해 관찰 했다 비록 표시 됩니다. 또한, 방정식 연구원은 다양 한 크기의 밀폐 용기에 표준화 된 염소 가스 살 균 조건을 적용할 수 있도록 개발 되었다. 여기에 설명 된 프로토콜 애기 라인의 많은 수를 위해 쉽게, 효율적이 고 저렴 한 종자 살 균을 수 있습니다.

애기 씨 오픈 필드, 온실 또는 성장 챔버 로부터 수집 때로는 곰 팡이 및 박테리아1,4처럼 다양 한 미생물에 의해 오염. 따라서, 메 마른 매체에 씨를 출 아 특히 도전 수는 접시의 오염으로 인해 씨앗 공급이 제한 하는 경우에 특히. 표 백제와 염소 가스 살 균을 위해, 결과 아래 제공 됩니다, 최적화 된 프로토콜이이 문제를 최소화 하 고 높은 처리 응용 프로그램에 필요한 씨앗의 생존 능력을 유지.
애기 열 0 씨앗의 발 아에 표 백제 살 균의 효과
표 백제는 수많은 식물 종의 살 균 씨에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 에이전트입니다. 노출 시간과 살 균 에이전트의 최적 농도 종 사이 변화 한다. 애기 씨1,,45,6,7,,89 의 살 균을 위해 표 백제를 사용 하 여 여러 프로토콜 고용 되었습니다. , 10. 표 백제 5 다른 노출 시간 기간 테스트와 결과의 4 개의 다른 농도에 선물 된다 그림 1. 치료는 컬럼비아 야생-타입 (열 0) 씨앗에 적용 했다. 표 백제 농도 살 균의 시간 사이 중요 한 상호 작용에 의해 증명으로 Col 0 씨앗의 발 아에 표 백제 농도의 효과 살 균에 따라 다양 한 (그림 1, P &#60; 0.001, ANOVA-분산 분석).
5 그리고 10 분 사이 살 균 시간을 가진 실험에서 모든 표 백제 농도와 치료 열 0 씨앗 (그림 1)의 동등 하 게 높은 발 아 율 귀착되는. 높은 발 아 율 또한 항상 살 균에 대 한 40% 및 50% 가구 표 백제 농도 대 한 관찰 되었다. 80%와 100% 표백 치료 10 분 보다 더 긴 기간 결과 중요 한에 대 한 짧은 몸을 담글 시간에 비해 발 아 비율 감소 (P &#60; 0.01, ANOVA). 또한, 80%와 100 %20 분에 대 한 치료, 표 백제에 대 한 발 아 크게 감소 했다 해당 40%와 50% 표 백제 치료에 비해 (P &#60; 0.001, ANOVA).
씨앗의 표백 및 shriveling 높은 표 백제 농도 15 분 이상 사용 하는 경우 다양 한 수준의 표시. 또한 상대적으로 높은 (최대 32%까지) 씨 사망, 세균된 씨 자주 cotyledons 전개 및 연장, hypocotyls의 실패에 반영 성장 결함을 보여 이러한 조건에서 살 균 개발 체포 결과. 대부분 치료 (14 중에 20)은 완전히 형 무료, 전체 몰드 레벨 평균 0.21% ± 0.003의 (표 1)의 결과로.
50% 표 백제와 몸을 담글 시간 10 분을 치료 하기 때문에 그것은 높은 발 아 비율 함께 표면 병원 체 성장의 좋은 억제 최고의 살 균 정권으로 선정 됐다. 이 치료는 아래 설명 된 대로 다른 돌연변이 라인에 표 백제 살 균의 효과 테스트 선정 됐다.
Col 0 씨앗의 발 아에 염소 가스 살 균의 효과
염소 가스 살 균 조건 최적화, 염소 가스의 3 개의 다른 농도 두 기간 (표 2)에 대 한 열-0 씨앗 소독 하 사용 되었다. 가스 농도 집중된 HCl의 볼륨에 다음과 같은 수식을 사용 하 여 살 균 컨테이너의 볼륨을 기준으로 계산 했다:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
이 방정식은 12.3 M HCl, 23 ° C의 온도, 표준 기 압 101.3 kPa의 가정 이상 기체 법칙을 사용 하 여 파생 되었다.
Col 0 씨앗의 발 아에 염소 가스 농도의 효과 시간과 농도 요인 사이의 중요 한 상호 작용에 의해 표시 된 대로 살 균의 시간에 따라 표시 했다 (그림 2A, P &#60; 0.01, ANOVA) . 염소 가스 농도 1 시간 살 균 대상이 열 0 씨앗의 발 아에 더 큰 영향을 했다. 이 살 균 시간으로 염소 가스의 모든 농도 승진 마찬가지로 85% 이상의 발 아의 높은 수준 (P &#62; 0.05, ANOVA). 다른 한편으로, 3 h 긴 살 균 귀착되 었 다 두 더 낮은 가스 농도와 비교 하는 염소 가스의 최고 농도 대 한 발 아 율에 큰 감소 (P &#60; 0.05, ANOVA). 이 결과 나타냅니다 애기 씨앗 1 h에 대 한 테스트 염소 가스 농도 또는 3 h 16.5% 아래 가스 농도의 치료 때문에 발 아 율은 항상 큰 씨앗 생존을 보존에 동등 하 게 효과적인 보다 82%. 그러나, 16.5% 가스 3 h에 대 한 씨앗을 살 균 했다 씨앗 발 아에 해로운.
금형의 발생률 또한 가스 농도 및 노출 시간에 의존 했다. 1 h 동안 치료에 대 한 염소 가스를 6.1%와 16.5%의 상대적으로 높은 농도 3 h (그림 2B)에 대 한 모든 가스 농도 효과적으로 형 성장을 저해 했다.
1 h (표 2) 6.1%의 가스 농도와 치료 최고의 기상 살 균 조건으로 선정 되었다 높은 발 아 율 (결합 이후 다른 돌연변이 선에 가스 살 균의 효과 테스트 이러한 결과 바탕으로, 85%) 금형 오염 (0.02%)의 매우 낮은 수준.
잠재적인 다른 발 아 씨앗에 표 백제와 염소 가스 살 균의 효과
통계 분석 했다 살 균 방법 발 아 응답 라인의 발 아 가능성에 의존 했다 (그림 3A, P &#60; 0.01, ANOVA). 표 백제도 염소 가스 살 균 높은 발 아 잠재적인 (그룹 4와 5)와 씨앗의 발 아 율 감소. 어느 치료가 했다 최저 발 아와 그룹의 이미 낮은 발 아 율에 영향을잠재력 (그룹 1)입니다. 반면, 염소 가스 살 균 결과 상당한 감소 약 12-18% (P &#60; 0.01, ANOVA) 중간 발 아 가능성 (그룹 2와 3) 종자의 발 아에. 표 백제 살 균 또한 그룹 2의 13% 발 아 속도 감소 하지만 그룹 3의 발 아 율을 감소 하지 않았다. 비록 어떤 발 아 그룹에서 가스 치료 표 백제와 염소 사이의 발 아 속도에 큰 차이 없었다 (그림 3A, P &#62; 0.442, ANOVA), 씨앗 소독 표 백제를 사용 하 여 약간 더 높은 있었나요 모든 발 그룹에 가스 소독 씨앗 보다 발 아 속도입니다.
크게 변경 하는 살 균 처리 (P &#60; 0.001, ANOVA) 씨앗 형 (그림 3B)에 의해 영향을의 %. 적은 금형 성장 귀착되 었 다 두 염소 가스와 표 백제 살 균 (P &#60; 0.05, ANOVA) 아무 살 균에 비해. 어떤 그룹에서 가스와 표 백제 살 균 사이 감지 형 수준에 차이가 없었다 (그림 3B, P &#62; 0.4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
그림 1: 애기 열 0 씨앗의 발 아에 표 백제 농도 살 균의 효과. 값은 수단 ± SD 5 독립 복제 실험에서 얻은입니다. 표 백제 농도의 범위에 대 한 기간을 몸을 담근 채 5 분을 기준으로 상당한 차이 나타냅니다 (P &#60; 0.01, ANOVA). #기간 80%와 40% 및 20 분에 대 한 50% 100% 표 백제 농도의 중요 한 차이 나타냅니다 (P &#60; 0.01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
그림 2: 염소의 효과 가스 농도 살 균 시간 애기 열 0 씨에. (A) 발 아 율 및 (B) 형 수준. 오차 막대 수단 ±를 SD 5 생물학 및 실험의 5 기술 복제에서 가져온 나타냅니다. 편지를 공유 하지 않는 의미는 크게 다른 (P &#60; 0.05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
그림 3: 잠재적인 다른 발 아 씨앗에 표 백제와 염소 가스 살 균의 효과. (A) 발 아 율 및 (B) 형 수준. 100 솔 크 T DNA 라인은 어떤 살 균 제의 부재에 발 아 율으로 정의 잠재적인 그들의 발에 따라 5 개의 그룹으로 분류 했다. 발 아 율에 따라 그룹은 다음과 같습니다: 그룹 1 (0-20%), 그룹 2 (21-50%), 그룹 3 (51-70%), 그룹 4 (71-90%)와 그룹 5 (91-100%). 라인 무작위로 선택 했다 고 그들의 발 아 잠재적인 유전자 형에 의존 하지 않았다. 값은 수단 ± SD 3 개의 독립적인 복제 실험에서 얻은입니다. 각 값 위에 문자 ("a", "ab", "c", 등등) 분류 방법의 통계 그룹을 나타냅니다. 편지를 공유 하지 않는 의미는 크게 다른 (P &#60; 0.05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">살 균 시간 (분)</td>
			<td colspan="4">표 백제 농도 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>2.13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.36%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0.19%</td>
			<td>0.28%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 표 백제 살 균 열-0 씨의 금형 수준.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>표 백제</td>
			<td>HCl</td>
			<td>시간</td>
			<td rowspan="2">% 염소 가스 (Cl2/mol 총 가스 몰)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 염소 (Cl2) 컬럼비아 야생-타입 씨앗 7 L 컨테이너를 사용 하 여 살 균 처리 가스.
보충 표 1: 스프레드 시트 컨테이너 및 % Cl2의 다른 볼륨에 대 한 계산을 수행 하는 프로그램. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table _1.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

애기 씨의 높은 처리 살 균에 대 한 표준화 된 방법

이 연구의 목적은 메 마른 매체에 성장 범위의 애기 genotypes의 종자 발 아에 표 백제와 염소 가스 살 균의 효과 확인 했다. 최적화 된 살 균 프로토콜 제공 만족 스러운 씨 생존 하면서 오염 물질을 미생물의 성장을 방지 하기 위해 개발 되었습니다.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.2K 조회수.  The Ohio State University. 이 연구의 목적은 메 마른 매체에 성장 범위의 애기 genotypes의 종자 발 아에 표 백제와 염소 가스 살 균의 효과 확인 했다. 최적화 된 살 균 프로토콜 제공 만족 스러운 씨 생존 하면서 오염 물질을 미생물의 성장을 방지 하기 위해 개발 되었습니다.

비디오: Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

연구

생물학

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

얼음 총액 : 성장을위한 방법 Arabidopsis높은 처리량 Genotyping을위한 96 - 웰 플레이트에와 토마토 식물

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

의식 쥐의 사구체 여과율의 측정을위한 높은 처리량 방법

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

높은 처리량 응용 프로그램에 대한 성인 Zebrafish의 마음의 복구

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...